Name: MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 배우세요 마우스 Müller 신경교세포를 이용한 일차 배양법으로 microRNA 처리 후 망막 전구세포로의 전환을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

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저자는 Ann Beaton 박사와 모든 실험실 구성원에게 원고에 대한 의견에 감사드립니다. 시애틀의 워싱턴 대학에서 박사 후 교육 기간 동안 MG 일차 문화를 S.G.W.에 선별 도구로 소개 한 Tom Reh, Julia Pollak 및 Russ Taylor 박사에게 특별한 감사를드립니다. 이 연구는 S.G.W.에 대한 엠파이어 이노베이션 프로그램 (EIP) 그랜트와 SUNY Optometry에서 S.G.W.까지의 스타트업 펀드와 National Eye Institute (NEI)에서 S.G.W.에 이르는 R01EY032532 어워드의 지원을 받았습니다.

이 보고서의 결과 중 일부를 포함한 특허는 워싱턴 대학에서 발명가 Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl 및 Thomas A. Reh와 함께 제출했습니다. 이 특허의 제목은 '망막 재생을 자극하는 방법 및 조성물.

이 프로토콜은 miRNAs를 이용한 리프로그래밍 연구를 위해 해리된 마우스 망막으로부터 MG를 성장시키는 방법을 기술한다. 다양한 이전 연구에서 보여지고 확인 된 바와 같이, 이들 배양물에서 발견되는 세포의 대다수 (80 % -90 %)는 MG20,23,24입니다. 이 방법은 매우 강력하고 신뢰할 수있는 기술이며 프로토콜을 올바르게 준수하면 결과를 쉽게 재현 할 수 있습니다21,27. 그러나 문화의 성공적인 성장과 재 프로그래밍 효율성은 다양한 요인에 달려 있습니다.
첫째, 마우스의 나이는 성공적인 세포 성장에 중요한 역할을합니다. 따라서, MG 배양물이 리포터 마우스와 같은 야생형과 유사한 야생형 마우스 또는...

뮐러 글리아교(MG)는 신경망막에서 우세한 신경교세포입니다. 그들은 물과 이온 항상성 유지, 뉴런 영양 공급 및 조직 보호와 같은 중추 신경계의 다른 부위의 다른 아교세포에 비해 유사한 기능을 가지고 있습니다. MG는 또 다른 매혹적인 특징을 가지고 있습니다 : 성숙한 아교 세포이지만 발달 후반 동안 망막 전구 세포 (RPC)에서 발현되는 많은 유전자를 여전히 발현합니다 1,2. 이러한 유사성은 망막 손상 후 어망막에서 자연적으로 발생하는 MG계 신경세포 재생의 원인으로 가정된다3,4. 이 과정 동안, MG는 세포 주기에 다시 들어가고 RPC로 탈분화된 다음, 여섯 가지 유형의 망막 뉴런으로 분화된다. 이 현상은 물고기에서 자연적으로 발생하지만, 포유류 MG는 뉴런 5,6으로 변환되지 않습니다. 그러나 다시 프로그래밍 할 수 있습니다. MG를 RPC / 뉴런으로 재 프로그래밍하는 다양한 요인이 나타났습니다. 이들 인자 중에는 어류 재생 7,8에 관여하는 기본적인 나선-루프-나선 (bHLH) 전사 인자 achaete-scute homolog 1 (Ascl1)이 있다. 마우스에서, Ascl1은 망막 생성 동안 RPC에서만 발현되지만 성숙한 MG 또는 망막 뉴런9에서는 존재하지 않는다.
생체 내에서 세포를 직접 재프로그래밍하는 것은 방법론적으로 어려울 뿐만 아니라 제도적 동물 관리 및 사용 위원회의 승인이 필요합니다. 승인을 받으려면 사용 또는 변경된 요인, 농도, 오프 타겟 효과, 기본 메커니즘, 독성 및 효율성에 대한 예비 데이터가 필요합니다. 세포 배양 시스템은 생체내 모델에서 사용하기 전에 이러한 기준에 대한 테스트를 허용한다. 더욱이, MG는 전체 망막 세포 집단(10)의 약 5%만을 구성하기 때문에, MG 배양은 이동 12,13, 증식14, 부상/손상에 대한 스트레스 반응 15,16, 미세아교세포 17 또는 망막 신경절 세포(RGCs)18과 같은 다른 세포 유형과의 상호작용을 포함하는 그들의 기능(11)뿐만 아니라 그들의 행동에 대한 연구를 허용한다18, 또는 그들의 신경 인성 잠재력 19,20,21. 많은 연구자들은 무제한의 증식 잠재력을 가지고 있으며 쉽게 유지하고 형질 감염 될 수 있기 때문에 불멸의 세포주를 연구에 사용합니다. 그러나 일차 세포는 진정한 세포 특성 (유전자 및 단백질 발현)을 가지고 있기 때문에 불멸화 된 세포보다 생물학적으로 관련된 분석에 바람직하며, 더 중요한 것은 발달의 특정 단계를 나타내며 따라서 "나이"를 갖기 때문입니다. 동물의 나이 (그리고 결과적으로 동물로부터 얻은 세포의 나이)는 발달22의 진행 단계에 따라 세포 가소성이 감소하기 때문에 세포 재 프로그래밍에서 특히 중요한 요소입니다.
이 프로토콜은 재생성을 연구하기 위한 현재의 시험관내 방법으로서 miRNAs로 일차 MG를 재프로그래밍하는 방법을 상세히 기술한다. 이 MG 일차 배양 모델은 P53 녹아웃 마우스(trp53-/- 마우스)23에서 MG의 세포 증식 특성을 평가하기 위해 2012년에 확립되었다. 배양된 MG가 그들의 아교세포 특징(즉, 면역형광 표지를 통해 평가된 S100β, Pax6 및 Sox2 단백질의 발현)을 유지하고, 생체내 MG(FACS-정제된 MG의 마이크로어레이)23과 유사함을 보여주었다. 그 직후, 아교세포 mRNA 및 단백질 발현을 바이러스 벡터20을 사용하여 다른 접근법에서 검증하고 확인하였다. 몇 년 후, 이들 배양물에서 발견되는 대다수의 세포는 MG 특이적 Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 리포터 마우스24를 사용하여 MG임을 확인하였다. 더욱이, FACS 정제된 MG 및 배양된 일차 MG 둘 다에서 miRNAs의 세트의 정량화는 MG miRNAs (mGLiomiRs)의 수준이 성장 단계 동안 배양된 MG에서 크게 변하지 않는다는 것을 보여주었다. 그러나 길쭉한 배양 기간은 miRNA가 번역 조절자(25)이기 때문에 miRNA 수준의 변화를 야기하고, 결과적으로 mRNA 수준 및 단백질 발현에 변화를 일으킨다.
2013년에, 이 MG 배양 모델은 MG를 망막 뉴런20으로 재프로그램하는 그들의 능력에 대하여 다양한 전사 인자를 시험하기 위해 사용되었다. Ascl1은 매우 강력하고 신뢰할 수있는 재 프로그래밍 요소로 밝혀졌습니다. 바이러스 벡터를 통한 Ascl1의 과발현은 형태학적 변화, 뉴런 마커의 발현, 및 뉴런 전기생리학적 특성의 획득을 유도하였다. 더욱 중요하게는, 이러한 첫 번째 시험관내 실험으로부터 얻은 통찰력 및 결과가 생체내 응용(in vivo applications)22,26으로 성공적으로 전달되었으며, 이는 일차 MG 배양이 생체내 구현 전에 초기 인자 스크리닝 및 신경교 기능의 평가를 위한 견고하고 신뢰할 수 있는 도구를 나타낸다는 것을 입증한다.
몇 년 전, 망막 뉴런에서도 고도로 발현되는 뇌가 풍부한 miRNA miR-124가 배양된 MG21에서 Ascl1 발현을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. 살아있는 세포에서의 Ascl1 발현은 Ascl1 리포터 마우스 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl)를 통해 시각화되었다. 리포터 마우스는 DNA에 리포터 유전자가 삽입된 유전자 조작 마우스입니다. 이 리포터 유전자는 리포터 단백질을 암호화하며, 이는 본 연구에서 적색 형광 단백질인 tdTomato이다. 이러한 리포터 단백질은 관심있는 유전자, 이 경우 Ascl1의 발현을 보고한다. 즉, Ascl1을 발현하는 세포는 빨간색으로 변합니다. Ascl1은 RPC9에서만 발현되기 때문에, 이 Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 마우스는 MG가 Ascl1 발현 RPC로 전환되는 것을 추적할 수 있게 해주며, 이는 전환 세포가 적색 형광 tdTomato 리포터 단백질을 발현한다는 것을 의미한다. 이것은 이들 세포의 DNA가 변화되기 때문에 돌이킬 수 없는 표지이다. 결과적으로, 임의의 후속 뉴런 분화는 tdTomato 라벨이 분화 세포에 남아 있기 때문에 시각화될 것이다. MG 유래 RPC (tdTomato 라벨 포함)를 발현하는 Ascl1이 뉴런으로 분화되면 이러한 뉴런은 여전히 빨간색 레이블을 갖습니다. 따라서 이 마우스는 라이브 셀 이미징을 위한 MG 유래 RPC의 라벨링을 허용할 뿐만 아니라 이러한 MG 유래(적색) RPC의 운명 매핑 및 계보 추적을 허용합니다. 보다 최근에, RPCs에서 miRNA의 세트가 확인되었고, Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-리포터 마우스의 MG 배양물을 사용하여 이들 miRNA가 리프로그래밍 용량 및 효율27에 미치는 영향을 스크리닝하고 테스트하였다. 하나의 후보물질인 RPC-miRNA miR-25가 배양된 MG를 Ascl1 발현 (Ascl1-Tomato+) 세포로 재프로그래밍할 수 있음을 발견하였다. 이러한 재프로그램된 세포는 뉴런 형태학(작은 소마타 및 짧거나 긴 미세 과정), scRNA-Seq를 통해 측정된 뉴런 전사체의 발현, 면역형광 표지(27)를 통해 검증된 뉴런 단백질의 발현을 포함하여 시간이 지남에 따라 뉴런 특징을 채택한다.
여기서, 프로토콜은 이전 작업 21,24,27로부터 적응된 P12 마우스로부터 MG를 성장 및 형질감염시키는 방법을 상세히 설명한다. 이 프로토콜에 대해 선택된 miRNA는 앞서 언급한 miRNA-25로, MG 또는 망막 뉴런에서 낮은 발현 수준을 갖는 RPC에서 고도로 발현되는 miRNA이다. miR-25를 과발현시키기 위해, 뮤린 miR-25 모방체, 즉 인공 miRNA 분자가 사용된다. 대조군으로서, Caenorhabditis elegans로부터의 miRNA의 모방체가 선택되며, 이는 포유동물 세포에서 아무런 기능도 갖지 않는다. MG를 RPC로 변환하는 시각화는 RPC 리포터 마우스(Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), 배경이 혼합된 마우스(C57BL/6, S129 및 ICR 균주)를 통해 달성되었다. 그러나, 이러한 배양은 야생형 균주를 포함한 모든 마우스 균주와 함께 수행될 수 있다. 지난 몇 년 동안, 원래의 프로토콜은 성장 단계 지속 기간 및 전체 배양 기간을 감소시키고 보다 강력한 아교세포 상태를 보장하고 장기간의 배양 기간에 발생하는 세포 변성의 정도를 최소화하기 위해 수정되었다. 규칙적인 형질감염 시간 창은 또한 3h에서 2일로 연장되었다. 앞서 언급한 바와 같이, 현재의 프로토콜은 MG 배양을 재생 연구를 위한 도구로서 기술하지만, 이 방법은 재프로그래밍 인자를 테스트하는데 유용할 뿐만 아니라, MG 이주 또는 증식성 거동, 손상/세포 손상 관련 패러다임, 및/또는 근본적인 메커니즘 및 경로의 식별에 관한 연구를 포함하는 다른 응용에도 적용될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ascl1-CreERT 마우스 Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/J</td><td>Jax laboratories</td><td>#012882</td><td>Ascl1-CreERT 마우스와 tdTomato 마우스</td></tr><tr><td>tdTomato-STOPfl/fl 마우스를 교배했습니다. 나6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm14 (CAG-tdTomato) Hze / J</td><td>Jax laboratories</td> <td># 007914</td><td>유전형 분석은 Ascl1CreER 양성 마우스를 식별하는 데 필요합니다</td></tr> <tr><td> 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>(Z) -4-Hydroxytamoxifen, &ge; 98% Z 이성질체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td>에탄올, 냉동 분취액으로 재구성</td></tr><tr><td>16% 파라포름알데히드(PFA) 수용액</td><td>VWR</td><td>100504-782</td><td>인산염 완충 식염수(PBS)로 만든 2% PFA, 냉동 분취</td></tr>액 <tr><td>Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>711-546-152</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>705-606-147</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>Anti-human Otx2 항체, R& D Systems</td><td>Fisher Scientific</td><td>AF1979</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>안티 토끼 MAP2 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9942-200UL</td><td>희석 1:250</td></tr><tr><td>안티 적색 형광 단백질(RFP) 항체</td><td>항체-온라인</td><td>ABIN334653</td><td>희석 1:500</td></tr><tr><td>Ascorbic Acid</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72132</td><td>PBS에서 재구성, 냉동 분취</td></tr><tr><td>B-27 보충제</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-504-044</td><td>냉동 부분 표본</td></tr><tr><td>Brain Phys Neuronal Medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>05790</td><td>섹션 1.2에서 뉴런 배지로 사용, 4°C에 보관; C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.1643 231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY -26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB</td></tr><tr><td>)Click-iT EdU Alexa Fluor 647 이미징 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>C10340</td><td>재구성 다음 매뉴얼, 4&데그; C</td></tr><tr><td>Dibutyryl-cAMP</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73886</td>은 <td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), 냉동 분취</td></tr>액 <tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td>로 재구성되었습니다. <td>Fisher Scientific</td><td>MT-25950CQC</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td>냉동 분량</td></tr>수 <tr><td>Gibco&nbsp; Opti-MEM 감소 세럼 매체, GlutaMAX 보충제</td><td>Fisher Scientific</td><td>51-985-034</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>깁코&nbsp; 트립신을 함유하는 용액으로 사용되는 TrypLE Express Enzyme (1X), 페놀 레드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-605-028</td><td>, 4°C에서 보관; C</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-025-134</td><td>4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>라미닌 마우스 단백질, 천연</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-017-015</td><td> 냉동 부분 표본, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831. 1643231638-1407032920.163831 5521&_gac=1.124727416.164323 1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN suLirnQzunvMEuS9wA08uY- 26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB) </td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>25-030-081</td><td>냉동 분취량</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control</td><td>Horizon</td><td>CN-001000-01-50</td><td>RNase free water (200 &micro; M), 냉동 분취량</td></tr><tr><td>miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimic</td><td>Horizon</td><td>C-310564-05-0050</td><td>RNase free water (200 &micro; M), 냉동 분취제</td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-502-048</td><td>냉동 분취</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-103-049</td><td>섹션 1.1에서 성장 배지로 사용, 4 &deg에 보관; C</td></tr><tr><td>파파인 해리 시스템</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003153</td><td>Earle's Balanced Salt Solution, 냉동 부분 표본으로 재구성</td></tr><tr><td>페니실린 스트렙토마이신</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td>냉동 분취액</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-오르니틴 하이드로브로마이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4538-50MG</td><td>멸균수, 냉동 분취 표본에서 재구성</td></tr><tr><td>재조합 인간 BDNF 단백질</td><td>R& D Systems</td><td>248-BDB-050/CF</td>는 <td>멸균된 PBS 및 FBS, 냉동 분취액에서 재구성됨</td></tr><tr><td>재조합 마우스 EGF 단백질</td><td>Fisher Scientific</td><td>2028EG200</td><td>은 멸균된 PBS, 냉동 분취액에서</td></tr> 재구성됨 <tr><td>재조합 쥐 GDNF 단백질</td><td>Fisher Scientific</td><td>512GF010</td><td>은 멸균된 PBS, 냉동 분취액에서 재구성되었습니다.</td></tr><tr><td>Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>712-296-150</td><td>희석 1:1,000</td></tr><tr><td>슬라이드 장착 매체</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>형질주입 시약(Lipofectamine 3000)</td><td>Fisher Scientific</td><td>L3000015</td><td>4°E에 보관; C</td></tr><tr><td>plasticware/supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.6 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-129</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L 팁&nbsp; 멸균 필터&nbsp; 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-439</td><td></td></tr><tr><td>100 &micro; L 팁&nbsp; 멸균 필터 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-431</td><td></td></tr><tr><td>1000 &마이크로; L TIP 멸균 필터 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-408-138</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L 팁&nbsp; 멸균 필터 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>조절 가능한 볼륨 피펫(2.5, 10, 20, 100, 200 & 1000 & 마이크로; L)</td><td>Eppendorf</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>일회용 전사 Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-669-12</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-29</td><td></td></tr><tr><td>Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; 멸균 필터 10ML 일회용 혈청학 Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; 멸균 필터 50ML 일회용 혈청학적 Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10Q</td><td></td></tr><tr><td>PIPET&nbsp; 멸균 필터 5ML 일회용 혈청학적 Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>파우더-프리 니트릴 검사 장갑</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597B</td><td></td></tr><tr><td>원형 커버슬립 (직경 12mm, 두께 0.17 - 0.25mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22293232</td><td></td></tr><tr><td>진공 필터, 기공 크기=0.22 &마이크로; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-761-106</td><td></td></tr><tr><td>equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1300 B2 Biosafety cabinet</td><td>Thermo Scientific</td><td>1310</td><td></td></tr><tr><td>올인원 형광 현미경 Keyence BZ-X 810</td><td>Keyence</td><td>9011800000</td><td></td></tr><tr><td>쌍안 줌 스테레오 현미경</td><td>Vision Scientific</td><td>VS-1EZ-IFR07</td><td></td></tr><tr><td>일회용 페트리 접시 (직경 100 mm)</td><td>VWR</td><td>25384-088</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 집게 - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-40</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 집게 - Biologie/Inox</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 곡선 집게 - Biologie/Titanium</td><td>Fine Science Tools</td><td>11272-40</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5430 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>2231000508</tr><tr><td>파인 가위-샤프</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>McPherson-Vannas 가위, 8cm</td><td>세계 정밀 기기</td><td>14124</td><td></td></tr><tr><td>금속 구슬 목욕</td><td>실험실 갑옷</td><td>74309-714</td><td></td></tr><tr><td>너트 믹서, 전기=115V, 60Hz, 속도=24rpm</td><td>VWR</td><td>82007-202</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 코팅 해부 페트리 접시(90mm 직경)</td><td>리빙 시스템 계측</td><td>DD-ECON-90-BLK-5PK</td><td></td></tr><tr><td>핀셋, 경제 #5</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501979</td><td></td></tr><tr><td>워터 재킷 CO2 인큐베이터</td><td>VWR</td><td>10810-744</td><td></td></tr></tbody></table>

microrna 처리 후 murine müller glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양

Primary Cell Cultures to Study the Regeneration Potential of Murine M&#252;ller Glia after MicroRNA Treatment

뮐러 글리아 (MG)는 신경 망막에서 우세한 아교 세포이며 망막 뉴런의 재생 원으로 기능 할 수 있습니다. 물고기와 같은 하부 척추 동물에서는 MG 구동 재생이 자연적으로 발생합니다. 그러나 포유류에서는 특정 요인에 대한 자극이나 유전 적 / 후성 유전 적 조작이 필요합니다. MG는 망막 세포 집단의 단지 5%만을 구성하기 때문에, 이 세포 집단의 연구를 배타적으로 허용하는 모델 시스템에 대한 필요성이 존재한다. 이러한 모델 시스템 중 하나는 재현 가능한 일차 MG 배양물이며 분자/인자 스크리닝 및 식별, 화합물 또는 인자 테스트, 세포 모니터링 및/또는 기능 테스트를 포함한 다양한 용도에 사용할 수 있습니다. 이 모델은 인공 miRNA 또는 그의 억제제의 형질감염을 통해 마이크로RNA (miRNAs)의 보충 또는 억제 후에 망막 뉴런으로 전환하는 뮤린 MG의 잠재력을 연구하는 데 사용된다. MG 특이적 리포터 마우스를 면역형광 표지 및 단세포 RNA 시퀀싱(scRNA-seq)과 병용하여 이들 배양물에서 발견된 세포의 80%-90%가 MG임을 확인하였다. 이 모델을 사용하여 miRNA는 MG를 망막 전구 세포(RPCs)로 재프로그래밍할 수 있으며, 이는 이어서 신경유사 세포로 분화된다. 이 기술의 장점은 miRNA 후보가 생체 내 적용에서 사용하기 전에 효율성과 결과에 대해 테스트 할 수 있다는 것입니다.

이 프로토콜은 P12 마우스 망막에서 MG를 성장시키는 방법과 Ascl1CreERT : tdTomatoSTOPfl / fl RPC 리포터 마우스를 사용하여 miR-25로 이러한 세포를 망막 뉴런으로 재 프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 MG를 RPC로 재프로그래밍한 다음, 뉴런 세포 특성(27)을 채택하기 위해 다른 적합한 miRNA(모방체 또는 억제제, 단일 분자 또는 조합)를 상세히 보고하기 위한 이전 연구에서 사용되었다. 이 방법은 배양물을 더 빠르게 성장시키고, 따라서 시간24,28,29에 걸쳐 인공 환경에 의해 야기되는 세포 변화를 최소화하도록 변형되었다.
원발성 MG 배양의 망막 해...

마우스 망막으로부터 수득된 뮐러 글리아 일차 배양물은 마이크로RNA 처리 후 망막 전구 세포로의 신경교세포 전환을 연구하는 매우 강력하고 신뢰할 수 있는 도구를 나타낸다. 단일 분자 또는 조합물은 생체내 접근법의 후속 적용 전에 시험될 수 있다.

MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양

M&#252;ller glia (MG) are the predominant glia in the neural retina and can function as a regenerative source for retinal neurons. In lower vertebrates ...

이 프로토콜을 통해 Muller glia가 microRNA와 같은 특정 인자로 치료 한 후 망막 전구 세포로 전환 될 수있는 잠재력과 능력을 연구 할 수 있습니다. 이 기술의 장점은 microRNA 후보가 생체 내 응용 분야에서 사용하기 전에 효율성과 결과를 테스트할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시연하는 데 도움이되는 것은 Stefanie Wohl 실험실의 박사 과정 학생 인 강서영입니다.먼저, 제거 된 안구를 에탄올이 든 튜브에 잠깐 담그면 동물에서 박테리아가 이월되지 않도록하십시오. 그런 다음 얼음 위의 24웰 플레이트에 넣기 전에 10cm 페트리 접시에서 안구를 잠깐 씻습니다. 안구를 제거하고 청소한 후에는 광원이 있는 해부 현미경 아래에 놓인 해부 접시에 한쪽 눈을 놓습니다.이제 Dumont 5 개의 미세한 집게로 시신경과 공막 주변의 주변 결합 조직을 잡고 해부 접시에 조심스럽게 눌러 한쪽 안구를 고정하십시오. 다음으로 정맥 가위가 더 쉽게 접근 할 수 있도록 30 게이지 바늘을 사용하여 각막 중앙에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 정맥 가위를 사용하여 모양체 주변의 각막을 해부하고 Dumont 5 미세 집게로 각막, 렌즈, 홍채 및 유리체를 조심스럽게 제거합니다.나중에 시신경에 도달 할 때까지 정맥 가위로 공막을 해부하고 Dumont 5 미세 집게를 사용하여 망막을 조심스럽게 추출합니다. 이제 두 번째 Dumont 5 미세 집게를 사용하여 망막을 밀고 유리체를 완전히 제거하십시오. 망막을 멸균 이송 피펫의 끝에서 약 2.5 센티미터 절단하여 직경을 확대한다.이제이 팁을 사용하여 조직을 손상시키지 않고 전체 망막을 집어 들고 망막을 차가운 HBSS가있는 새로운 멸균 페트리 접시에 옮기고 접시를 흔 듭니다. 다음으로, 새로운 멸균 이송 피펫을 사용하여 망막을 조심스럽게 밀어 망막 색소 상피 세포를 씻어냅니다. 분리된 망막을 즉시 1밀리리터의 HBSS로 채워진 24웰 플레이트의 새로운 깨끗한 웰에 놓고 해부 동안 24웰 플레이트를 얼음 위에 유지합니다.원고에 설명 된대로 파파인 DNase I 해리 혼합물을 준비하십시오. 이제 확대 된 팁 전사 피펫으로 망막을 집어 올리십시오. 망막이 팁의 바닥에 정착 할 때까지 기다렸다가 과도한 HBSS없이 망막을 Papain DNase I 혼합물이 들어있는 튜브로 방출합니다.다음으로 인큐베이터의 뉴테이터에 튜브를 놓고 섭씨 37도에서 10 분 동안 5 % 이산화탄소와 함께 배양합니다. 다음으로, 1 밀리리터 피펫으로 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 세포를 해리시킵니다. 세포가 해리된 후 파파인 해리 키트에서 275마이크로리터의 오보뮤코이드 프로테아제 억제제를 추가하여 파파인을 중화하고 위아래로 피펫팅하여 부드럽게 혼합합니다.튜브를 원심분리기에 넣고 섭씨 4도에서 300의 상대 원심력으로 8분 동안 회전시킵니다. 표피 성장 인자를 섭씨 37도에서 예열 된 성장 배지의 계산 된 부피에 첨가하십시오. 원심 분리기에서 튜브를 조심스럽게 제거하십시오.튜브 바닥의 펠릿을 만지지 않고 상청액을 조심스럽게 완전히 제거하십시오. 이제 세포 펠렛을 500 마이크로리터의 표피 성장 인자 보충 성장 배지로 재현탁시킨다. 이어서, 세포 현탁액을 표지된 12 웰 플레이트의 하나의 웰로 옮긴다.다른 500 마이크로 리터의 표피 성장 인자 보충 성장 배지로 튜브를 헹구고 우물에 첨가하십시오. 웰 플레이트를 조심스럽게 흔든 다음 플레이트를 이산화탄소와 함께 섭씨 37도의 인큐베이터에 넣습니다. 90%에서 100%의 셀 컨플루언스를 확인하는 것으로 시작합니다.다음으로, 배지를 제거하고 차가운 HBSS 1 밀리리터를 첨가하여 우물을 씻으십시오. 플레이트를 부드럽게 흔들고 흔적이 남지 않고 HBSS를 제거합니다. 나중에 500 마이크로 리터의 예열 된 트립신 함유 용액을 추가하여 웰에서 세포를 분리합니다.부드럽게 흔들어 섭씨 37도 인큐베이터에서 2 분간 배양하십시오. 플레이트를 인큐베이터에서 바이오 안전 캐비닛으로 옮긴 후 기울이면서 트립신 함유 용액을 흡인합니다. 세포가 완전히 분리 될 때까지 우물 위에 조심스럽게 천천히 여러 번 분산시킵니다.다음으로이 세포 현탁액을 멸균 된 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 튜브를 원심 분리기에 넣습니다. 섭씨 4도에서 8분 동안 300회 g으로 회전하고 튜브를 바이오 안전 캐비닛으로 다시 가져옵니다. 펠릿을 건드리지 않고 상청액을 제거하십시오.이제 600 마이크로리터의 예열된 성장 배지를 추가하고 약 30-40회 위아래로 피펫팅하여 세포 펠릿을 조심스럽게 재현탁시킵니다. 마지막으로, 수득된 세포 현탁액 100 마이크로리터를 24 웰 플레이트의 6개의 코팅된 커버 슬립의 중앙에 시드한다. 플레이트를 인큐베이터 상에 놓고, 마이크로RNA 모조물을 사용한 후속 형질감염을 위해 세포를 침전시킨다.그림은 형질감염 5일 후 몇 개의 Ascl1-Tomato 양성 세포가 존재하는 대조군 상태를 보여줍니다. 그러나 miR-25 치료 후 더 많은 Ascl1-토마토 양성 세포가 발견됩니다. 정량화 결과 대조군에 비해 miR-25 처리 웰에서 Ascl1-Tomato 양성 세포 수가 4배 증가한 것으로 나타났습니다.가장 중요한 것은 riR-25 처리된 웰에서 발견되는 Ascl1-Tomato 양성 세포의 대다수가 뉴런 형태를 채택했다는 것입니다. 이 신경 형태의 특징에는 세포 체세포 크기 감소, 미세 과정의 발달 및 작은 네트워크의 형성이 포함되었습니다. 정량화 결과 모든 Ascl1-Tomato 양성 세포의 약 70%가 신경 특징을 가지고 있음이 밝혀졌습니다.면역형광 표지는 뉴런 형태를 가진 Ascl1-Tomato 양성 세포가 신경 마커 OTX2 및 MAP2를 발현하여 뉴런 동일성을 확인함을 보여줍니다. 이들 세포의 정량화는 miR-25 과발현 후, 대조군에서 필드당 5개의 뉴런 세포와 비교하여 필드당 약 40개의 Ascl1-Tomato 양성 뉴런이 존재한다는 것을 밝혀냈다. 확인 된 신경 세포는 miR-70 처리 된 샘플의 전체 Ascl1-Tomato 양성 세포 집단의 약 25 %를 구성합니다.또한, OTX2 및 MAP2 동시 발현 뉴런의 절대 수를 정량화한 결과, miR-25 처리 후, 대조군에서는 필드당 10개의 뉴런에 비해 필드당 약 60개의 뉴런이 발견되었다. 깨끗하고 살균 된 도구로 깨끗하고 살균 된 환경에서 작업하고 가혹한 취급을 피하면서 조심스럽게 작업하는 것이 필수적입니다. 다운스트림 응용 분야는 예를 들어 단백질 정량화, DNA 또는 RNA 분석 또는 전기생리학적 연구일 수 있습니다.이 기술은 재생 의학 분야에 속하는 핵 재 프로그래밍에 대한 초기 질문을 탐구하는 데 도움이되었습니다. 그리고 새로운 질문을 탐구하기 위해 테스트 할 수있는 광범위한 요소와 조건이 있습니다.

primary-cell-cultures-to-study-regeneration-potential-murine-mller

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 쥐 새끼의 소뇌에서 소뇌 신경 전구 세포의 격리와 배양을 보여줍니다. 소뇌 과립 뉴런 전구세포는 차등 접착을 통해 분리 및 정제되어 성상세포를 효과적으로 제거합니다. 이러한 배양된 전구세포는 이후에 소뇌 과립 뉴런으로 분화합니다.

Isolating and culturing murine Cerebellar Granular Neuron Progenitors(쥐 소뇌 과립 뉴런 전구 세포)

이 비디오는 쥐의 망막에서 분리된 Müller glial (MG) 세포의 배양을 보여줍니다. 망막은 소화 효소를 사용하여 단세포 현탁액으로 해리됩니다. 그런 다음 세포는 MG 세포 증식과 신경 세포 사멸을 촉진하는 성장 인자를 가진 배지에서 성장합니다. 파시에이징(passaging) 과정에서 죽은 신경세포를 제거하고 MG 세포를 성장시켜 추가 분석을 진행합니다.

마우스 망막에서 얻은 Müller Glial 세포 배양 확립

이 비디오는 성체 쥐의 척수 조직에서 1차 혼합 신경교세포를 분리하고 배양하는 기술을 보여줍니다. 이 프로토콜은 조직의 효소 분해를 포함하며, 그 후 단세포 집단을 얻기 위해 부서진 세포막과 미엘린 파편을 제거하는 것입니다. 그런 다음 세포는 혼합 신경교세포 성장에 최적화된 배지에서 배양됩니다.

Establishing Primary Mixed Glial Cell Cultures from a Mouse Spinal Cord

우리는 신생아 대뇌 피질 성인 척수 가능한 미세 아교 세포의 효율적이고 신속한 분리 / 문화 방법을 설명합니다. 대뇌 피질의 미세 아교 세포의 해부 및 도금은 초기 박리 다음 장소 ~ 10 일을 복용 이후 미세 아교 수확으로 90 분 이내에 수행 할 수 있습니다.

신생아와 성인 중추 신경계에서 배양 소교 세포

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

우리는 신경 손상 후 후각 내성 glia (OEG) 신경 재생 능력을 평가하는 체외 모델을 제시한다. 그것은 RGN 축상 및 somatodritic 마커를 분석해서, OEG 단층 및 축 변성의 후속 연구 결과에 축축한 성인 망막 신경절 신경절 뉴런 (RGN)의 공동 문화를 기반으로합니다.

축 축 하 재생의 시험관 내 모델로, 후각 천시 글리아와 축 축 절 망막 신경의 공동 문화

1차 미세아교세포 배양은 일반적으로 새로운 항염증 분자를 평가하는 데 사용됩니다. 본 프로토콜은 신생아 새끼로부터 미세아교세포를 자기적으로 분리하는 재현 가능하고 관련성 있는 방법을 설명합니다.

일차 세포 배양을 위한 Neonate 마우스의 미세아교세포의 자기 분리

이 프로토콜은 신경(면역)학 연구를 위해 배아 17일 마우스 뇌에서 중추 신경계 세포 배양을 생성하는 독특한 방법을 제시합니다. 이 모델은 RT-qPCR, 현미경, ELISA 및 유세포 분석을 포함한 다양한 실험 기술을 사용하여 분석할 수 있습니다.

감염 및 선천성 면역을 연구하기 위해 배아 쥐 뇌에서 혼합 신경 세포 및 신경교 세포 배양 확립

이 원고는 쥐의 눈에서 망막 신경교세포(retinal glial Müller cell)를 분리하기 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 프로토콜은 쥐 눈의 적출 및 절개로 시작하여 Müller 세포의 분리, 파종 및 배양으로 이어집니다.

Primary Mouse Retinal Glial Müller 세포의 분리

배우세요 마우스 Müller 신경교세포를 이용한 일차 배양법으로 microRNA 처리 후 망막 전구세포로의 전환을 연구하는 방법입니다. 이 기술은 재생 의학 연구에 활용됩니다.

MicroRNA 처리 후 Murine Müller Glia의 재생 잠재력을 연구하기 위한 일차 세포 배양

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