Name: 기계론적 연구 및 재생 요법을 향한 강력한 도구로 인간의 치아에서 오가노이드를 확립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-13T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 2 s
Description: 학습하세요 인간 치아 유래 오가노이드 배양법을 통해 치아 상피 줄기세포를 확장하고 법랑질 형성 과정을 연구하는 방법을. 이 기술은 치아 재생 의학 및 질병 치료 연구에 활용됩니다.

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우리는 UZ Leuven의 구강 및 악안면 수술 (MKA)의 모든 직원과 환자들에게 갓 추출 된 세 번째 어금니를 수집하는 데 귀중한 도움을 주신 것에 감사드립니다. 우리는 또한 샘플 수집에 도움을 주신 Reinhilde Jacobs 박사와 Elisabeth Tijskens 박사에게 감사드립니다. 이 작품은 KU Leuven (BOF)과 FWO-Flanders (G061819N)의 보조금으로 지원되었습니다. L.H.는 FWO Ph.D. 펠로우(1S84718N)입니다.

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</ol>

해당 저자는 모든 저자가 모든 이해 상충을 공개했는지 확인합니다.

이 프로토콜은 인간 치아에서 시작하는 오가노이드의 효율적이고 재현 가능한 생성을 설명합니다. 우리의 지식에 따르면, 이것은 인간의 치과 조직에서 시작하여 현재 개념 (상피) 오가노이드를 확립하기위한 첫 번째 방법론입니다. 오가노이드는 장기간 팽창이 가능하며 치아 상피 줄기 표현형을 나타내며, DF7의 ERM 구획에서 이전에 보고된 DESC를 복제한다. 더욱이, 오가노이드는 아멜로아세포 분화 과정 7,25,26의 전개를 포함하는 기능적 DESC/ERM 특성을 복제한다. 연구 결과는 독립적 인 환자 오가노이드 라인19에서 유사한 결과가 발견되었으므로 강력합니다.
이 치아 오가노이드 프로토콜을 실행할 때 몇 가지 중요한 사항을 고려해야...

치아는 음식 매스틱화, 연설 및 심리적 웰빙 (자기 이미지)에 필수적인 역할을합니다. 인간의 치아는 다양한 밀도와 경도의 고도로 미네랄화 된 조직으로 구성됩니다1. 치아 크라운의 주요 구성 요소 인 치과 에나멜은 인체에서 가장 높은 미네랄 화 된 조직입니다. 에나멜 형성 (amelogenesis) 동안, 치아가 발달 할 때, 치과 상피 줄기 세포 (DESCs)는 에나멜 형성 세포 (아멜로 아세포)로 분화됩니다. 일단 형성되면, 에나멜은 치아 분출 시작시 아멜로 아멜 세포의 사멸 적 손실로 인해 거의 수리되거나 갱신되지 않습니다1. 외상이나 박테리아 질환으로 인한 손상된 에나멜 조직의 복원은 현재 합성 물질을 사용하여 수행됩니다. 그러나 이들은 미세 누출, 열등한 골유착 및 앵커리지, 유한 수명 및 완전한 기능 수리 부족과 같은 중요한 단점으로 인해 어려움을 겪고 있습니다2. 따라서 아멜로아세포를 생성할 수 있는 능력과 미네랄화된 조직을 생산할 수 있는 잠재력을 갖춘 인간 DESC의 견고하고 신뢰할 수 있는 문화는 치과 재생 분야에서 중요한 진전이 될 것입니다.
인간 DESC 표현형과 생물학적 기능에 대한 지식은 3,4,5 부족하다. 흥미롭게도, 인간 치아의 DESCs는 말라세즈의 상피 세포 휴식 (ERM), 분출되지 않은 치아를 둘러싸고있는 치과 모낭 (DF) 내에 존재하는 세포 클러스터에 존재하는 것으로 제안되었으며, 치아가 분출되면 뿌리 주변의 치주 인대에 남아 있습니다1. 치과용 펄프와 공동 배양된 ERM 세포는 아멜로아세포형 세포로 분화하여 에나멜 유사 조직을 생성하는 것으로 밝혀졌다(6). 그러나, 에나멜(재)생성에서 ERM 세포의 특정 역할에 대한 심오한 연구는 신뢰할 수 있는 연구 모델7의 부족으로 인해 제한되었다. 현재의 ERM 시험관내 배양 시스템은 표준적으로 사용되는2D 조건에서 제한된 수명과 표현형의 빠른 손실로 인해 방해를 받고 있습니다 8,9,10,11,12. 따라서 인간 DESC를 충실하게 확장, 연구 및 차별화하기위한 견인 가능한 시험관 내 시스템이 강력하게 필요합니다.
지난 십 년 동안, 시험관 내에서 상피 줄기 세포를 성장시키는 강력한 기술은 그들의 생물학뿐만 아니라 질병13,14,15,16을 연구하기 위해 여러 유형의 (인간) 상피 조직에 성공적으로 적용되었습니다. 이 기술은 조직 상피 줄기 세포가 세포외 매트릭스 (ECM)에 시딩될 때 3D 세포 구조 (즉, 오가노이드)로 자체 발달 할 수있게 해줍니다 - 스캐폴드 (전형적으로, Matrigel)를 모방하고 조직의 줄기 세포 틈새 신호 전달 및 / 또는 배아 발생을 복제하는 정의 된 배지에서 배양됩니다. 오가노이드 발달에 필요한 전형적인 성장 인자는 표피 성장 인자 (EGF) 및 날개 없는 유형 MMTV 통합 부위 (WNT) 활성화제14,15,16을 포함한다. 생성 된 오가노이드는 조직의 원래 상피 줄기 세포를 모방하는 데 지속적인 충실성뿐만 아니라 표현형 및 기능적 특성을 유지하면서 높은 확장성을 특징으로하므로 클리닉에서 획득 한 것처럼 종종 제한된 일차 인간 조직 가용성을 극복합니다. 오가노이드를 확립하기 위해, 배양하기 전에 이종 조직으로부터 상피 줄기 세포의 단리(즉, 중간엽 세포와 같은 다른 세포 유형을 포함함)는 중간엽 세포가 ECM에 부착되거나 번성하지 않기 때문에 필요하지 않으며, 결국 순전히 상피 오가노이드13,16,17,18,19를 초래한다. . 이 유망하고 다재다능한 기술은 다양한 인간 상피 조직에서 다양한 오가노이드 모델을 개발하도록 이끌었습니다. 그러나 치아 발달, 재생 및 질병에 대한 심층적 인 연구에 가치있는 인간 치아 유래 오가노이드는 아직20,21 개가 확립되지 않았습니다. 우리는 최근에 청소년 환자19에서 추출한 세 번째 어금니(사랑니)로부터 DF 조직으로부터 출발하여 이러한 새로운 오가노이드 모델을 개발하는 데 성공했다.
여기에서, 우리는 성인 인간 치아로부터 (즉, 세 번째 어금니의 DF로부터) 상피 오가노이드 배양물을 개발하는 프로토콜을 설명한다 (도 1A). 생성된 오가노이드는 ERM 관련 줄기 마커를 발현하면서 장기간 확장 가능하다. 흥미롭게도, 대부분의 다른 오가노이드 모델과는 반대로, 전형적으로 필요한 EGF는 강력한 오가노이드 발달 및 성장을 위해 중복된다. 흥미롭게도, 줄기 오가노이드는 아멜로아세포 분화 특성을 보여주며, 따라서 생체내에서 발생하는 ERM/DESC 특징과 과정을 모방한다. 여기에 설명 된 새롭고 독특한 오가노이드 모델을 통해 DESC 생물학, 가소성 및 분화 능력을 탐구 할 수 있으며 치아 재생 접근법을 향한 첫 걸음을 내딛을 수있는 문을 열어줍니다.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브</td>, <td>Eppendorf</td><td>30120.086</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td>, <td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-6250</td><td></td></tr><tr><td>48웰 평면 바닥 플레이트</td>, <td>Corning</td><td>3548</td><td></td></tr>, <tr><td>50 mL 원심분리기 튜브</td>, <td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr>, <tr><td>A83-01</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>SML0788</tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>알부민 소 (세포 배양 등급)</td> <td>Serva</td><td>47330.03</td><td></td></tr><tr><td>AMELX 항체</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365284</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco 15200018</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 (비타민 A 제외)</td> <td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>카세트</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>소 간에서 추출한 7202191 카탈라아제</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>CD44 항체</td><td>Abcam</td><td>ab34485</td><td></td></tr><tr><td>Cell strainer, 40 &micro; m</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>콜레라 독소</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8052</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0759</td><td></td></tr><tr><td>CK14 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA5-11599</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리</td><td>VWR</td><td>6310146</td><td></td></tr><tr><td>Cryobox</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>375353</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4693</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1:1 F12 without Fe</td><td>Invitrogen</td><td>074-90715A</td><td></td></tr><tr><td>DMEM powder high glucose</td><td>Gibco</td><td>52100039</td><td></td></tr><tr><td>Dnase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5025-15KU</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 세럼</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9663 - 10ML</td><td></td></tr><tr><td>임베딩 워크스테이션, 220에서 240</td><td>Vac Thermo Fisher Scientific</td><td>12587976</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트, &ge; 99.8% (EtOH)</td><td>피셔 케미컬</td><td>E/0650DF/15</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>시그마-알드리치</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>페프로텍</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>FGF2 (= 기본 FGF)</td><td>R& D Systems</td><td>234-FSE-025</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-25</td><td></td></tr><tr><td>GenElute 포유류 총 RNA Miniprep Kit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RTN350-1KT</td><td>포함 1% &베타;-메르캅토에탄올</td></tr> 용해 <tr><td>용해 완충액 유리 파스퇴르 피펫</td><td>Niko Mechanisms</td><td>170-40050</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>VWR</td><td>101194M</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IGF-1</td><td>PeproTech</td><td>100-11</td><td></td></tr><tr><td>InSolution Y-27632 (ROCK inhibitor, RI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>688001</td><td></td></tr><tr><td>소 췌장에서 추출한 인슐린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>ITGA6 항체</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA012696</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel (성장 인자 감소; 페놀 레드-프리)</td> <td>Corning</td><td>15505739</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV 주사기 필터 유닛, 0.22&nbsp; &뮤; m</td><td>Millipore</td><td>SLGV033R</td><td></td></tr><tr><td>최소 필수 매체 독수리 (&alpha; MEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>마우스 IgG(Alexa 555) 2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-31570</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>N-아세틸 L-시스테인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Noggin</td><td>PeproTech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>P63 항체</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>Pap Pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821-1EA</td><td>마킹 펜</td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA), 16%</td><td>Merck</td><td>8.18715</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 G 나트륨염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(Pen/Strep)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Corning</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Pipette (P20, P200, P1000)</td><td>Eppendorf 또는 기타</td><td>2231300006</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 이송 pipette (3.5&nbsp; mL)</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.001</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit IgG (Alexa 488) 2차 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>RSPO1</td><td>PeproTech</td><td>120-38</td><td></td></tr><tr><td>SB202190 (p38i)</td><td>Biotechne (Tocris)</td><td>1264</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel (surgical blade)</td><td>Swann-Morton</td><td>207</td><td></td></tr><tr><td>SHH</td><td>R& D Systems</td><td>464-SH-200</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 몰드(가열 블록)</td><td>VWR</td><td>720-1918</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨(NaCl)</td><td>BDH</td><td>102415K</td><td></td></tr><tr><td>탄산수소나트륨(NaHCO3)</td><td>Merck</td><td>106329</td><td></td></tr><tr><td>나트륨-피루베이트(C3H3NaO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5280</td><td></td></tr><tr><td>SOX2 항체</td><td>Abcam</td><td>ab92494</td><td></td></tr><tr><td>StepOnePlus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Real-Time PCR 시스템</td></tr><tr><td>Stericup-GP, 0.22 &micro; m</td><td>Millipore</td><td>SCGPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP 멸균 원심분리기 튜브 상단 필터 유닛, 0.22 &mu; m</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 1000 &mu; 필터가 있는 L 피펫 팁</td><td>Greiner</td><td>740288</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 20 &mu; 필터가 있는 L 피펫 팁</td><td>Greiner</td><td>774288</td><td></td></tr><tr><td>Sterile 200 &mu; L 피펫 팁(필터 포함/미포함</td>) <td>Greiner</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>Sterile H2O</td><td>Fresenius</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>스트렙토마이신 설페이트 염</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6501</td><td></td></tr><tr><td>Superscript III first-strand synthesis supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11752-050</td><td>역전사 키트</td></tr><tr><td>조직 처리기</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>12505356</tr><tr><td>Transferrin</td><td>Serva</td><td>36760.01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-50ML</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE express</td><td>Gibco</td><td>12605-010</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield 장착 매체 + DAPI</td><td>Labconsult NV</td><td>H-1200</td> DAPI WNT3a Biotechne (Tocris) 5036-WN-500<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>이 포함 된 페이드 방지 장착 매체자일렌, 99%, 생화학 및 조직학 VWR</td><td></td><td>2,89,75,325</td><td></td></tr></tbody></table>

기계론적 연구 및 재생 요법을 향한 강력한 도구로 인간의 치아에서 오가노이드를 확립

Establishing Organoids from Human Tooth as a Powerful Tool Toward Mechanistic Research and Regenerative Therapy

치아는 음식 매스틱 화와 연설뿐만 아니라 심리적 안녕을 위해 삶에서 매우 중요합니다. 인간의 치아 발달과 생물학에 대한 지식은 부족합니다. 특히, 치아의 상피 줄기 세포와 그 기능에 대해서는 많이 알려져 있지 않다. 우리는 인간의 치아 조직 (즉, 추출 된 사랑니에서 분리 된 치과 모낭)에서 시작하여 새로운 오가노이드 모델을 개발하는 데 성공했습니다. 오가노이드는 견고하고 장기간 확장 가능하며 기능적 활성뿐만 아니라 마커 발현 측면에서 제안 된 인간 치아 상피 줄기 세포 구획을 재구성합니다. 특히, 오가노이드는 아멜로제닉 동안 생체내에서 발생하는 것으로서 아멜로아세포 분화 과정을 전개할 수 있다. 이 독특한 오가노이드 모델은 인간의 치아 발달뿐만 아니라 치과 병리학을 연구 할 수있는 강력한 도구를 제공 할 것이며 치아 재생 요법으로 나아갈 길을 열어 줄 수 있습니다. 이 새로운 오가노이드 모델을 기반으로 잃어버린 치아를 생물학적 치아로 대체하는 것은 합성 물질의 현재 표준 이식에 대한 매력적인 대안이 될 수 있습니다.

치아 오가노이드 발달 우리는 사랑니 추출 후 획득 한 인간 DF 조직에서 오가노이드 배양을 확립하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다 (그림 1A). 단리된 DF는 효소적으로 및 기계적으로 해리된다. 수득된 세포는 최적의 오가노이드 발달 및 성장을 위해 경험적으로 정의되었던 배지에서 BMM 내에서 배양된다 (치아 오가노이드 배지; 톰)19.
오가노이드는 전형적으로 DF 세포 시딩 후 2주 이내에 발달한다(P0; 도 2A). 오가노이드는 장기간 확장 가능(지금까지 최대 11개 통로)입니다(그림 2B, P4 참조). BMM 액적 당 약 20,000 개의 세포를 시딩하는 것은 (P0 및 추가 계대 모두에서) 오가노이드의 최적 밀도를 산출하는 반면(그림...

우리는 인간의 치아에서 시작하여 상피 오가노이드 문화를 개발하기위한 프로토콜을 제시합니다. 오가노이드는 견고하게 확장 가능하며 아멜로아세포 분화 능력을 포함하여 치아의 상피 줄기 세포를 재생산합니다. 독특한 오가노이드 모델은 치아 재생 접근법에 대한 관점으로 인간 치과 (줄기 세포) 생물학을 연구 할 수있는 유망한 도구를 제공합니다.

Teeth are of key importance in life not only for food mastication and speech but also for psychological well-being. Knowledge on human tooth development ...

이 새로운 인간 치아 유래 오가노이드 모델은 치아 재생 응용 분야에 대한 관점으로 인간 치과 줄기 세포 생물학을 해독하는 최초의 강력한 도구를 제공합니다. 현재이 치아 오가노이드 모델은 인간 치아 상피 줄기 세포를 안정적이고 견고하게 성장하고 확장 할 수있는 유일한 도구입니다. 이 오가노이드 프로토콜은 건강뿐만 아니라 치과 종양 및 박테리아 영향과 같은 병든 치아에서도 연구 모델을 수립하는 데 적용될 수 있습니다.이러한 질병 모델의 탐구는 새로운 치료 목표를 발견 할 수 있습니다. 이 오가노이드 모델은 인간의 치아에서 에나멜 형성 과정을 해독하는 데 매우 중요하며 생성 목적으로 에나멜과 같은 치아 부분을 구성 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 연구 그룹의 박사 과정 학생 인 Lara Hemeryck이 될 것입니다.시작하려면 얼음 위에 놓인 수집 매체에서 관련 치과 모낭이있는 세 번째 어금니를 수집하고 튜브의 내용물을 Petri 접시로 옮깁니다. 핀셋으로 치아를 잡고 수술 블레이드를 사용하여 치아 모낭을 조심스럽게 분리하십시오. 치과용 모낭 조직을 70%에탄올의 첫 번째 웰에 20초 동안 잠깐 위치시켜 치과에서 남은 혈액을 씻어낸 다음, 20초 동안 다음 사멸 에탄올 플레이트로 옮기고 더 나아가 세 번째 에탄올 웰로 옮긴다.인산염 완충 식염수 웰에서 세 번 계속 헹구고 남은 세 개의 치과 모낭 수집 배지 웰에서 치과 모낭을 총 최대 20분 동안 헹구십시오. 헹굼 된 치과 모낭을 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 파라포름알데히드 고정을 위해 치과 모낭 중 하나의 작은 조각을 절단하고 최대 6 시간 동안 500 마이크로리터의 수집 배지가 들어있는 마이크로 원심분리 튜브에 보관하십시오.나머지 치과 모낭을 작은 조각으로 다듬어 네 밀리리터의 예열 해리 배지가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮긴 다음 튜브를 섭씨 37도에서 수조에서 두 시간 동안 배양하십시오. 매 15분마다, 치과용 모낭 해리 매질을 피펫하고 유리 피펫을 이용하여 위아래로 섞어 조직 붕해의 속도를 높인다. 치과 모낭 조각이 더 이상 관찰되지 않으면 좁아지고 불로 닦은 파스퇴르 피펫을 사용하여 해리를 진행하십시오.그 동안 100 마이크로 리터의 DNase가 들어있는 10 밀리리터의 배지 A를 준비하고 해리 된 치과 모낭이있는 각 튜브에이 배지 5 밀리리터를 첨가하십시오. 실온에서 일분 동안 인큐베이션한다. 이 단계에서 한 명의 환자로부터 해리된 치과 모낭의 여러 튜브를 결합한 배지 1밀리리터로 필터를 헹구고 여과된 세포 현탁액을 섭씨 4도에서 10분 동안 200배 g에서 원심분리합니다.상층액을 제거하십시오. 펠렛을 무혈청 정의 배지 1밀리리터에 재현탁시키고 세포 현탁액을 1.5밀리리터 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 자동화된 셀 카운터를 사용하여 세포 농도를 계산하고 시드할 수 있는 웰의 수를 계산합니다.최종 혼합은 30 내지 70의 비율로 세포 현탁액 및 기저막 매트릭스로 구성된다. 적당량의 상층액을 제거하고 천천히 재현탁하여 도금을 위한 세포 현탁액에 대한 빙냉 기저막 매트릭스의 70 대 30 비율을 얻었다. 일단 기저막 매트릭스에 재현탁되면, 기저막 매트릭스 응고를 피하기 위해 마이크로원심분리 튜브를 얼음 위에 보관한다.20 마이크로리터의 기저막 매트릭스 액적을 예열된 48-웰 배양 플레이트의 중앙에 피펫한다. 플레이트를 거꾸로 뒤집어 섭씨 37도의 1.9 % 이산화탄소 인큐베이터에서 20 분 동안 응고시킵니다. 로-연관 키나제 억제제와 암포테리신 B를 치아 오가노이드 배지에 첨가하고, 섭씨 37도 수조에서 배지를 예열한다.인큐베이터에서 48웰 플레이트를 가져옵니다. 그것을 똑바로 세우고 준비된 미리 차열 된 배지 250 마이크로 리터를 세포가 들어있는 기저막 매트릭스 액적으로 각 웰에 첨가하고 플레이트를 이산화탄소 인큐베이터로 되돌립니다. 매체를 새로 고치려면 플레이트를 45도 각도로 기울입니다.기저막 매트릭스 액적을 만지지 않고 이전 배지를 부드럽게 제거하고 2 ~ 3 일마다 250 마이크로 리터의 새로운 예열 치아 오가노이드 배지를 첨가하십시오. 오가노이드의 통과를 수행하려면 오가노이드가있는 우물에서 배지를 제거하고 최대 네 개의 합류 우물을 풀링하십시오. 오가노이드를 수집하려면 웰 당 400 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 혈청이 없는 정의 배지를 막 매트릭스 액적에 직접 넣고 전체 액적이 빠질 때까지 배지를 위아래로 반복적으로 피펫팅합니다.우물이 풀링되면 400 마이크로 리터를 첫 번째 우물에서 다음 웰로 옮겨 물방울이 들어있는 오가노이드를 제거합니다. 탈락된 오가노이드 어셈블리를 1.5 마이크로리터 마이크로원심분리 튜브로 옮기고, 모든 오가노이드 구조가 웰로부터 수집될 때까지 무혈청 정의 배지의 첨가를 반복한다. 섭씨 4도에서 5분 동안 200배 g에서 원심분리한다.원심분리 튜브로부터 상층액을 제거하고 펠렛을 TrypLE Express의 예열 분취량에 재현탁시킨다. 400 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 혈청이 없는 정의 배지를 첨가하여 효소를 불활성화시키고 섭씨 4도에서 5분 동안 200배 g에서 원심분리한다. 상층액을 제거하십시오.팁을 얼음처럼 차가운 혈청이 없는 정의된 배지로 미리 코팅하고 오가노이드 펠릿을 멸균 상태로 재현탁한다. 펠렛을 저역 통과 방법에 대해 200 마이크로리터의 빙냉 무혈청 정의 배지에 재현탁시킨다. 완전히 비워진 피펫 팁을 마이크로 원심분리 튜브의 바닥에 밀어 직경을 줄입니다.오가노이드를 기계적으로 파괴하기 위해 다섯 분 동안 피펫을 위아래로 피펫하십시오. 더 높은 통과 방법의 경우, 펠릿을 P1000 팁이있는 700 마이크로 리터의 얼음처럼 차가운 혈청이없는 정의 배지에 재현탁하십시오. 이 P1000 팁에 P200 팁을 추가하고 얼음처럼 차가운 혈청이 없는 정의 배지로 프리코트를 합니다.피펫의 볼륨 설정을 조정하여 기포 형성을 방지합니다. 중간 부피의 90 % 이상을 오가노이드와 피펫으로 5 분 동안 위아래로 열망하여 오가노이드를 기계적으로 파괴하십시오. 오가노이드는 일반적으로 치과 모낭 세포 파종 후 두 주 후에 발생합니다.오가노이드는 최대 11 개의 통로까지 장기간 확장 가능합니다. 기저막 매트릭스 액적 당 약 20, 000 개의 세포를 시딩하면 최적의 오가노이드 밀도가 생성되는 반면, 더 높은 세포 수를 시드하면 성장할 공간이 부족하여 너무 높은 밀도에서 유사한 오가노이드를 가진 차선책의 오가노이드 성장이 발생합니다. 개발 된 오가노이드는 조밀 한 외관을 보여 주며 높은 핵세포질 비율을 나타내는 세포를 포함합니다.더욱이, 오가노이드는 그들의 상피 기원을 확인하는 ERM 마커 시토케라틴 14 및 다른 제안된 ERM 마커, 예컨대 P63, CD44, 및 인테그린 알파-6을 발현한다. 오가노이드는 마우스에서 잘 알려진 DESC 마커인 SOX2를 발현한다. 흥미롭게도, 에나멜 매트릭스의 주요 구성 요소 인 아멜로게닌도 오가노이드로 표현됩니다.오가노이드는 마커의 안정한 발현에 의해 나타난 바와 같이 패시징 동안 그들의 ERMM 줄기 표현형을 유지한다. 최적의 장기 오가노이드 성장을 위해, 권장되는 통과 방법 의미 또는 낮은 통과 방법 또는 더 높은 통과 방법을 사용하는 것이 필수적이다. 일단 형성되면, 오가노이드는 아멜로제닉 과정을 추가로 면밀히 조사하고 현재 치과 연구에서 달성되지 않은 에나멜 매트릭스 침착을 사용하여 사용할 수 있습니다.이 기술은 치과 상피 줄기 세포 생물학, 에나멜 형성 과정 및 올바른 치아 형성에 필수적인 상호 작용 인 치아 중간엽과의 상호 작용을 탐구 할 수있게합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

지속적으로 성장 마우스 앞니는 치아 상피 줄기 세포 (DESCs)에서 치아 조직의 재생을 연구하기위한 모델을 제공합니다. 일관되고 안정적으로 앞니에서 이러한 세포를 획득하고 체외에서 그 확장을위한 강력한 시스템은 여기에보고됩니다.

성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

이 프로토콜 인간의 치과 여 포에서 추출한 치아 줄기 세포의 변이 유전 공학에 설명 합니다. 적용된 비 바이러스 성 수정 전략 치료 줄기 세포 제품의 개선 위한 기초 될 수 있습니다.

절연, 특성화 및 예측에 관한 기반 유전자 조작 인간 치과 여 포 줄기 세포의

우리는 치과 펄프 (DP) 1 차 세포의 격리, 분산 및 도금이 지나치게 트랜스웰 필터 위에 배양된 삼차 (TG) 뉴런을 설명합니다. DP 세포의 세포 반응은 면역 형광 또는 RNA /단백질 분석으로 분석 될 수있다. 공초점 현미경검사법을 가진 신경 마커의 면역형광은 신경질성 파생 반응의 분석을 허용합니다.

치과 펄프 파라크린 신호에 대한 응답으로 노이라이트 의 성장을 연구하는 공동 문화 방법

Trowell 형 장기 배양 방법은 치아 발달을 제어하는 복잡한 신호 네트워크를 밝히고 최근에는 지속적으로 성장하는 마우스 앞니의 줄기 세포와 관련된 조절을 연구하는 데 사용되었습니다. 형광 리포터 동물 모델과 라이브 이미징 방법은 치과 줄기 세포와 특정 틈새 미세 환경에 대한 심층 분석을 용이하게합니다.

치아 줄기 세포의 조절 연구를 위한 트로웰형 장기 배양 사용

이 프로토콜은 미세중력에서 아멜로모세포 유사 세포의 배양 및 3D 성장을 통해 길쭉하고 분극된 형태와 에나멜 특이적 단백질 발현을 유지하는 방법을 제시합니다. 미세 중력에서 치주 공학 구조물 및 폐 기관의 배양을위한 배양 조건도 설명됩니다.

미세중력에서 치과 및 호흡기 세포와 장기의 전파

치과 여포에는 상피 인구와 중간 엽 세포가 포함되어 있습니다. 상피 인구는 뚜렷한 배양 배지를 제공함으로써 이질적인 치과 여포 세포 집단으로부터 선택되었다. 상피 세포는 혈청이없는 배지에서 생존하고 식민지를 형성했다.

인간 치과 여포에서 상피 세포의 격리

이 프로토콜은 화학적 발암을 통해 유도된 정상, 전종양 및 편평 세포 암종 병변을 나타내는 쥐 구강-식도 3D 오가노이드를 생성하고 특성화하는 주요 단계를 설명합니다.

3D 오가노이드에서 구강-식도 편평 세포 암종 모델링

생체 외 라이브 이미징은 생체 조직에서 세포 움직임과 상호 작용의 동적 과정을 연구하기 위한 강력한 기술입니다. 여기에서는 배양된 전체 성체 마우스 앞니에서 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하기 위해 이광자 현미경을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.

Ex vivo Live Imaging을 사용하여 마우스 치아 재생 중 세포 분열 및 움직임 조사

이 프로토콜은 인간 만능 줄기세포를 사용하여 혈관 오가노이드를 생성하는 방법을 제시합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포(Human-Induced Pluripotent Stem Cells)에서 혈관 오가노이드 생성

인간 당뇨병 장기 배양 각막에서 아데노바이러스 유전자 치료의 예는 이러한 각막에서 지연된 상처 치유와 현저히 감소된 상피 줄기 세포 마커 발현의 정상화를 위해 제시됩니다. 또한 줄기세포가 풍부한 윤부 상피 배양에서 이 과정의 최적화를 설명합니다.

당뇨병 각막에 대한 아데노 바이러스 유전자 치료 : 인간 장기 배양 각막 및 윤부 상피 세포에 상처 치유에 효과 및 세포 마커의 발현 줄기

학습하세요 인간 치아 유래 오가노이드 배양법을 통해 치아 상피 줄기세포를 확장하고 법랑질 형성 과정을 연구하는 방법을. 이 기술은 치아 재생 의학 및 질병 치료 연구에 활용됩니다.

기계론적 연구 및 재생 요법을 향한 강력한 도구로 인간의 치아에서 오가노이드를 확립

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