Name: 광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 배우세요 광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블의 힘 생성을 정밀 측정하는 방법을. 이 기법은 세포골격 역학 연구에 활용할 수 있는 모듈형 분석법을 제공합니다.

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이 작업은 미시시피 대학교 대학원 학생위원회 연구 펠로우십 (OA), 미시시피 대학교 샐리 맥도넬-바크스데일 아너스 칼리지 (JCW, JER), 보조금 번호 NNX15AH78H (JCW, DNR)의 미시시피 우주 보조금 컨소시엄 및 보조금 번호 848586 (DNR)의 미국 심장 협회.

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

액틴 필라멘트와 상호 작용하는 미오신 앙상블의 역학을 조사하기 위해 형광 이미징과 결합된 광학 핀셋을 사용한 시험관 내 연구가 수행되었습니다. 악틴-미오신 - 액틴 다발은 근육 미오신 II, 번들의 하단 및 커버 슬립 표면의 로다민 액틴, 번들 상단의 488 표지 된 비오틴 액틴 필라멘트를 사용하여 조립되었습니다. 토끼 근육으로부터의 액틴 단백질은 일반 액틴 완충액 (GAB) 및 액틴 중합 완충액 (APB)을 사용하여 중합 및 안정화되었다. GAB 및 APB는 ATP, FC 버퍼 및 TC 버퍼를 사용하여 실험실에서 매일 새로 준비해야 합니다. 근육 미오신 II는 액틴-미오신 - 액틴 샌드위치를 형성하는데 사용되었다. Phalloidin은 액틴 필라멘트의 형광 염색 및 시험관 내 안정화에 사용되었습니다.
미오신 활성은 이전에 공개된46,47과 같...

운동 단백질은 생명에 필수적이며 화학 에너지를 기계적 작업으로 변환합니다 1,2,3. 미오신 모터는 트랙과 유사한 필라멘트를 따라 단계를 밟아 액틴 필라멘트와 상호 작용하며, 액틴-미오신 네트워크의 역학은 근육 수축, 세포 운동성, 세포질 분열 중 수축 고리 및 세포 내부의화물 이동을 수행합니다. 3,4,5,6,7,8 . 미오신은 많은 필수 역할을 하기 때문에 미오신 액틴 네트워크의 기능 장애는 비대성 심근병증(HCM)에서 심장 과수축을 유발하는 미오신 중쇄의 돌연변이와 같은 질병 발병으로 이어질 수 있습니다.9,10,11,12,13,14 . 근육 수축에서 개별 미오신 모터는 AF 4,15,16,17,18의 상대 슬라이딩을 수행하는 데 필요한 기계적 에너지를 제공하기 위해 앙상블로 작동하여 서로 협력합니다. 미오신 모터는 AF 사이에 교차 다리를 형성하고 기계 화학적 주기로 인한 구조적 변화를 사용하여 정렬된 필라멘트17,18,19,20,21의 가시 끝을 향해 집합적으로 이동합니다.
광학 트래핑과 같은 기술을 사용하여 SM 수준에서 정량적 체외 운동성 분석을 개발함으로써 SM 힘 생성 및 스텝 크기 측정을 포함하여 개별 미오신 모터가 어떻게 작동하는지에 대한 전례 없는 세부 정보를 쉽게 수집할 수 있었습니다. 22,23,24,25,26,27,28,29,30 . Finer et al.은 단일 미오신 II 모터23,31의 힘 발생 역학을 조사하기 위해 "3-비드" 또는 "덤벨" 광학 트래핑 분석을 개발했습니다. 근육 미오신 II는 AF를 수축시키기 위해 팀으로 작동하지만 SM 수준에서는 비과정적이기 때문에 광학 트래핑 분석 방향은 고전적인 모터 결합 비드 접근법(32)으로부터 재배열되어야 했습니다. 덤벨 분석을 형성하기 위해, 커버슬립-부착된 비드에 결합된 미오신 모터 위에 AF를 유지하기 위해 2개의 광학 트랩을 사용하였고, 단일 모터에 의해 출력된 힘은 트랩(23) 내의 AF의 이동을 통해 측정되었다.
그러나 SM 힘과 단일 모터 / 단일 필라멘트 분석 방향을 사용하면 myosin II를 포함한 많은 모터 단백질이 단독으로 작동하지 않고 종종 부분의 합으로 기능하지 않기 때문에 시스템 수준 힘 생성에 대한 전체 이미지를 제공하지 않습니다 15,16,17,32,33,34,35,36 . 하나 이상의 필라멘트와 상호 작용하는 하나 이상의 모터를 포함하는 더 복잡한 구조는 미오신 및 액틴 필라멘트의 네트워크(15,32)의 시너지 효과를 더 잘 이해하는 데 필요합니다. 덤벨 분석 방향은 비드에 여러 개의 미오신을 부착하거나 표면에 부착된 미오신 두꺼운 필라멘트를 사용하여 모터가 매달린 AF 4,23,34,37,38,39,40과 상호 작용할 수 있도록 함으로써 작은 앙상블 힘 생성을 조사하는 데 활용되었습니다.
다른 작은 앙상블 분석에는 미오신 모터가 커버슬립 표면에 코팅되고 AF에 결합된 비드가 모터 4,35,36,38,39,40,41,42,43 팀에 의해 생성된 힘을 프로브하는 시험관 내 필라멘트 글라이딩 분석이 포함됩니다. . 이 두 경우 모두 미오신은 단단한 표면(비드 또는 커버슬립)에 결합되어 하나의 AF를 사용합니다. 이러한 경우들에서, 모터들은 자유롭게 움직일 수 없거나 서로 통신할 수 없으며, 근육신이 단단히 결합된 것은 모터들이 sarcomere32에서 함께 동작할 수 있는 순응적이고 계층적인 환경을 반영하지 않는다. 이전 연구에서는 미오신 II가 환경을 감지하고 힘 생성 및 듀티 비율41,44,45와 같은 특성을 변경하여 변화하는 점탄성 또는 모터 집중 조건에 따라 적응할 수 있다고 제안했습니다. 따라서 미오신 II 앙상블 힘 생성의 기계론적 토대에 대한 보다 현실적인 그림을 그리기 위해 모터 통신 및 시스템 준수를 촉진하고 캡처하는 광학 트래핑 분석을 개발할 필요가 있습니다.
여기에서는 두 액틴 필라멘트 사이에 상호 작용하는 여러 개의 미오신 모터로 구성된 액토미오신 다발 또는 샌드위치를 형성하여 시험관 내 계층 구조와 광학 트래핑을 결합하는 방법을 개발했습니다. 이 모듈식 분석 기하학은 분자 및 환경 요인이 앙상블 미오신 힘 생성에 어떻게 영향을 미치는지 직접 조사할 수 있습니다. 또한 이러한 액틴-미오신 앙상블을 통한 힘 생성 메커니즘을 조사하면 근육 수축과 같은 대규모 세포 작업이 분자 수준 9,10,13에서 어떻게 전파되는지 모델링하고 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>액틴 단백질(비오틴): 골격근</td><td>세포골격</td><td>AB07-A</td><td>비오틴화 액틴 단백질</td></tr><tr><td>액틴 단백질, 토끼 골격근</td><td>세포골격</td><td>AKL99-A</td><td>액틴 단백질</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td>Actin 안정제 및 Alexa Fluor 488 염색</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Fisher scientific</td><td>BP413-25</td><td>액틴에 필요 어셈블리 및 미오신 운동성</td></tr><tr><td>Beta-D-glucose</td><td>Fisher scientific</td><td>MP218069110</td><td>형광 이미징 중 광표백을 줄이는 데 사용되는 산소 제거 시스템의 일부</td></tr><tr><td>블로팅 등급 차단제(카제인)</td><td>Biorad</td><td>1706404</td><td>비특이적 결합으로부터 표면을 차단하는 데 사용</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher scientific</td><td>C79500</td><td>염화칼슘은 액틴 미오신 네트워크의 역학에 필요한 제어를 제공합니다</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Fisher scientific</td><td>ICN10040280</td><td>형광 이미징 중 광백화를 줄이는 데 사용되는 산소 제거 시스템의 일부</td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher scientific</td><td>12544C</td><td>플로우 셀을 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fisher 과학</td><td>AC327190010</td><td>완충액 준비</td></tr><tr><td>에 사용에탄올</td><td>Fisher scientific</td><td>A4094</td><td>Regent 커버 슬립 세척에 사용</td></tr><tr><td>포도당 산화 효소</td><td>Fisher scientific</td><td>34-538-610KU</td><td>형광 이미징 중 광 표백을 줄이는 데 사용되는 산소 제거 시스템의 일부</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher scientific</td><td>P217-500</td><td>버퍼 준비에 사용</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher scientific</td><td>P250-1</td><td>커버 슬립을 에칭하고 조정하는 데 사용됩니다. 완충액 pH MgCl</td></tr><tr><td>2</td><td>Fisher scientific</td><td>M33-500</td><td>완충액 준비에 사용</td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>Fisher scientific</td><td>12-544-2</td><td>유동 세포를 만드는 데 사용</td></tr><tr><td>Myosin II 단백질: 토끼 골격근</td><td>세포골격</td><td>MY02</td><td>토끼 골격근에서 분리된 전체 길이 미오신 운동 단백질</td></tr><tr><td>Nanotracker2</td><td>Bruker/JPK</td><td>NT2</td><td>광학 포획 기구</td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td> 시설 커버 슬립 Rhodamine Phalloidin Cytoskeleton PHDR1 Actin 안정제 및 Rhodamine 형광 염색 Streptavidin 구슬의 <td>유리 표면에 액틴 필라멘트의 접착</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>, <tr><td>1 &mu; m</td><td>Spherotech</td><td>SVP-10-5</td><td>광학 트래핑 핸들</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>PR H5121</td><td>완충액 준비에 사용</td></tr></tbody></table>

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

Probing Myosin Ensemble Mechanics in Actin Filament Bundles Using Optical Tweezers

미오신은 ATP를 가수분해하여 액틴 필라멘트(AF) 트랙을 따라 이동하는 운동 단백질이며 운동성 및 근육 수축과 같은 세포 과정에 필수적입니다. 힘 생성 메커니즘을 이해하기 위해 미오신 II는 단일 분자 (SM) 수준과 광학 트래핑과 같은 생물 물리학 적 방법을 사용하는 시험관 내 모터 팀으로 조사되었습니다.
이 연구는 미오신 힘 생성 거동이 3 비드 배열의 단일 분자 수준에서 글라이딩 배열의 단단한 비드 또는 커버 슬립 표면에서 함께 작동하는 모터 그룹으로 이동할 때 크게 다를 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 이러한 분석 구조는 세포 내에서와 같이 점탄성 구조 계층 내에서 미오신의 그룹 역학을 평가하는 것을 허용하지 않습니다. 우리는 여러 액틴 필라멘트와 상호 작용하는 미오신 앙상블에 의한 힘 생성 메커니즘을 조사하기 위해 광학 핀셋을 사용하는 방법을 개발했습니다.
이러한 액토미오신 번들은 모터 통신 및 앙상블 힘 출력을 캡처하는 계층적이고 규정을 준수하는 환경에서 조사를 용이하게 합니다. 분석의 사용자 정의 가능한 특성을 통해 실험 조건을 변경하여 미오신 앙상블, 액틴 필라멘트 번들 또는 주변 환경에 대한 수정이 어떻게 다른 힘 출력을 초래하는지 이해할 수 있습니다.

액토미오신 번들 시스템을 포함하는 플로우 셀은 현미경 슬라이드와 양면 접착 테이프로 만든 채널로 분리된 에칭된 커버슬립으로 구성된 표준 설계입니다(그림 1). 그런 다음 분석은 프로토콜에 설명된 대로 단계적 소개를 사용하여 커버슬립에서 구축됩니다. 최종 분석은 주형 로다민 표지 액틴 필라멘트로 구성됩니다. 원하는 미오신 농도 (1 μM이 도 2 및 도 3의 대표적인 결과를 위해 사용되었다); 비오티닐화, 알렉사 플루오르 488-표지된 액틴 필라멘트; 1 μm 스트렙타비딘 비드; 산소 소거 시스템; ATP; 및 APB 버퍼. 유동 셀당 여러 개의 다발이 형성될 것이며, 위에서 설명한 액틴 농도는 원치 않는 상호 작용을 방지하기 위해 다발 사이에 적절한 간격을 제공합니다. 이는 또한 플로우 셀당 여러 힘 측정을 쉽게 획득하여 데이터 수집 효율성을 높일 수 있습니다. 힘 프로...

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

Myosins are motor proteins that hydrolyze ATP to step along actin filament (AF) tracks and are essential in cellular processes such as motility and muscle ...

이 프로토콜을 사용하여 액틴 거동을 조사하는 것은 사용자가 광학 트래핑의 정밀도를 사용하여 모터 단백질 앙상블 역학을 조사할 수 있기 때문에 중요합니다. 이 기술의 주요 장점은 많은 광학 트래핑 실험에 사용되는 기존의 단일 모터 단일 필라멘트 방향과 달리 액틴 구조 계층 구조 내에서 미오신 역학을 측정 할 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 사용자가 선택한 계층적 세포골격 시스템에 대한 분석을 사용자 정의할 수 있는 모듈식 특성입니다.시작하려면 양면 접착 테이프 두 장을 현미경 슬라이드 중앙에 서로 3-4mm 간격으로 붙입니다. 그런 다음 슬라이드 가장자리에 매달려있는 여분의 테이프를 찢거나 잘라냅니다. 다음으로, 현미경 슬라이드의 장축에 수직인 테이프 위에 PLL 코팅 커버 슬립을 추가하여 채널을 형성합니다.작은 튜브를 사용하여 커버 슬립을 테이프와 현미경에 압축하고 테이프가 투명해질 때까지 완전히 밀어 테이프에 기포가 생기지 않도록 하여 흐름 채널에서 누출이 발생할 수 있습니다. 희석된 로다민 액틴 15마이크로리터를 PLL 플로우 셀에 추가하고 플로우 셀을 통해 초과 용액을 흡수하되 플로우 채널이 건조되지 않도록 합니다. 이어서, 습도 챔버에서 10분 동안 배양한다.다음으로, 액틴 중합 완충액에 밀리리터 카제인 용액 당 1 밀리그램을 준비하고 후속 성분의 비특이적 결합을 방지하기 위해 15 마이크로 리터의 용액을 첨가한다. 그런 다음 습도 챔버에서 5 분 동안 배양하십시오. 그 후, 준비된 비오티닐화된 액틴과 비드 현탁액에 원하는 농도의 미오신을 넣고 피펫 팁으로 부드럽게 저어줍니다.그런 다음 즉시 원하는 미오신 농도와 함께 15 마이크로리터의 현탁액을 유동 세포에 추가하고 20분 동안 배양합니다. 다음으로, 이미징 및 광학 트래핑 실험 중 증발을 방지하기 위해 매니큐어로 플로우 셀의 열린 끝을 밀봉합니다. 시스템이 준비되면 화면 왼쪽 하단 모서리에 있는 레이저 전원 버튼을 사용하여 레이저를 50밀리와트로 켜고 30분 동안 안정화시킵니다.소프트웨어 내에서 조명, 카메라, 대물렌즈 및 스테이지 이동 버튼을 순차적으로 클릭하여 실험 중에 보고 조작할 수 있도록 해당 창을 불러옵니다. On/Off 버튼을 클릭하여 현미경 조명을 켜고 막대를 클릭하고 오른쪽 끝까지 드래그하여 최대 전력으로 설정합니다. 샘플 영역을 열고 현미경 스테이지에서 샘플 홀더를 제거합니다.그런 다음 플로우 셀을 추가하고 금속 샘플 홀더로 고정하여 커버 슬립이 바닥에 있는지 확인합니다. 그런 다음 30마이크로리터의 RO 물을 바닥 대물렌즈 중앙에 추가하고 샘플 스테이지를 다시 삽입합니다. 그런 다음 물 비드가 덮개 슬립에 닿을 때까지 조종기의 L2를 사용하여 하단 대물렌즈를 들어 올립니다.그런 다음 조종기의 R2를 사용하여 플로우 셀까지의 거리의 약 절반에 도달할 때까지 상단 대물렌즈를 내립니다. 그런 다음 상단 대물렌즈 바로 아래의 플로우 셀 상단에 170마이크로리터의 RO 물을 추가하고 물의 표면 장력을 깨고 메니스커스를 형성할 때까지 상단 대물렌즈를 내립니다. 그런 다음 조종기의 화살표 패드를 사용하여 흐름 채널에 인접한 테이프의 가장자리에 도달할 때까지 현미경 스테이지를 이동한 다음 샘플 도어를 닫습니다.화면의 목표 창을 사용하여 테이프의 가장자리를 가져오고 위쪽 화살표를 클릭하여 레이저 목표라는 아래쪽 목표를 위로 가져오고 화면 컨트롤을 사용하여 아래쪽 화살표를 클릭하여 위쪽 목표를 가져와 초점을 맞춥니다. 플로팅 비드를 찾아 트랩 셔터 버튼을 클릭하여 트랩하면 셔터가 열리고 트래핑 레이저가 샘플에 닿을 수 있습니다. 그런 다음 화면에서 트랩 커서를 클릭하고 드래그하여 트래핑 레이저의 위치를 이동합니다.트랩되면 보정 버튼을 클릭하여 비드를 보정합니다. 그런 다음 설정을 클릭하고 소프트웨어 창의 왼쪽 하단에 있는 비드의 직경과 스테이지의 온도를 입력합니다. 그런 다음 트랩 1을 클릭한 다음 X 신호를 클릭하고 실행을 클릭하여 코너 주파수 피팅을 수행합니다.그런 다음 창 내에서 클릭하고 드래그하여 기능 맞춤을 최적화합니다. 그런 다음 민감도 및 강성 값에 사용을 클릭한 다음 값을 수락합니다. 그런 다음 창을 닫습니다.커버 슬립 표면에서 AF에 결합된 비드를 검색하고 두 형광 AF를 공동 국소화하여 액토미오신 번들을 찾습니다. 백색 광원을 켜고 적절한 필터 큐브를 사용하여 터렛을 돌려 각 액틴 필라멘트를 이미지화합니다. 확인되면 트랩 셔터 버튼을 클릭하여 번들의 상단 필라멘트에 부착된 비드를 트랩합니다.그런 다음 화면 컨트롤을 사용하여 오실로스코프 버튼을 클릭하여 데이터를 기록합니다. 데이터를 기록하지 않고 측정값을 시각화하려면 시작을 클릭한 다음 자동 저장을 클릭하여 모든 데이터를 저장합니다. 측정값을 기록하려면 기록 시작을 클릭하고 드롭다운 메뉴 X 신호 또는 Y 신호에서 선택하여 실시간으로 시각화할 데이터를 선택합니다.구성된 시험관 내 액틴 구조 계층 구조 내에서 힘을 생성하는 골격 미오신 모터의 힘 추적은 2분에서 5분에 걸쳐 고원에 도달할 때까지 꾸준한 상승력을 나타냅니다. 그러나, 임의의 순 힘 및 힘 흔적을 생성하지 않는 일부 액토 미오신 다발은 기준선 노이즈로 나타나거나 낮은 농도의 모터 또는 필라멘트의 불리한 평행 방향으로 인해 90 초 동안 힘의 실질적인 순 증가를 나타내지 않는 것으로 관찰된다. 이 프로토콜 개발은 아래에서 위로 세포 분열 및 근육 수축과 같은 대규모 세포 작업을 모델링하는 데 도움이 될 보다 복잡한 시험관 내 세포골격 분석을 구축하는 길을 열 것입니다.

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이것은 목적, 운영, 그리​​고 소설 중력이 분석기의 결과를 보여주는 대표을 단계별로 안내합니다.

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