Name: 성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 인간 폐 오가노이드 및 근위 분화 확립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-23T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: 배우세요 인간 폐 오가노이드 배양 및 근위 분화 프로토콜을 사용하여 성숙한 기도 상피를 재구성하는 방법입니다. 이 기술은 호흡기 생물학 및 질병 연구에 활용됩니다.

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우리는 공초점 이미징 및 유세포 측정에 도움을 주신 PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, Hong Kong에 감사드립니다. 이 작업은 식품 보건국의 건강 및 의료 연구 기금 (HMRF, 17161272 및 19180392)의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. 연구 보조금위원회의 일반 연구 기금 (GRF, 17105420); Health@InnoHK, 혁신 기술위원회, 홍콩 특별 행정 구역 정부.

본원에 기술된 인간 조직을 이용한 모든 실험은 홍콩 대학/병원 당국 홍콩 서부 클러스터(UW13-364 및 UW21-695)의 기관 검토 위원회에 의해 승인되었다. 조직 수집 전에 환자로부터 정보에 입각한 동의를 얻었다.
1. 인간 폐 오가노이드의 유도
<ol><li>실험자료의 제조<ol>
<li>고급 DMEM/F12 배지에 2mM 글루타민, 10mM HEPES, 100U/mL의 페니실린 및 100μg/mL의 스트렙토마이신을 보충하여 기본 배지를 준비합니다.</li>
		<li>기본 배지에 10% R-스폰딘 1 컨디셔닝 배지, 10% 노긴 컨디셔닝 배지, 1x B27 보충물, 1.25 mM N-아세틸시스테인, 10 mM 니코틴아미드, 5 μM의 Y-27632, 500 nM의 A-83-01, 1 μM의 SB202190, 5 ng/mL의 섬유성 성장 인자(FGF)-7, 20 ng/mL의 FGF-10 및 100 μg/mL의 프리모신을 보충함으로써 인간 폐 오가노이드 확장 배지를 제조하였다( 물질 표 참조). 참고: R-스폰딘 1 및 노긴 컨디셔닝 배지는 상업적 재조합 R-스폰딘 1(500 ng/mL) 및 노긴(100 ng/mL)으로 대체될 수 있다.</li>
		<li>24-웰 현탁 배양 플레이트를 세포 배양 배양기에서 예열한다. 표준 세포 배양 인큐베이터를 사용하여 37°C에서 5%CO2 및 가습 분위기로 한다. 지하 매트릭스를 4°C 냉장고에서 해동시킨다. 실험 중에 지하 매트릭스와 배양 배지를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>3D 오가노이드 배양을 위한 인간 폐 조직으로부터의 세포 분리<ol>
<li>다양한 질병으로 인해 외과 적 절제술을받는 환자로부터 약 0.5cm 크기의 갓 절제된 인간 폐 조직을 조달하십시오. 폐 조직을 실온에서 30mL의 기초 배지로 운반하고 가능한 한 빨리 생물안전 후드 내부로 처리하십시오.</li>
		<li>폐 조직을 10cm 세포 배양 접시에 멸균 메스로 작은 조각 (0.5-1 mm)으로 다듬습니다. 조직 조각을 15 mL 원심분리 튜브에서 차가운 기저 배지 10 mL로 세척하고, 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하였다.</li>
		<li>상층액을 버리고 펠렛을 콜라게나제가 보충된 8mL의 기본 배지에 2mg/mL의 최종 농도로 재현탁시킨다. 튜브를 37°C에서 30-40분 동안 120 rpm으로 흔들어 조직 조각을 소화시켰다.</li>
		<li>20x 상하로 피펫팅하여 10 mL 혈청학적 피펫을 사용하여 소화된 조직 조각을 전단한다. 100 μm 스트레이너를 50 mL 원심분리 튜브에 적층하고 현탁액을 여과한다.</li>
		<li>기저 배지로 스트레이너 상의 조직 조각을 회수하여 15 mL 원심분리 튜브로 옮긴 다음, 두 번째 전단 및 여과를 실시한다. 추가적인 전단-필터링은 1x-2x를 수행하여 더 많은 세포를 분리할 수 있으며, 특히 조직의 작은 조각(예를 들어, <0.5cm)이 조달될 때 더욱 그러하다.</li>
		<li>FBS를 2%의 최종 농도로 유동관에 첨가하여 소화를 종료하고, 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하였다.</li>
		<li>세포 펠릿을 10 mL의 기초 배지에 재현탁시키고, 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하였다. 상층액을 버리십시오.</li>
		<li>(선택 사항) 펠릿 내에 많은 적혈구가 보이면 (펠렛의 색상으로 추정), 세포 펠릿을 적혈구 용해 완충액 2 mL에 재현탁시키고 실온에서 5 분 동안 인큐베이션한다. 이어서, 10 mL의 기초 배지를 튜브에 첨가하고, 4°C에서 5분 동안 400 x g 에서 원심분리하였다. 상층액을 버리십시오.</li>
		<li>펠릿을 차가운 지하실 매트릭스에 재현탁하고 얼음 위에 보관하십시오. 약 0.5 cm 크기의 폐 조직으로부터 회수된 세포를 위한 80-160 μL의 기저 매트릭스를 추가; 양은 2-4 방울을 종설하기에 충분합니다.</li>
		<li>40 μL의 현탁액을 미리 가온된 24-웰 현탁액 배양 플레이트의 각 웰에 분주한다. 배양 플레이트를 37°C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 지하실 매트릭스가 응고되어 물방울을 형성하게하십시오.</li>
		<li>5 nM의 헤레굴린 베타-1이 보충된 500 μL의 인간 폐 오가노이드 확장 배지를 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>3일마다 매체를 새로 고칩니다. 물방울을 그대로 유지하면서 오래된 매체를 제거하고 조심스럽게 신선한 매체를 추가하십시오. 10-14 일 동안 배양 한 후 오가노이드를 통과시킵니다. 헤레굴린 베타-1은 첫 번째 계대 전에 초기 배양물에서만 사용한다.</li>
		<li>현미경으로 오가노이드를 관찰하여 오가노이드가 매우 높은 세포 밀도로 매립되지 않도록하십시오. 액적이 지나치게 높은 세포 밀도로 인해 분해되면, 더 높은 부피의 지하실 매트릭스를 가진 오가노이드와 세포를 회수하고 다시 임포하여 더 낮고 바람직한 세포 밀도로 더 많은 물방울을 만듭니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 인간 폐 오가노이드의 확장
<ol><li>파스퇴르 피펫의 끝을 분젠 버너와 같은 화염에 태워 파스퇴르 피펫을 준비하여 개구부를 직경 1.5mm에서 약 1.0mm로 좁힙니다. 피펫을 식히고 오토클레이빙하여 살균하십시오. 피펫을 기본 배지로 적셔 기계적 전단 중 세포 부착 및 손실을 피하십시오.</li>
	<li>기계적 전단이 있는 폐 오가노이드 통과<ol>
<li>1 mL 팁과 피펫을 위아래로 사용하여 위에서 얻은 물방울을 부수십시오. 이어서, 배지와 함께 오가노이드를 15 mL 원심분리 튜브로 옮기고 차가운 기저 배지로 부피를 10 mL로 조정한다. 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리 후 상층액을 버리십시오.</li>
		<li>오가노이드를 차가운 기저 배지 10mL로 다시 한 번 씻으십시오. 오가노이드를 차가운 기저 배지 2mL에 재현탁하십시오. 오가노이드를 파스퇴르 피펫으로 작은 조각으로 전단하기 위해 위아래로 피펫하십시오.</li>
		<li>총 부피가 10 mL인 기초 배지로 보충하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하였다. 오가노이드 단편을 1:3 내지 1:5 확장을 가능하게 하기에 충분한 차가운 지하실 매트릭스로 재현탁시킨다. 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>40 μL의 오가노이드 현탁액을 미리 가온된 24-웰 플레이트의 각 웰에 놓는다. 배양 플레이트를 37°C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 지하실 매트릭스가 굳어지게하십시오.</li>
		<li>500 μL의 폐 오가노이드 확장 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 3일마다 매체를 새로 고칩니다. 1 : 3에서 1 : 5의 비율로 2 주마다 오가노이드를 통과하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>트립신화를 통한 폐 오가노이드 통과 참고 : 트립신화는 파스퇴르 피펫을 사용하여 폐 오가노이드를 작은 조각으로 전단하기가 어렵거나 오가노이드의 크기가 매우 가변적이거나 후속 실험에서보다 균일 한 크기의 오가노이드가 필요할 때 선호됩니다.<ol>
<li>단계 2.2.1에 나타낸 바와 같이 폐 오가노이드를 수확한다. 오르가노이드를 해리 효소 1 mL에 재현탁시키고, 3-5분 동안 37°C 수조에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>튜브에 기본 배지 1 mL를 첨가하십시오. 파스퇴르 피펫을 사용하여 오가노이드를 위아래로 작은 조각으로 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 전단하십시오. 4x 배율로 현미경으로 오가노이드 조각의 크기를 확인하십시오. 그런 다음 40 μL의 FBS를 첨가하여 소화를 종료하십시오. 참고 : 실험 배열에 따라 현미경으로 오가노이드 단편의 크기를 결정하십시오. 실험에 더 균일 한 크기의 오가노이드 또는 오가노이드가 필요한 경우 오가노이드를 더 작은 조각 또는 단일 세포로 전단하십시오. 그런 다음 오가노이드가 실험 준비가되기 전에 더 오랜 시간, 아마도 3 주가 걸립니다.</li>
		<li>최종 부피가 10 mL인 기저 배지로 충전하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하였다. 1:5-1:10의 비율로 통과하기에 충분한 부피로 차가운 지하실 매트릭스에 오르가노이드 조각을 재현탁하십시오. 얼음 위에 보관하십시오.</li>
		<li>40 μL의 오가노이드 현탁액을 미리 가온된 24-웰 플레이트의 각 웰에 놓는다. 배양 플레이트를 37°C에서 10-15분 동안 인큐베이션한다. 지하실 매트릭스가 굳어지게하십시오.</li>
		<li>웰 당 500 μL의 폐 오가노이드 확장 배지를 보충하고 세포 배양 인큐베이터에서 배양한다. 3일마다 확장 매체를 새로 고칩니다. 2-3 주 후에 오가노이드를 통과하십시오. 참고: 약 100개의 오가노이드가 지하 매트릭스의 40μL 물방울 내에 장착됩니다. 폐 오가노이드는 일반적으로 상대적으로 높은 세포 밀도로 더 잘 자랍니다. 방울이 분해되거나 지나치게 높은 세포 밀도로 인해 성장하는 오가노이드가 함께 부착되면 더 낮은 세포 밀도로 오가노이드를 다시 내장하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 성숙한 기도 오가노이드를 생성하는 근위 분화
<ol><li>공기 액체 계면 기본 배지에 1x 공기 액체 계면 보충물, 1x 공기 액체 계면 유지 보조 보충제, 4 μg/mL의 헤파린, 1 μM의 하이드로코르티손, 10 μM의 Y-27632 및 10 μM의 DAPT를 보충하여 근위 분화 배지 (PD 배지)를 준비하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>3D 기도 오가노이드<ol>
<li>폐 오가노이드를 기계적 전단을 통해 통과 후 7-10 일 동안 팽창 배지에서 배양하십시오. 확장 매체를 PD 매체로 교체하십시오. 오가노이드를 세포 배양 인큐베이터에서 14일 동안 PD 배지에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>PD 배지를 각 웰에 버리십시오. 세포 용해물 완충액을 추가하여 RNA 추출 및 RT-qPCR 분석법에 의한 세포 유전자 발현의 검출을 위해 분화된 기도 오가노이드를 수확한다.</li>
		<li>대안적으로, 오가노이드를 단일 세포로 분리하기 위해 10 mM EDTA를 첨가한 후 37°C에서 60분 동안 오가노이드를 인큐베이션하고, 이어서 세포 집단을 조사하기 위해 유세포 분석을 수행하였다. 오가노이드는 다양한 실험 조작을 할 준비가되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>2D 기도 오가노이드<ol>
<li>2D 분화 배양을 위해 충분한 3D 폐 오가노이드를 준비하십시오. 총 1.3 x 10 5 및 4.5 x 105 셀이 각각 24-웰 투과성 지지 인서트 및 12-웰 투과성 지지 인서트에 요구된다.</li>
		<li>3D 폐 오가노이드가 2주 동안 팽창 배지에서 성장한 후, 오가노이드를 단일 세포로 소화하고 24-웰 및 12-웰 인서트에 시드하여 2D 기도 오가노이드를 생성한다.</li>
		<li>예비-삽입물을 세포 배양 인큐베이터에서 하룻밤 동안 기본 배지와 함께 인큐베이션한다. 250 μL 및 500 μL의 기초 배지를 각각 24-웰 플레이트의 상부 및 하부 챔버에 첨가한다. 12-웰 플레이트의 경우, 상부 및 하부 챔버에 각각 500 μL 및 1,000 μL의 기초 배지를 첨가한다.</li>
		<li>단계 2.2.1에 기재된 바와 같이 3D 폐 오가노이드를 수확한다. 오가노이드를 해리 효소 1 mL로 재현탁시키고, 3-5분 동안 37°C 수조에서 인큐베이션한다.</li>
		<li>튜브에 기본 배지 1 mL를 첨가하십시오. 오가노이드를 파스퇴르 피펫으로 단일 세포로 전단하고 현미경으로 세포를 확인하기 위해 위아래로 피펫을 만듭니다. 그런 다음 40 μL의 FBS를 첨가하여 소화를 종료하십시오.</li>
		<li>세포를 40 μm 스트레이너를 통해 50 mL 원심분리 튜브에 여과한다. 여과된 세포 현탁액을 15 mL 튜브로 옮긴다. 총 부피가 10 mL인 기저 배지로 충전하고, 4°C에서 5분 동안 300 x g 에서 원심분리하였다.</li>
		<li>24 액적(40 μL)으로부터 수집된 펠렛을 액적 내의 세포 밀도에 따라 1-2.5 mL의 폐 오가노이드 확장 배지에 재현탁시킨다. 현미경으로 셀 카운터가 있는 세포 수를 계산합니다. 세포 농도를 1.3 x 106/mL(24웰 인서트의 경우) 또는 9 x 105/mL(12웰 인서트의 경우)로 조정합니다.</li>
		<li>상단 및 하단 챔버에서 기본 배지를 제거하십시오. 500 μL 및 1,000 μL의 팽창 배지를 각각 24-웰 인서트 및 12-웰 인서트의 바닥 챔버에 첨가한다. 단계 3.3.7에서 제조된 세포 현탁액 100 μL 및 500 μL의 시드를 각각 24-웰 인서트 및 12-웰 인서트의 정점 챔버 상에 상으로 한다.</li>
		<li>세포 배양 배양기에서 2일 동안 배양한다. 팽창 배지를 플레이트의 정점 및 바닥 챔버 모두에서 PD 배지로 교체하십시오. 오가노이드를 세포 배양 인큐베이터에서 14일 동안 인큐베이션하고 3일마다 PD 배지를 리프레시한다. 참고: 이동성 섬모는 PD 배지에서 배양한 후 7일째부터 현미경으로 3D 및 2D 오가노이드에서 식별할 수 있습니다. PD 배지에서 분화 배양 14일 후, 기도 오가노이드는 다양한 실험 조작을 위해 성숙된다.</li>
		<li>17에 기술된 표준 프로토콜에 따라 전기 저항 측정 시스템을 사용하여 격일로 상피 전기 저항(TEER)을 측정한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
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<li>Chua, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+luminal+epithelial+progenitors+can+generate+prostate+organoids+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture.</a> Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).</li>
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<li>Groppe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+BMP+signalling+inhibition+by+the+cystine+knot+protein+Noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin.</a> Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).</li>
<li>Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signaling+and+cellular+dynamics+during+regeneration+of+airway+epithelium+from+basal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors.</a> Development. 143 (5), 764-773 (2016).</li>
<li>Mou, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+SMAD+signaling+inhibition+enables+long-term+expansion+of+diverse+epithelial+basal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells.</a> Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).</li>
<li>Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGFR2+is+required+for+airway+basal+cell+self-renewal+and+terminal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation.</a> Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).</li>
<li>Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+in+immunological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Organoids in immunological research.</a> Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).</li>
<li>Drost, J., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+applications+of+adult+stem+cell-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Translational applications of adult stem cell-derived organoids.</a> Development. 144 (6), 968-975 (2017).</li>
<li>Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+modeling+in+stem+cell-derived+3D+organoid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems.</a> Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+bat+and+human+intestinal+organoids+by+SARS-CoV-2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2.</a> Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).</li>
<li>Salahudeen, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+identification+and+SARS-CoV-2+infection+in+human+distal+lung+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids.</a> Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).</li>
<li>Han, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+SARS-CoV-2+inhibitors+using+lung+and+colonic+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids.</a> Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).</li>
<li>Mykytyn, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+entry+into+human+airway+organoids+is+serine+protease-mediated+and+facilitated+by+the+multibasic+cleavage+site%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site.</a> eLife. 10, 64508(2021).</li>
<li>Jacob, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+neural+cells+and+brain+organoids+reveal+SARS-CoV-2+neurotropism+predominates+in+choroid+plexus+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium.</a> Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).</li>
<li>Lamers, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+productively+infects+human+gut+enterocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes.</a> Science. 369 (6499), 50-54 (2020).</li>
<li>Mallapaty, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mini+lungs+and+other+organoids+helping+to+beat+COVID%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mini lungs and other organoids helping to beat COVID.</a> Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).</li>
</ol>

J. Z., C.L., 및 M.C.C.는 기도 오가노이드의 특허에 발명가로서 열거되어 있다(공개번호: US-2021-0207081-A1). 다른 저자들은 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

인간 기도는 의사 층화 된 섬모 상피라고도 알려진 기도 상피와 줄 지어 있습니다. 상부 기도 상피의 주요 세포 유형은 기도에서 점액과 흡입된 입자를 배출하기 위해 정수리 섬모의 조율된 이동을 가능하게 하는 섬모 세포, 점액을 생산하고 분비하는 잔 세포, 기저막을 늘어서서 재생에 연루된 기저 세포이다. 세기관지와 같은 작은 기도에서, 입방체 기도 상피는 분비 클럽 세포를 포함하고 상부 기도 영역에서보다 더 적은 섬모 세포를 함유한다. 우리는 인간 폐 조직의 상피 줄기 세포로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하는 강력한 프로토콜을 기술합니다. 이들 인간 폐 오가노이드는 팽창 배지에서 유지되고 높은 안정성으로 1년 이상 연속적으로 계대된다. 확장 배지에서 주요 성장 인자는 R-스폰딘, Wnt 작용제20; 및 BMP 신호전달21의 억제제인 노긴, 뿐만 아니라 FGF7 및 FGF10. 선행 연구는 호흡기 상피22,23,24<...

오가노이드는 장기 발달의 시험관 내 모델링과 생물학 및 질병 연구를위한 강력하고 보편적 인 도구가되었습니다. 성장 인자 정의 배양 배지에서 배양하는 경우, 다양한 장기로부터의 성체 줄기 세포 (ASC)는 3차원 (3D)으로 확장될 수 있고 오가노이드라고 불리는 다중 세포 유형으로 구성된 장기 유사 세포 클러스터로 자기조립될 수 있다. 클레버즈의 실험실은 2009 년 1,2 년에 최초의 ASC 유래 오가노이드 인 인간 장내 오가노이드의 유도를보고했다. 그 후, ASC 유래 오가노이드는 전립선 3,4, 간 5,6, 위 7,8,9, 췌장 10, 유선 11 및 폐 12,13을 포함한 다양한 인간 장기 및 조직에 대해 확립되었다. . 이들 ASC 유래 오가노이드는 천연 장기의 중요한 세포, 구조적, 기능적 특성을 유지하고, 장기 확장 배양물에서 유전적 및 표현형 안정성을 유지하였다(14,15).
오가노이드는 또한 배아 줄기 (ES) 세포 및 유도 만능 줄기 (iPS) 세포 (16)를 포함하는 만능 줄기 세포 (PSC)로부터 유래될 수 있다. PSC 유래 오가노이드는 그들의 설립을 위해 장기 발달의 메커니즘을 이용하는 반면, ASC는 생리적 인 조직 자체 재생 또는 조직 복구 중에 줄기 세포 틈새를 모방하는 조건을 재건함으로써 오가노이드를 형성하도록 강요 될 수 있습니다. PSC 유래 오가노이드는 ASC 유래 오가노이드의 비교 가능한 성숙 수준에 도달 할 수는 없지만 발달 및 유기 발생을 탐구하는 데 유리한 모델입니다. PSC 유래 오가노이드의 태아와 유사한 성숙 상태 및 이러한 오가노이드를 확립하기위한 복잡성은 성숙한 조직에서 생물학 및 병리학을 연구하기위한 광범위한 적용을 실질적으로 방해합니다.
코에서 말단 세기관지까지 인간의 호흡기는 기도 상피(pseudostratified ciliated epithelium)라고도 불리우며, 이는 네 가지 주요 세포 유형, 즉 섬모 세포, 잔 세포, 기저 세포 및 클럽 세포로 구성됩니다. 우리는 Clevers의 실험실12,13과 협력하여 인간 폐 조직에서 ASC 유래 인간 폐 오가노이드를 설립했습니다. 이들 폐 오가노이드는 일 년 이상 동안 확장 배지에서 연속적으로 확장되고; 정확한 지속 기간은 다른 기증자로부터 얻은 다른 오가노이드 라인에 따라 다릅니다. 그러나, 천연 기도 상피와 비교하여, 이러한 장기 팽창성 폐 오가노이드는 인간 기도의 주요 세포 집단인 섬모 세포가 이들 폐 오가노이드에서 과소 대표되기 때문에 충분히 성숙하지 않다. 따라서, 우리는 근위 분화 프로토콜을 개발하고기도 상피를 거의 생리적 수준으로 형태학적으로 그리고 기능적으로 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성했습니다.
여기서 우리는 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하기 위해 근위 분화를 유도하는 비디오 프로토콜을 제공한다.

<table><tbody><tr><td><폐 오가노이드 배양용 강력>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>12634010-A8301</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500nM</td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>1x</td></tr><tr><td>Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2)</td><td>Trevigen</td><td>3533-010-0</td><td>70-80%</td></tr><tr><td>FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>20 ng/mL</td></tr><tr><td>FGF-7</td><td>Peprotech</td><td>100-19</td><td>5 ng/mL</td></tr><tr><td>GlutaMAX (글루타민)</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>1x</td></tr><tr><td>HEPES 1M</td><td>Invitrogen</td><td>15630-056</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Heregulin &beta;-1</td><td>Peprotech</td><td>100-03</td><td>5 nM</td></tr><tr><td>N-아세틸시스테인</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>1.25 mM</td></tr><tr><td>니코틴아미드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N0636</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Noggin (조건부 매체)</td><td>집에서 만든</td> <td>-</td><td>10x</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신(10,000 U/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>1x</td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>Rspondin1 (조건부 매체)</td><td>집에서 만든</td> <td>-</td><td>10x</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7067</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>토크리스</td><td>1254</td><td>5 &마이크로; M</td></tr><tr><td>Proximal 분화 매체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DAPT</td><td>Tocris</td><td>2634</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>헤파린 용액</td><td>StemCell Technology</td><td>7980</td><td>4 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>하이드로코르티손 원액</td><td>StemCell Technology</td><td>7925</td><td>1 &micro; M</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 10X 보충제</td><td></td><td></td><td>공기 액체 인터페이스 보충제</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 기초 매체</td><td>StemCell 기술</td><td>05001</td><td>공기 액체 인터페이스 기초 매체</td></tr><tr><td>PneumaCult-ALI 유지 보수 보충제</td><td></td><td></td><td>공기 액체 인터페이스 유지 보수 보충제</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td>10 &micro; M</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biological safety cabinet</td><td>Baker</td><td>1-800-992-2537</td><td></td></tr><tr><td>Carl Zeiss LSM 780 or 800</td><td>Zeiss</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>42093483</td><td></td></tr><tr><td>실체 현미경</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX31SF</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5418BG040397</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫</td>, <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td>, <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEN black 또는 ZEN blue 소프트웨어</td><td>, Zeiss</td><td></td><td>분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Consumables</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>12mm Trans-well</td><td>StemCell 기술</td><td>#38023</td><td></td></tr><tr><td>12웰 세포 배양 플레이트</td><td>Cellstar</td><td>665970</td><td></td></tr><tr><td>15- 및 50ml 코니컬 튜브</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L6BF5Z8118</td><td></td></tr><tr><td>24웰 세포 배양 플레이트</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>6.5mm 트랜스웰</td><td>StemCell Technology</td><td>#38024</td><td></td></tr><tr><td>의료용 주사기 필터 장치, 0.22 &마이크로; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGPR33RB</td><td></td></tr><tr><td>Microfuge tubes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>TFLR140-200-Q21190531</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 유리</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>22-378893</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫(5ml, 10ml, 25ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BA08003, 08004, 08005</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11034</td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티-랫 Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A11007</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-사이토케라틴 5</td><td>Abcam</td><td>ab128190</td><td></td></tr><tr><td>마우스 Anti-FOX J1</td><td>Invitrogen</td><td>14-9965-82</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-뮤신 5AC</td><td>Abcam</td><td>ab3649</td><td></td></tr><tr><td>마우스 안티-베타;-튜불린 4</td><td>시그마</td><td>T7941</td><td></td></tr><tr><td>토끼 안티-p63</td><td>Abcam</td><td>ab124762</td><td></td></tr><tr><td>쥐 항 자궁 글로빈 / CC-10</td><td>R & D Systems</td><td>MAB4218-SP</td><td></td></tr><tr><td>기타 시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Select Enzyme (10X)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1217701</td><td>해리 효소</td></tr></tbody></table>

성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 인간 폐 오가노이드 및 근위 분화 확립

Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids

인간 호흡 상피의 강력한 시험관 내 모델의 부족은 호흡기의 생물학 및 병리학에 대한 이해를 방해합니다. 우리는 폐 조직의 성체 줄기 세포로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고 성숙한 기도 오가노이드를 생성하기 위해 근위 분화를 유도하는 정의된 프로토콜을 기술한다. 폐 오가노이드는 높은 안정성으로 1 년 이상 연속적으로 확장되는 반면, 분화 된기도 오가노이드는 형태 학적으로나 기능적으로 인간의 기도 상피를 거의 생리적 수준으로 시뮬레이션하는 데 사용됩니다. 따라서, 우리는 인간기도 상피의 강력한 오가노이드 모델을 확립합니다. 폐 오가노이드와 분화 된기도 오가노이드의 장기간 확장은 안정적이고 재생 가능한 공급원을 생성하여 과학자들이 배양 접시에서 인간기도 상피 세포를 재구성하고 확장 할 수있게합니다. 인간 폐 오가노이드 시스템은 바이러스-숙주 상호작용 연구, 약물 테스트 및 질병 모델링을 포함한 다양한 응용을 위한 독특하고 생리활성 시험관내 모델을 제공한다.

이 프로토콜은 높은 성공률을 가진 인간 폐 오가노이드의 유도를 가능하게 한다. 신선한 인간 폐 조직은 작은 조각으로 다진 다음 콜라게나제로 분해됩니다. 생성된 단일 세포는 기저 매트릭스에 포매되고 상피 줄기 세포의 증식을 위한 틈새 인자의 칵테일로 보충된 폐 오가노이드 확장 배지에서 배양된다(단계 1.1.2). 도 1 은 환원 성장인자 기저막 매트릭스 타입 2에 포매된 갓 분리된 폐 세포의 현미경 사진을 도시한다(BME; 그림 1A, 왼쪽). 낭포성 오가노이드는 시간이 지남에 따라 나타나고 확대됩니다 (그림 1A, 오른쪽). 한편, 관련되지 않은 세포는 점차적으로 세포 사멸을 겪는다. 섬유아세포는 첫 번째 또는 두 번째 계대 동안 배양물에 존재한다. 그 후, 배양물은 상피 오가노이드를 독점적으로 함유하는데, 이는 원발성 폐 조직에 존재하는 상피 줄기 세포로부터 유래된 폐...

이 프로토콜은 원발성 폐 조직으로부터 인간 폐 오가노이드를 유도하고, 폐 오가노이드를 확장시키고, 근위 분화를 유도하여 인간 기도 상피를 충실하게 표현 복사하는 3D 및 2D 기도 오가노이드를 생성하는 방법을 제시한다.

The lack of a robust in vitro model of the human respiratory epithelium hinders the understanding of the biology and pathology of the respiratory system. ...

우리는 배양 접시에서 인간 기도 상피의 오가노이드 배양을 확립하는 방법을 소개하고 있습니다. 우리는 높은 효율로 원발성 폐 조직에서 직접 인간의 폐 오가노이드를 파생시킵니다. 유래된 인간 폐 오가노이드는 일 년 이상 안정적으로 확장되며, 근위 분화 프로토콜은 인간 기도 상피를 거의 생리학적 수준으로 충실하게 시뮬레이션할 수 있는 성숙한 기도 오가노이드의 생성을 허용한다.따라서 배양 시스템은 과학자들이 배양 접시에서 인간기도 상피를 재구성하고 확장 할 수있게합니다. 이 절차를 시연하는 것은 우리 실험실의 Man Chun Chiu와 Yifei Yu, PhD 학생들이 3D 오가노이드 배양을위한 인간 폐 조직으로부터 세포 분리를 시작하려면 폐 조직을 멸균 메스로 1 밀리미터 작은 조각으로 다듬고 차가운 기저 배지 10 밀리리터로 조직 조각을 씻으십시오. 조직을 섭씨 4도에서 5분 동안 400배 G에서 원심분리하고, 콜라게나제가 보충된 8밀리리터의 기초 배지에 펠렛을 밀리리터당 두 밀리그램의 최종 농도로 재현탁시키기 전에 상층액을 버린다.이어서, 섭씨 37도에서 30 내지 40분 동안 120 RPM에서 튜브를 흔들어 조직 조각을 소화시킨다. 소화 후, 10 밀리리터 혈청 학적 피펫을 사용하여 20 번 위아래로 피펫을 사용하여 소화 된 조직 조각을 전단합니다. 그런 다음 현탁액을 100미크론 스트레이너로 50밀리리터 튜브로 여과합니다.조직 조각을 회수하여 스트레이너로부터 기본 배지가 있는 15밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 소화를 종결시키기 위해, 유동관에 우태아 혈청을 2%의 최종 농도로 첨가한 다음, 튜브를 원심분리하고, 앞서 기술한 바와 같이 세포 펠릿을 10 밀리리터의 기초 배지에 재현탁시킨다. 원심분리 후, 펠렛을 80 내지 160 마이크로리터의 차가운 지하실 매트릭스 배지에 재현탁시키고 튜브를 얼음 위에 놓는다.다음에, 40 마이크로리터의 현탁액을 미리 가온된 24-웰 현탁액 배양 플레이트의 각 웰에 분배한다. 플레이트를 섭씨 37도에서 10 내지 15분 동안 인큐베이션한다. 지하실 매트릭스가 응고되어 물방울을 형성하도록하십시오.배양 후, 500 마이크로리터의 헤레굴린-베타 1의 나노몰로 보충된 인간 폐 오가노이드 확장 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 인큐베이션한다. 사흘 후, 물방울을 그대로 유지하면서 오래된 배지를 제거하고 조심스럽게 신선한 배지를 추가하십시오. 통과 후 10 ~ 14 일 후에 현미경으로 오가노이드를 관찰하고 오가노이드가 매우 높은 세포 밀도로 매립되지 않았는지 확인하십시오.전단으로 폐 오가노이드를 통과하려면 한 밀리리터 팁으로 위아래로 피펫팅하여 물방울을 부러 뜨립니다. 그런 다음 배지와 함께 오가노이드를 15 밀리리터 원심 분리 튜브로 옮기고 차가운 기저 배지로 부피를 10 밀리리터로 조정하십시오. 튜브를 섭씨 네 도에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리하고, 상층액을 버리고, 10밀리리터의 차가운 기저 배지로 오가노이드를 세척한다.그런 다음 오가노이드를 차가운 기저 배지 두 밀리리터에 재현탁하고 파스퇴르 피펫으로 작은 조각으로 전단하십시오. 다음으로, 1:3 내지 1:5 팽창을 가능하게 하기에 충분한 차가운 지하실 매트릭스로 오가노이드 단편을 재현탁하기 전에 10 밀리리터의 총 부피에 기초 배지를 첨가하고 튜브를 얼음 위에 놓는다. 미리 가온된 24웰 플레이트의 각 웰에 40마이크로리터의 오가노이드 현탁액을 분배하여 섭씨 37도에서 인큐베이션하여 지하 매트릭스가 10 내지 15분 동안 응고되도록 한다.나중에, 500 마이크로리터의 폐 오가노이드 확장 배지를 각 웰에 첨가하고, 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 사흘마다 배지를 새로 고치고 두 주마다 오가노이드를 통과시킵니다. 트립신화로 폐 오가노이드를 통과시키려면 수확 된 폐 오가노이드를 해리 효소 한 밀리리터에 재현탁하십시오.오르가노이드를 섭씨 37도 수조에서 3 ~ 5 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 튜브에 한 밀리리터의 기본 배지를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 오가노이드를 기계적으로 전단합니다. 40 마이크로 리터의 태아 소 혈청으로 소화를 종료하기 전에 100X 배율로 현미경으로 오가노이드 조각의 크기를 확인하십시오.1:5 내지 1:10의 비율로 통과하기에 충분한 부피로 차가운 지하실 매트릭스에 오가노이드 조각을 재현탁하기 전에 기저 배지와 원심 분리기로 부피를 10 밀리리터까지 구성하십시오. 나중에, 40 마이크로리터의 오가노이드 현탁액을 24-웰 플레이트의 각 웰에 분배하고, 이전에 입증된 바와 같이 플레이트를 배양한다. 3D 기도 오가노이드를 생성하려면, 기계적 전단을 통해 통과 후 7 내지 10일 동안 팽창 배지에서 폐 오가노이드를 인큐베이션한다.이어서, 확장 배지를 근위 분화 배지로 교체하고 세포 배양 인큐베이터에서 오가노이드를 인큐베이션한다. 14일 후, 각 웰의 배지를 버리고 세포 용해물 완충액을 첨가하여 RNA 추출 및 RT-qPCR 분석법에 의한 세포 유전자 발현의 검출을 위해 분화된 기도 오가노이드를 수확한다. 예비-세포 배양 인큐베이터 내의 삽입물을 각각 24-웰 플레이트의 상부 및 하부 챔버 내의 250 및 500 마이크로리터의 기저 배지와 함께 인큐베이션한다.그런 다음 한 밀리리터의 기본 배지를 튜브에 넣고 피펫을 위아래로 피펫하여 오가노이드를 단일 세포로 전단하십시오. 40 마이크로 리터의 태아 소 혈청으로 소화를 종료하기 전에 현미경으로 세포를 관찰하십시오. 세포를 40미크론 스트레이너를 통해 50밀리리터 튜브로 여과하고 여과된 세포 현탁액을 15밀리리터 튜브로 옮깁니다.현탁액을 기본 매체로 보충하여 총 부피가 10 밀리리터입니다. 원심분리 후, 세포 밀도에 따라 1 내지 2.5 밀리리터의 폐 오가노이드 확장 배지에 24개의 액적으로부터 수집된 펠렛을 재현탁시킨다. 현미경으로 세포 계수기를 가진 세포의 수를 세고, 세포 농도를 24-웰 삽입물에 대해 밀리리터 당 10배에서 6배로 1.3배로 조정하십시오.바닥 챔버에 500 마이크로리터의 팽창 배지를 첨가하기 전에 상부 및 하부 챔버로부터 기초 매질을 제거한다. 앞서 준비한 세포 현탁액 100 마이크로리터를 24-웰 인서트의 정점 챔버 상에 시드하고 인큐베이션한다. 이틀 후, 팽창 배지를 플레이트의 정점 및 바닥 챔버 모두에서 근위 분화 배지로 교체한다.오가노이드를 14 일 동안 배양하고 사흘마다 배지를 새로 고칩니다. 전기 저항 측정 시스템을 사용하여 매일 상피 전기 저항을 측정하십시오. 대표적인 현미경 사진에서, 갓 분리된 폐 세포는 환원된 성장 인자 기저막 매트릭스 유형 두 형에 매립되어 있음을 알 수 있다.낭포성 오가노이드가 나타나고 시간이 지남에 따라 성장했습니다. 네 번째 통로 이후의 폐 오가노이드가 여기에서 입증됩니다. 기계적 전단 후 두 시간 이내에, 기저막 추출물에 포매된 오가노이드 단편은 낭성 도메인을 형성하였다.다섯 번째 날에 같은 필드의 현미경 사진은 시간에 따른 오가노이드 성장을 확인했다. 확장 오가노이드는 ACCTUB 양성 또는 FOXJ1 양성 섬모 세포, P63 양성 기저 세포, CC10 양성 클럽 세포 및 MUC5AC 양성 잔 세포를 포함한 네 가지 주요 기도 상피 세포 유형을 모두 조기 상태로 보유했다. 확장 및 근위 분화 배지에서 배양된 오가노이드는 시간이 지남에 따라 뚜렷한 형태학을 발전시켰다.근위 분화 배지에서 분화 두 주 후, 모타일 섬모는 모든 오르가노이드에서 식별가능하였다. 동시적으로 박동하는 셀리아가 오가노이드 루멘 내부의 세포 파편을 몰고 흡입 된 입자를 제거하기 위해 일방향으로 소용돌이 치는 것이 관찰되었습니다. 또한, 유세포 분석 결과, 분화된 오가노이드가 근위 분화 및 확장 배지에서 네 가지 기도 상피 세포 유형을 수용한다는 것을 입증하였다.분화 2 주 후, 2D 기도 오가노이드는 손상되지 않은 상피 장벽을 개발했습니다. 덱스트란 막힘 분석은 2D 기도 오가노이드에서 형성된 상피 장벽의 완전성을 평가하기 위해 수행되었다. 2D 오가노이드는 풍부한 섬모 세포를 함유했다.장기간 확장 가능한 폐 오가노이드와 차별화된 기도 오가노이드는 COVID-19를 포함한 호흡기 생물학 및 병리학을 연구하기 위한 생리활성 및 보편적인 모델 시스템을 제공합니다.

establishing-human-lung-organoids-proximal-differentiation-to

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 효율적으로기도에게 상피 세포를 성숙 마우스 배아 줄기 세포 유래 최종 내배엽 지시합니다. 분화 기술은 정의 된 무 혈청 배양 환경에서, 폐 계통 사양을 직접 3 차원 decellularized 폐 지지체를 사용한다.

Decellularized 폐 공사장 공중 발판을 사용하여 ESC 파생 마우스기도 상피 세포의 생성

이 기사는 인간 폐의 근위 및 원위 영역으로부터 생존 가능한 상피 세포의 농축을 허용하는 조직 해리 및 세포 분획화 접근법에 대한 상세한 방법론을 제공한다. 본원에서 이러한 접근법은 3D 오가노이드 배양 모델의 사용을 통한 폐 상피 전구 세포의 기능적 분석에 적용된다.

오가노이드 배양을 위한 인간 폐 상피 전구 세포의 분리 및 농축

우리는 제노푸스 laevis 배아로부터 분리된 깊은 자궁 근세포세포로부터 점도 상피 오르가노이드를 개발하는 간단한 프로토콜을 기술합니다. 다능성 선조는 상피 잔잔 세포 전구체를 재생하고 오르가노이드 표면의 세포 전이의 개시 및 진행을 실시간으로 추적할 수 있도록 합니다.

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이 기사는 근접성 및 말단 상피 폐 세포를 메센키메와 함께 포함하는 3차원 전체 폐 오르가노이드로 유도된 다능성 줄기 세포의 단계 현명한 분화를 설명합니다.

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성

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