Name: 색상 반응을 기반으로 한 박테리아 운동성 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 44 s
Description: 학습하세요 TTC 반색상 반응을 활용한 박테리아 운동성 검출 프로토콜입니다. Staphylococcus aureus와 Escherichia coli를 포함한 병원성 세균의 운동성을 간단하고 정확하게 평가할 수 있는 임상 미생물학 연구 방법론입니다.

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이 연구는 장쑤 고등 교육 기관의 우선 학업 프로그램 개발(PAPD) 및 중국 약학 대학의 교육 개혁 연구 프로젝트(2019XJYB18)의 지원을 받았습니다.

1. 반고체 배지의 제조
<ol><li>전통적인 반고체 한천
	<ol><li>기본 성분11을 사용하여 박테리아 운동성 시험 배지 레시피에 따라 전통적인 반고체 한천을 준비한다. 충분한 증류수에 트립토오스 10g, NaCl 15g, 한천 4g을 녹이고 pH를 7.2 ± 0.2로 조정하고 최종 부피를 1,000mL로 구성합니다.</li>
		<li>한천을 121°C에서 20분 동안 오토클레이브하고 3cm 높이의 반고체 배지로 10mL 시험관에 분주합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>TTC를 사용한 전통적인 반고체 한천
	<ol><li>종래의 반고체 배지를 오토클레이빙한 후 50°C로 냉각하고 100mL의 배지에 멸균된 1% TTC 용액 5mL를 넣고 혼합한 후 10mL 시험관에 분주하여 3cm 높이의 반고체 배지를 형성합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 박테리아 균주
참고: 대장균, 녹농균, 살모넬라종, 비브리오종, 폐렴간균 및 에어로모나스 하이드로필라를 포함한 80개의 균주를 수생 환경에서 분리하고 자동 박테리아 식별 기기(재료 표 참조)를 사용하여 식별했습니다(표 1). 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)(재료 표 참조)은 음성 비운동성 대조군으로 사용되었습니다. 대장균(Escherichia coli), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)(재료 표 참조)을 양성 대조군 균주로 사용했습니다.
<ol><li>운동성 분석에 사용할 테스트 박테리아 균주를 식별합니다.</li>
	<li>음성 비운동성 대조군 및 운동성 양성 대조군 균주를 포함합니다.</li>
</ol>3. TTC 강화 박테리아 운동성 관찰
<ol><li>한천 플레이트에서 테스트 박테리아의 단일 콜로니를 선택하고 접종 바늘을 사용하여 구멍을 뚫어 위의 두 반고체 배지(단계 1.1.2 및 1.2.1)에 접종합니다.</li>
	<li>튜브를 37°C에서 24-48시간 동안 배양하여 결과를 관찰하였다.</li>
	<li>성장 상태 관찰: 펑크 라인만 빨간색인 경우 박테리아를 운동성이 없는(-) 특성화합니다. 붉은 색이 천공선12를 따라 바깥쪽으로 가볍게 퍼지면 박테리아를 운동성(+)으로 특성화합니다.</li>
</ol>4. 다양한 한천 농도가 박테리아 운동성에 미치는 영향
<ol><li>0.3%, 0.5%, 0.8% 한천을 함유하는 반고체 배지를 준비하고, 상기와 같이 천자에 의해 접종한다. 배양 24-48 시간 후에 결과를 관찰하십시오.</li>
</ol>

<ol><li>Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility.</a> Journal of Bacteriology. 27 (2), 165(1934).</li>
<li>Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+motility+and+its+role+during+initial+stage+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis.</a> Journal of Microbiology. 26 (5), in Chinese 68-70 (2006).</li>
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<li>Bartley, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attachment+and+invasion+of+Neisseria+meningitidis+to+host+cells+is+related+to+surface+hydrophobicity%2C+bacterial+cell+size+and+capsule%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule.</a> PLoS One. 8, 55798(2013).</li>
</ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

반고체 배지 방법에 의한 박테리아 운동성의 검출은 많은 요인에 의해 영향을 받는다13,14. 산소(한천 표면의 호기성, 반고체 배지가 있는 튜브 바닥의 비호기성), pH 및 온도와 같은 박테리아 성장 조건은 박테리아 편모의 생존력에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 운동성 감소 또는 운동성 상실로 이어질 수 있다15. 또한, 일부 점액형 박테리아는 이들의 운동성이 podoconjugates의 생성에 의해 영향을 받을 수 있다.
반고체 배지에 TTC를 첨가하면 운동성 관찰에 도움이 됩니다. 원동력을 가진 발효 박테리아는 배양 후 펑크 라인을 따라 모든 방향으로 자랄 수 있습니다. 따라서 펑크 라인 주변의 매체가 빨간색으로 변합니다. 원동력을 가진 비발효성 박테리아는 배지 하부의 산소 함량이 낮습니다. 따라서 이러한 박테리아는 잘 자라지 않...

박테리아 운동성은 박테리아 병원성, 생물막 형성 및 약물 내성에 중요한 역할을 합니다1. 박테리아 운동성은 병원성과 밀접한 관련이 있으며, 숙주 세포의 초기 감염 동안 박테리아 집락화에 필요하다2. 생물막 형성은 박테리아 운동성과 밀접한 관련이 있으며, 박테리아는 운동성을 통해 고체 배지의 표면에 부착됩니다. 박테리아의 운동성은 오랫동안 생물막 형성과 양의 상관관계가 있는 것으로 여겨져 왔습니다. 생물막으로 인한 높은 수준의 박테리아 약물 내성은 인체 건강에 위협이되는 지속적인 감염을 유발할 수 있습니다 3,4,5. 따라서 박테리아의 운동성을 감지하는 것이 중요합니다. 박테리아 운동성 검사는 주로 살아있는 상태에서 다양한 형태의 박테리아의 운동성을 검사하는 데 사용되며, 이는 편모의 유무를 간접적으로 결정할 수 있으므로 박테리아 식별에 중요한 역할을 합니다.
박테리아의 운동성을 감지하는 직간접적인 방법이 있다6. 편모를 가진 박테리아는 운동성을 나타내기 때문에 편모의 유무를 감지하여 박테리아가 운동성인지 여부를 간접적으로 검출할 수 있습니다. 예를 들어, 전자 현미경 및 편모 염색에 의해 간접적으로 운동성을 감지하여 박테리아가 운동성이 있음을 나타낼 수 있습니다. 서스펜션 드롭 및 반고체 펑크 방법과 같은 직접적인 방법으로 감지하는 것도 가능합니다. 
세균 운동성을 감지하기 위해 학부 미생물학 실험실에서 일반적으로 사용되는 반고체 천자 방법은 세균 성장 방향에 따라 0.4-0.8% 한천을 함유한 반고체 한천 배지에 박테리아를 천자 내로 접종합니다. 박테리아가 펑크 라인을 따라 자라서 주변으로 퍼지면 구름 모양 (브러시 같은) 성장 흔적이 나타나 편모의 존재와 운동성을 나타냅니다. 펑크 라인 성장 흔적이 없으면 박테리아는 편모도 운동성도 없습니다. 
그러나이 방법은 박테리아가 무색이고 투명하며 편모 활성은 살아있는 박테리아 및 기타 요인의 생리적 특성과 한천의 농도 및 시험관의 작은 직경에 의해 영향을받는 단점이 있습니다. 또한, 호기성 박테리아는 한천 표면에서의 성장에만 적합하여 박테리아 운동성 관찰에 영향을 미칩니다. 따라서이 실험을 개선하기 위해 2,3,5- 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) (무색)를 배지에 첨가하여 TTC 7,8,9,10의 적색 생성물 형성을 촉매하기 위해 세포 내 탈수소 효소를 사용하는 현재의 직접 천자 방법보다 박테리아 운동성을 결정하는 더 신뢰할 수 있고 직관적 인 방법을 확립했습니다.

<table><tbody><tr><td>Bacto Agar</td><td>Difco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>ATCC</td><td>ATCC25922</td><td>양성 대조군</td></tr><tr><td>녹농균</td><td>ATCC</td><td>ATCC27853</td><td>양성 대조군</td></tr><tr><td>Salmonella typhimurium</td><td>ATCC</td><td>ATCC14028</td><td>양성 대조군</td></tr><tr><td>황색포도상구균</td><td>ATCC</td><td>ATCC25923</td><td>음의 비운동성 제어</td></tr><tr><td>트립토스</td><td>&nbsp; OXOID</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TTC</td><td>Sigma</td><td>298-96-4</td><td></td></tr><tr><td>VITEK 2 자동 미생물 식별 시스템</td><td>Bio M&eacute; 리외</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

색상 반응을 기반으로 한 박테리아 운동성 시각화

Visualizing Bacterial Motility Based on a Color Reaction

박테리아 운동성은 박테리아 병원성, 생물막 형성 및 약물 내성에 매우 중요합니다. 박테리아 운동성은 많은 병원성 종의 침입 및/또는 보급에 매우 중요합니다. 따라서 박테리아의 운동성을 감지하는 것이 중요합니다. 산소, pH 및 온도와 같은 박테리아 성장 조건은 박테리아 성장과 박테리아 편모의 발현에 영향을 줄 수 있습니다. 이것은 운동성을 감소시키거나 심지어 운동성을 상실하여 박테리아 운동성에 대한 부정확한 평가를 초래할 수 있습니다. 살아있는 박테리아의 세포 내 탈수소효소에 의한 2,3,5-트리페닐 테트라졸륨 클로라이드(TTC)의 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성 검출을 위해 전통적인 반고체 한천에 TTC를 첨가했습니다. 그 결과 박테리아 운동성 검출을 위한 이 TTC 반고체 한천 방법이 간단하고 작동하기 쉬우며 크고 값비싼 기구가 필요하지 않다는 것을 보여주었습니다. 그 결과, 0.3% 한천으로 제조된 반고체 배지에서 가장 높은 운동성이 관찰되는 것으로 나타났다. 기존의 반고체 매체와 비교하여 결과를 평가하기 쉽고 정확합니다.

운동성 검출을 위해 표준 균주와 분리된 균주 모두 비교하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다. 편모가 없기 때문에 황색포도상구균과 폐렴간균은 전통적인 배지와 TTC 반고체 배지 모두에서 접종된 라인을 따라서만 성장했습니다. 대조적으로, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 대장균(Escherichia coli) 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)은 TTC 반고체 배지 상에서 24시간 동안 배양한 후 접종된 라인 주위의 모든 방향에서 성장을 보였다. 이는 48시간 배양 후에 더욱 분명해졌습니다(그림 1). 박테리아는 전통적인 반고체 배지에서 모든 방향으로 성장했지만 접종 라인의 바깥쪽에 박테리아 수가 적기 때문에 TTC 배지보다 시각화하기가 훨씬 더 어려웠습니다.
<p class="jove_content" fo:ke...

여기에서는 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성을 감지하는 프로토콜을 제시합니다. 이 방법의 주요 장점은 평가하기 쉽고 정확하며 특수 장비가 필요하지 않다는 것입니다.

Bacterial motility is crucial for bacterial pathogenicity, biofilm formation, and drug resistance. Bacterial motility is crucial for the invasion and/or ...

세균 운동성의 검출은 운동성이 병원성에 매우 중요하기 때문에 중요합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 살아있는 박테리아의 세포 내 탈수소효소와 TTC의 색 반응을 기반으로 하기 때문에 박테리아 운동성을 검출하기 위한 신뢰할 수 있는 방법입니다. 박테리아 운동성을 감지하기 위한 TTC 반고체 한천 방법은 간단하고 작동하기 쉬우며 크고 값비싼 기기를 포함하지 않습니다.이 방법은 임상 미생물학자 또는 연구자가 병원성 박테리아를 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 제 연구실의 선임 실험가인 Xiyi Zhuang이 맡을 것입니다. 시작하려면 적절한 양의 증류수에 트립토스 10g, 염화나트륨 15g, 한천 4g을 추가하여 전통적인 반고체 매체를 준비합니다.pH를 7.2로 조정하고 최종 부피를 1, 000 밀리리터로 구성합니다. 섭씨 121도에서 20분 동안 매체를 오토클레이브하고 배지를 3cm 높이의 10ml 테스트 튜브에 분배합니다. TTC 배지를 준비하려면 오토클레이브 처리된 기존 배지를 섭씨 50도로 냉각한 다음 100밀리리터의 배지에 5ml의 멸균 1% TTC 용액을 추가합니다.배지를 혼합하여 10ml 테스트 튜브에 3cm 높이로 분배합니다. 한천 플레이트에서 박테리아의 단일 군체를 선택하고 접종 바늘을 사용하여 구멍을 뚫어 반고체 매체 모두에 접종합니다. Non-modal 변형률을 negative control로 포함하고 modal strain을 positive control로 포함하는 것을 잊지 마십시오.한천 농도가 박테리아 운동성에 미치는 영향을 관찰하려면 다른 한천 농도를 포함하는 반고체 매체를 준비하고 천자로 접종하십시오. 튜브를 섭씨 37도에서 배양하고 배양 24-48시간 후에 결과를 관찰합니다. 펑크 선만 빨간색이면 박테리아를 비-모달(non-modal)로 특성화합니다.붉은 색이 펑크 라인을 따라 바깥쪽으로 퍼지면 박테리아를 모달로 특성화하십시오. 기존 및 TTC 반고체 배지의 다양한 균주에 대한 박테리아 운동성을 비교하고 이 표에 요약했습니다. TTC 반고체 배지에서 24시간 배양 후, 황색포도상구균은 접종 라인을 따라 성장을 보였다.반면, 대장균은 접종된 라인 주변의 모든 방향에서 성장을 보였습니다. 대장균에 대한 가장 높은 운동성은 0.3% 한천으로 제조된 TTC 반고체 배지에서 관찰되었으며, 배지는 거의 완전히 빨간색으로 변했습니다. 이에 반해, 0.5%한천에서는 적색 확산 면적이 감소하고 한천 농도가 0.8%로 증가하면서 확산이 연장되었다.바늘을 이용하여 접종하기 전에 pH를 7.2로 조정하고 오토클레이브 매체를 섭씨 50도로 냉각하는 것이 중요하다.박테리아는 TTC를 포함하는 반고체 매체에 구멍을 뚫어 접종해야 합니다. 세균의 운동성을 감지하는 직접적인 방법입니다. 또한 전자 현미경에 의해 간접적으로 운동성을 검출하는 것도 가능하며,

visualizing-bacterial-motility-based-on-a-color-reaction

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 chemoeffectors의 안정적인 농도 기울기에 박테리아 chemotaxis 조사를위한 microfluidic 장치의 개발을 설명합니다.

안정적인 농도 기울기에 박테리아 Chemotaxis을 Quantifying위한 Microfluidic 장치

출처: Morales-Soto, N. et. al., 박테리아 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 연질 한천의 표면 운동성을 관찰하기 위해 녹색 형광 단백질을 발현하는 박테리아를 사용하는 군집 분석을 보여줍니다. 타임랩스 이미징은 조정된 팽창과 덩굴손 형성을 포착하여 박테리아 표면 운동성을 강조합니다.

박테리아 표면 운동성을 시각화하기 위한 군집 분석

출처: Chu, W. 및 Zhuang, X. 색상 반응을 기반으로 박테리아 운동성 시각화. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 운동성 균주와 비운동성 균주를 시각적으로 구별하여 박테리아 운동성을 평가하기 위한 산화환원 염료 기반 반고체 한천 분석을 보여줍니다.

산화환원 염료 보충 반고체 배지를 사용한 박테리아 운동성 시각화

출처: Yarringto, K. D., et al. 단일 세포 종간 박테리아 상호 작용의 동역학적 시각화. J. Vis. 경험. (2020년)이 비디오는 살아있는 세포 이미징을 위해 아가로스 패드 아래에서 운동성 및 비운동성 박테리아를 사용하여 공동 배양 시스템을 준비하는 방법을 보여줍니다. 운동성 박테리아가 어떻게 화학적 유인제를 감지하고 비운동성 콜로니에 침입하여 박테리아 상호 작용을 드러내는지 보여줍니다.

단일 세포 박테리아 상호 작용의 시각화

출처: Scheidweiler, D. 외. 유체 장치와 현미경 및 유동 세포분석을 결합하여 공간적 규모를 넘어 다공성 배지 내 미생물 수송을 연구합니다. J. Vis. 경험 (2020).이 영상은 무작위로 배열된 기둥들로 구성된 다공성 매트릭스를 통해 박테리아의 운동성을 정량화하기 위해 마이크로플루이딕 장치를 사용하는 방법을 시연합니다. 형광 표지된 박테리아를 장치에 투입하고, 다공성 매트릭스를 통과해 관찰 채널로 이동하는 동안 현미경으로 영상화한 후 분석하여 돌파 곡선(BTC)을 생성합니다.

마이크로플루이딕 장치를 이용한 박테리아 운동성 평가

군집 운동성은 물리적, 환경적 요인의 영향을 받습니다. 우리는 군집 분석 준비 및 데이터 수집과 일반적으로 관련된 문제를 우회하기 위한 2단계 프로토콜과 지침을 설명합니다. 현재의 분석 기술로는 제공되지 않는 떼 행동에 대한 자세한 정보를 얻기 위해 거시적 이미징 기술이 사용됩니다.

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

최근의 연구 결과에 따르면 박테리아 편모 모터는 다양한 환경 신호를 감지하고 이에 반응하여 리모델링을 합니다. 여기에서 논의된 비드 분석은 환경 스트레스 요인에 대한 세포 적응에서 리모델링의 역할을 설명하는 데 도움이 될 것으로 예상됩니다.

편모 모터 기능의 생물 물리학 적 특성

미세 유체 및 밀리유체 설정 내에서 광용해로 동적 화학 적 경관의 생성을위한 프로토콜이 제시된다. 이 방법론은 운동성 행동, 영양소 섭취 또는 미생물의 화학 물질에 대한 적응을 포함한 다양한 생물학적 과정을 단일 세포 및 집단 수준에서 연구하는 데 적합합니다.

미생물 행동을 연구하기 위한 제어된 동적 화학 적 경관 생성

많은 박테리아는 자신의 환경을 탐색하고 개별적으로 및 집단으로 모두 유리한 환경을 식민지화하기 위해 플래그텔라 구동 운동성을 사용합니다. 여기에 수영과 모성에 기여하는 구성 요소 / 경로를 식별하기 위해 선택 도구로 운동성을 활용하는 세 가지 확립 된 방법의 사용이 입증된다.

에슈리치아 대장균에서 모토렐라 구동 운동성 조사

이 살아있는 세균성 세포 화상 진찰 프로토콜은 시간이 지남에 따라 단세포 수준에서 다중 세균성 종 사이 상호 작용의 시각화를 허용합니다. 시간 경과 화상 진찰은 개별 세포 운동성 및 생존성을 포함하여 다종 세균성 지역 사회에서 종 간 상호 작용을 심문하기 위하여 단배문화 또는 공동 문화에서 각 세균성 종의 관찰을 허용합니다.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

여기에서, 우리는 박테리아 떼 운동성을 평가하면서 동시에 다중 농도 반응을 얻기 위해 유도제 구배 플레이트의 사용을 설명합니다.

유도기 그라디언트 플레이트의 박테리아 표면 떼 운동성 정량화

학습하세요 TTC 반색상 반응을 활용한 박테리아 운동성 검출 프로토콜입니다. Staphylococcus aureus와 Escherichia coli를 포함한 병원성 세균의 운동성을 간단하고 정확하게 평가할 수 있는 임상 미생물학 연구 방법론입니다.

색상 반응을 기반으로 한 박테리아 운동성 시각화

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