돌연변이 메티오닌 tRNA 신테타제 마우스 라인을 사용한 복합 조직으로부터의 세포형 특이적 단백질 정제 및 식별

이 프로토콜은 세포 유형 특이적 방식으로 단백질을 표지하는 것을 가능하게 합니다. 이것은 그러한 가능성을 제공하는 첫 번째 기술이며 시험관 내 또는 생체 내에서 수행 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 표지된 세포 유형 특이적 단백질을 미확인 정제하거나 면역형광체에 의해 현장에서 시각화할 수 있다는 것입니다.

조직 용해물을 준비하기 시작하여, 조직의 습윤 중량의 12 내지 15배의 부피로 용해 완충액을 첨가하고, 조직이 균질화될 때까지 분쇄한다. 이 균질액을 섭씨 75도까지 15분 동안 가열하여 단백질을 변성시킨 다음 샘플을 원심분리하고 상청액을 새 튜브로 옮깁니다. 이 샘플은 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다.

다음으로, 알킬화를 위해 균질화된 샘플을 EDTA가 없는 프로테아제 억제제를 함유하는 포스페이트 식염수 완충액에서 2 내지 3회 희석한다. 그런 다음 새로 준비된 요오도 아세트 아미드를 최종 농도 20 밀리몰에 첨가하십시오. 어둠 속에서 섭씨 20도에서 1-2 시간 동안 샘플을 그대로 두십시오.

요오도아세트아미드 첨가 및 인큐베이션 단계를 2회 반복한다. 먼저 기둥을 소용돌이하여 제조업체의 지침에 따라 기둥을 준비합니다. 그런 다음 뚜껑을 제거하고 바닥 부분을 자르고 원심 분리하십시오.

다음으로, 먼저 클릭 화학 교환 버퍼를 사용하여 버퍼 교환 컬럼을 평형화한 다음 모든 알킬화된 샘플을 교환하여 버퍼 교환을 수행합니다. 아지도노르류신 혼입을 평가하기 위해 40 마이크로리터의 언급된 샘플을 취하고, 120 마이크로리터의 최종 부피에 인산염 식염수 완충액을 첨가한다. 그런 다음 20초 동안 반응을 볼텍싱하여 클릭 화학 반응을 설정합니다.

가능한 한 빨리 표시된 순서대로 각 시약을 첨가 한 후 샘플을 섭씨 4 도의 어두운 곳에서 밤새 연속 회전하여 배양합니다. 다음날 샘플을 17, 000배 G에서 5분간 원심분리하면 약간 청록색 펠릿이 보일 것이다. 상청액을 새 튜브로 옮기고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오.

표지된 단백질 정제용. 모든 샘플을 평형 완충액으로서 뉴트라비딘 결합 완충액을 사용하여 유리 알킨의 잔여물을 세척하기 위해 입증된 바와 같이 완충액 교환 절차를 거친다. 그 후 뉴트라비딘 비드를 결합 완충액과 혼합하여 3회 고용량 비드를 세척한다.

혼합물을 원심 분리하고 상청액을 버리고 이것을 3 번 반복하십시오. 이어서 동일한 부피의 뉴트라비딘 건조 비드와 뉴트라비딘 결합 완충액을 첨가하여 일대일 슬러리를 제조한다. 각 샘플 20-40 마이크로 리터를 사전 정제 된 용해물로 따로 보관하고 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오.

시료의 단백질 농도를 측정한 후 단백질 1 밀리그램과 40 마이크로리터의 비드 슬러리를 혼합하였다. 혼합물을 섭씨 4도에서 밤새 배양하고 표지된 단백질이 비드에 결합할 수 있도록 연속 회전합니다. 다음날 원심분리에 의해 상청액을 수집한다.

나중에 분석을 위해 상청액의 20-40 마이크로리터 분취량을 따로 보관하고 나머지는 섭씨 영하 80도에서 동결시킵니다. 다음으로, 차가운 뉴트라비딘 세척 완충액 1개를 첨가하여 비드를 3회 세척한다. 비드를 침전시키고 상청액을 버린다.

이어서, 동일한 완충액을 첨가하고, 상청액을 버리기 전에 섭씨 4도에서 연속 회전 하에 10분 동안 비드를 인큐베이션한다. 뉴트라비딘 세척 완충액 2 및 3으로 세척을 반복하고, 사용된 건조 비드의 1 부피에 해당하는 부피의 뉴트라비딘 용출 완충액과 함께 섭씨 20도에서 30분 동안 비드를 인큐베이션하여 클릭된 단백질을 용리시킨다. 용리 동안, 비드를 열 블록 쉐이커에서 분당 1000 회전으로 현탁액으로 유지하여 2회 회피하고 두 용리체를 합친다.

클릭 반응은 SDS 페이지 및 웨스턴 면역 블롯으로 분석하였다. 실험의 대표 이미지는 복강 내 주사에 의한 아지도노르류신 투여 및 음용수를 통한 아지도노르류신 투여에 대해 도시된다. 추가 실험은 최적의 이황화물 비오틴 절단성 알킨 농도의 결정을 위한 예를 제공합니다.

이 예에서, 표지된 샘플과 대조군 사이의 폴드 변화는 14 마이크로몰 알킨 농도에서 가장 높다. 대조군과 비교하여 표지된 아지도노류신 샘플에서 명확한 농축을 갖는 질량 분석 결과의 예가 여기에 나와 있다. 이 차이는 이미 전체 단백질 염색에서 볼 수 있었습니다.

펩타이드 강도의 변화 외에도 두 샘플 모두에서 발견되는 독특한 단백질이 있습니다. 이것은 기술적으로 복잡한 프로토콜이며 적절한 음성 제어 알킬화, 적절한(불명료한) 및 비 클릭 아카이브의 적절한 청소를 사용하여 주의 깊게 따라야 하는 단계입니다. 이 프로토콜의 주요 단계인 정제된 단백질은 연구자가 단백질을 연구하는 것이라면 질량분석법으로 식별하거나 웨스턴 블롯으로 관심 단백질을 연구하기 위해 젤에 로드할 수 있습니다.

특정 세포 기원의 단백질을 표지하는 이 방법의 능력은 단백질의 장력 또는 시험관 내 또는 생체 내 단백질 합성 연구와 같은 많은 응용 분야를 가지고 있습니다.