Name: 골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 배우세요 골격근 섬유 유형별 지질 액적 정량 및 형태 분석 방법을. 동시 처리로 시간을 절약하고 아티팩트를 방지하며, 비만과 암 등 인체 연구에도 적용 가능한 효율적인 프로토콜입니다.

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이 작품은 Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20)와 Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S.의 보조금으로 지원되었습니다. M.A.D.-L.d.C.는 Wallonie-Bruxelles International Excellence Program으로부터 펠로우십을 받았습니다.
저자는이 프로토콜 개발에 기여한 Alice Monnier와 이미지 수집 프로세스에 대한 전문 지식과 기술적 도움을 주신 Caroline Bouzin에게 감사드립니다. 우리는 또한 냉동 및 현미경 (2IP-IREC 이미징 플랫폼, 실험 및 임상 연구 연구소, Université Catholique de Louvain, 1200 브뤼셀, 벨기에)에 액세스 할 수있는 2IP-IREC 이미징 플랫폼에 감사드립니다. 마지막으로, 저자는 원고에 대한 건설적인 비판에 대해 Nicolas Dubuisson, Romain Versele 및 Michel Abou-Samra에게 감사하고 싶습니다. 이 기사의 인물 중 일부는 BioRender.com 로 작성되었습니다.

저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

여기에 자세히 설명된 프로토콜은 Bodipy로 태그가 지정된 LD를 섬유형 및 아세포별 기준으로 정량화하는 효율적인 방법을 설명합니다. 최근 몇 년 동안, ORO 또는 수단 블랙 B와 같은 고전적 지질 염료는 중성 지질 (예를 들어, Bodipy)에 결합하는 세포 투과성, 친유성, 형광 염료의 새로운 어레이로 치환되었다. 다른 컨쥬게이트로서 이용 가능한 Bodipy는 LDs를 태깅하여 다른 고정 조직 및 세포23,38,39,40뿐만 아니라 살아있는 세포 41,42에서도 다른 소기관과의 형태, 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 매우 효과적임이 입증되었습니다.
<p class="jove_co...

근막증으로 알려진 골격근 지질 침투는 비만과 노화에 따라 증가합니다. 근막증은 근육량과 강도 및 인슐린 민감성과 부정적인 상관 관계가 있습니다1. 더욱이, 최근의 연구들은 근막증의 정도가 심혈관 질환2, 비알콜성 지방간 질환3 또는 암4과 같은 다른 병태에 대한 예후 인자로서 사용될 수 있음을 나타낸다. 지질은 근세포 외 지질로서 또는 섬유 내에서, 근세포 내 지질(IMCLs)로서 근섬유 사이의 골격근에 축적될 수 있다. IMCL은 주로 신체 운동 5,6 동안 대사 연료로 사용되는 지질 방울 (LDs)의 트리글리 세라이드로 저장됩니다. 그러나 지질 공급이 수요를 초과하거나 미토콘드리아가 기능 장애가되면 IMCL은 대사 적으로 건강에 좋지 않은 비만인 개인 및 제 2 형 당뇨병 환자7에서 볼 수 있듯이 근육 인슐린 저항성에 연루됩니다. 흥미롭게도, 지구력 운동 선수는 높은 인슐린 민감성을 유지하면서 제 2 형 당뇨병을 앓고있는 비만 환자에서 발견되는 것과 비슷한 수준의 IMCL을 가지고 있습니다. 이 현상은 "운동 선수의 역설"8,9로 묘사되며, 크기, 밀도, 국소화, 역학 및 지질 종 구성과 관련된 근육 LDs에 대한보다 미묘한 평가에 의해 설명됩니다.
첫째, LD 크기는 인슐린 민감성 및 체력10,11과 반비례하여 상관관계가 있다. 실제로, 더 작은 LD는 리파아제 작용에 대해 상대적으로 더 큰 표면적을 나타내므로, 잠재적으로 지질(12)을 동원할 수 있는 더 큰 능력을 갖는다. 둘째, LD 밀도 (수 / 표면)는 인슐린 작용 8,10에서 논란의 여지가있는 역할을합니다. 그러나 운동 선수에서 증가한 것으로 보입니다. 셋째, LDs의 세포하 국소화는 중요한데, 이는 표면 막(아사르콜렘말 또는 주변부) 바로 아래에 위치한 LD가 중심 것들보다 인슐린 감수성에 더 해로운 영향을 미치기 때문이다(8,9,13). 후자는 호흡 활동이 더 크고 수축14에 필요한 높은 에너지 수요를 충족시키기 위해보다 전문화 된 중앙 미토콘드리아에 연료를 제공합니다. 대조적으로, 말초 LD는 막 관련 공정에 관여하는 아사르콜렘말 미토콘드리아를 공급한다8. 마지막으로, 트리글리세라이드 이외에도 근육 내의 특정 복합 지질은 다른 지질보다 더 해로울 수 있습니다. 예를 들어, 디아실글리세롤, 장쇄 아실-CoA, 및 세라마이드는 트리글리세리드 턴오버 속도가 낮을 때 근육에 축적되어 인슐린 신호전달 9,15를 손상시킬 수 있다. "운동 선수의 역설"로 돌아가서, 지구력 운동 선수는 유형 I (산화성) 섬유에서 높은 회전율을 가진 더 작은 중앙 LD의 수가 많은 반면, 비만 및 당뇨병 환자는 유형 II (글리콜 성) 섬유 8,15,16에서 낮은 회전율을 가진 더 큰 말초 LD를 가지고 있습니다. 에너지 저장 및 방출에서의 그들의 역할 외에도, 유도 지방산 (FA) 및 코트 단백질 (페리리핀 5)을 통한 LDs는 또한 FA 산화 및 미토콘드리아 생물 발생의 전사 조절에 관여하는 중요한 선수로서 기능 할 수 있습니다8. 생리학 및 병태생리학에 중요한 영향을 미치기 때문에 LD의 역학과 기능에 대한 심층적 인 연구가 보장됩니다.
IMCL을 연구하는 몇 가지 기술이 있지만, LD 크기, 밀도 및 분포를 섬유 특정 방식으로 정확하게 정량화하는 데 모두 적합한 것은 아닙니다. 예를 들어, 자기 공명 분광법에 의한 IMCL의 평가는 비침습적이지만 섬유 내의 LD의 크기와 정확한 위치를 연구하기에 충분하지 않은 수준의 분해능을 제공하며 섬유 유형 특이17,18이 아닙니다. 마찬가지로, 전체 근육 균질물(19)에 대해 수행된 생화학적 기술은 지질의 위치 및 크기를 평가할 수 없다. 결과적으로, LD 형태학 및 위치를 분석하는 가장 적절한 방법은 정량적 투과 전자 현미경(13)이지만, 이 기술은 비용이 많이 들고 시간이 많이 소요된다. 따라서 Oil Red O (ORO) 20,21, monodansylpentane (MDH) 22 또는 Bodipy 23,24,25와 같은 염료를 사용한 제제에 대한 공초점 형광 이미징이 이러한 연구에 가장 적합한 도구로 부상했습니다.
여기에서, 조직 샘플링 및 처리, 보디피 염색, 및 공초점 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜이 설명되어 마우스 근육 동결절편에서 LD 크기, 수 및 국소화를 정량화한다. IMCL은 산화 섬유와 글리콜 섬유간에 고르게 분포되어 있지 않으며 각 섬유 유형은 LD 역학을 다르게 조절하기 때문에 IMCL에 대한 연구는 섬유 유형 별 16,25,26,27이어야합니다. 따라서, 이 프로토콜은 각 섬유에 의해 발현되는 미오신 중쇄(MyHC) 이소형(들)을 확인하기 위해 직렬 절편에 면역형광을 사용한다. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 동결 전에 나란히 놓인 글리콜 (신근 디지토럼 롱구스, EDL)과 산화 (단독) 근육을 동시에 처리하는 것입니다 (그림 1). 이 동시 처리는 시간을 절약 할뿐만 아니라 샘플의 개별 처리로 인한 변동성을 방지합니다.
<img alt="조직 동결 및 냉동 절편을 위한 프로토콜 체계; 면역조직화학 및 현미경 검사가 포함된 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63718/63718fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1: 절차의 개략적인 개요. 근육 해부 (1) 후, 유사한 크기의 선택된 근육이 준비되고 함께 얼어 붙습니다 (2). 10 μm의 직렬 횡단 절편은 냉동 장치를 사용하여 얻어지며 접착 슬라이드(3)에 직접 장착된다. 두 개의 연속 슬라이드에서, 첫 번째 (4A)는 라미닌에 대해 면역 표지되고 LD를 인식하기 위해 Bodipy로 염색되고 두 번째 (4B)는 근육 섬유 유형의 인식을 위해 MyHC에 대한 항체로 면역염색됩니다. 이미지는 Bodipy (5A)의 공초점 현미경과 근육 섬유 유형 (5B)에 대한 epifluorescence 현미경을 사용하여 획득됩니다. 이미지는 피지에서 역치 및 정량화 입자(6A)를 적용하여 LDs(7) 또는 카운팅 셀(6B)에 의해 점유된 전체 면적의 수, 평균 크기, 밀도 및 백분율을 구하여 섹션(7)에서 각 유형의 섬유의 백분율을 구함으로써 분석된다. 약어: LDs = 지질 방울; EDL = 신근 디지토럼 경도; MyHCs = 미오신 중쇄 이소형. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63718/63718fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam 506 mono 6 Mpix 카메라</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioCam MRm 1.4MPix CCD 카메라&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>화학 후드</td><td>Potteau Labo</td><td>EN-14175</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM800</td><td></td></tr><tr><td>코르크 디스크 (&oslash; 20mm, 두께 3mm)&nbsp;</td><td>전자 현미경 과학</td><td>63305</td><td></td></tr><tr><td>크라이오-글러브</td><td>템프쉴</td>드 <td>16072252</td><td></td></tr><tr><td>크라이오스탯&nbsp;</td><td>써모 사이언티픽&nbsp;</td><td>Microm Cryo Star HM 560</td><td></td></tr><tr><td>해부 스테레오 현미경 SMZ745</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>드라이 아이스</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont 집게</td><td>F.S.T</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope</td><td>Zeiss</td><td>AxioImage-Apotome Z1</td><td></td></tr><tr><td>Extra Fine Bonn Scissors</td><td>F.S.T</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>FisherBrand 일회용 베이스 몰드 (0.7 x 0.7 cm)</td><td>ThermoFisher</td><td>22-363-552</td><td>코르크의 근육을 유지하기 위해 조각을 자르는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>유리 페트리 접시 (H 25&nbsp; mm, &오슬래시; 150&nbsp; mm)</td><td>BRAND Petri dish, MERK</td><td>BR455751</td><td>해부 중 근육을 얼음 위에 올려놓는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>ImmEdge 소수성 장벽 PAP Pen</td><td>Vector Labs</td><td>H-4000</td><td>근육 부분 주변에 히드롭포비아 장벽을 만드는 데 사용됩니다</td></tr>. 인<tr><td>큐베이터</td><td>MMM Medcenter</td><td>Incucell 707&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>현미경 커버 안경 (24x50mm)</td><td>보조&nbsp;</td><td></td><td></td>40990151</tr><tr><td>현미경 슬라이드 박스&nbsp;</td><td>Kartell</td><td>278</td><td>면역 조직 화학을위한 습한 챔버로 사용</td></tr><tr><td>넥 홀더</td><td>Linie zwo</td><td>SB-035X-02</td><td>스테인레스 스틸 텀블러를 고정하기위한 스트랩으로 사용</td></tr><tr><td>No 15 멸균 탄소강 메스 블레이드</td><td>Swann-Morton</td><td>0205</td><td></td></tr><tr><td>페인트 브러시</td><td>Van Bleiswijck</td><td>Amazon B07W7KJQ2X</td><td>냉동 절제 처리에 사용</td></tr><tr><td>영구 마커 펜 블랙</td><td>Klinipath/VWR</td><td>98307-R</td><td>슬라이드에 Pierce</td></tr><tr><td>Fixation Forceps</td><td>F.S.T</td><td>18155-13</td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 상자를</td> 라벨링하는 데 사용됨;<td></td><td></td><td>H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, 액체 질소 용기로 사용되며 샘플을 cryostat</td></tr><tr><td>Scalpel Handle로 운반하는 데 사용됩니다. 메스 핸들, 125 mm (5"), No. 3</td><td>Aesculap</td><td>BB073R</td><td></td></tr><tr><td>스테인레스 스틸 컵 10oz&nbsp;</td><td>Eboxer</td><td>B07GFCBPFH</td><td>근육 동결을 위해 이소펜텐으로 채우는 텀블러</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus 슬라이드</td><td>ThermoFisher</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>수술용 핀셋 1/2 치아</td><td>Medische Vakhandel</td><td>1303152</td><td>"쥐 이빨 핀셋"이라고도 함</td></tr> <tr><td>Vannas 스프링 가위 - 3mm 커팅 엣지</td><td>F.S.T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>계량 보트</td><td>VWR 국제</td><td>611-2249</td><td></td></tr><tr><td>전체 슬라이드 스캐너</td><td>형광 Zeiss</td><td>Axio Scan.Z1</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 405 염소 안티-마우스 IgG2b</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SAB4600477</td><td>최종 농도 1:500에서 사용</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 염소 안티 마우스 IgG1</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21121</td><td>사용 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM</td><td>Abcam</td><td>ab175702</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) 2차 항체</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21247</td><td>1:500</td></tr><tr><td>BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno)</td>의 최종 농도에서 사용 <td>ThermoFisher</td><td>D3922</td><td>1 &micro의 최종 농도에서 사용됩니다. g / mL</td></tr><tr><td>BODIPY-558 / 568 C12 (4,4- 디플루오로 -5- (2- 티에닐) -4- 보라 -3a, 4a - 디아자 -s- 인다센 -3- 도데 판산)</td> <td>ThermoFisher</td><td>D3835</td><td>1 &micro의 최종 농도에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>0.5 &micro의 최종 농도에서 사용; g/mL</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드(DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8418</td><td>1mg/mL 원액의 Bodipy를 해결하는 데 사용됩니다. CAUTION: 독성 및 인화성. 증기는 자극을 유발할 수 있습니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑, 보호 눈 고글을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>포름알데히드 용액 4%, 완충제, pH 6.9</td><td>시그마-알드리치</td><td>1004969011</td><td><강한>주의</강한>: 알레르기성 피부 반응을 일으킬 수 있습니다. 유전적 결함을 일으키는 것으로 의심됩니다. 암을 유발할 수 있습니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부와의 직접적인 접촉을 피하십시오. 고무 장갑, 보호 눈 고글을 착용하십시오.</td></tr><tr><td>Isopentane GPR RectaPur</td><td>VWR international</td><td>24872.298</td><td>주의: 인화성이 매우 높은 액체 및 증기. 삼켜서 기도로 유입되면 치명적일 수 있습니다. 졸음이나 현기증을 유발할 수 있습니다. 반복적으로 노출되면 피부가 건조하거나 갈라질 수 있습니다. 보호 장갑/보호복/보안경/안면 보호구를 착용하십시오.</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td></td><td></td><td><강한>주의</강한>:&nbsp; 매우 춥습니다. 장갑을 착용하십시오. 끓거나 튀는 것을 최소화하기 위해 환기가 잘 되는 곳에서 천천히 다루십시오. 저온 액체용으로 설계된 용기를 사용하십시오.</td></tr><tr><td>마우스 차단 시약&nbsp;</td><td>Vector Labs</td><td>MKB-2213-1</td><td>1:30</td></tr><tr><td>Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) 유전자 : MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b</td><td>DSHB University of Iowa</td><td>BA-D5-supertatanant</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) 유전자의 최종 농도에서 사용 유전자 : &nbsp; MYH2, 단클론 소 안티 마우스 IgG1</td><td>DSHB 아이오와 대학</td><td>SC-71-상등액</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Myosin 중쇄 IIX 형 (6H1-s 기본 항체)의 최종 농도에서 사용, 유전자:&nbsp; MYH1, 단클론 토끼 안티 마우스 IgM</td><td>발달 연구 하이브리도마 은행, 아이오와 대학교</td><td>6H1-상등액</td><td>1:5</td></tr><tr><td>정상 염소 세럼 (NGS)</td>의 최종 농도에서 사용됨 <td>Vector Labs</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>PBS 0.1 M</td><td></td><td></td><td>조직학 실험실에서 일반적으로 사용됨</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>쥐 항-라미닌-2 (&알파;-2 사슬) 1차 항체 (단클론)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L0663</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T 화합물</td><td>Sakura&nbsp;</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adobe Illustrator CC</td><td>어도비 Inc.</td><td></td><td>피규어 Adobe</td></tr><tr><td>Photoshop</td><td>Adobe Inc.</td>를 디자인하는 데 사용됩니다.<td></td><td>컨 포칼 소프트웨어</td></tr><tr><td>BioRender</td><td>https://biorender.com/</td><td></td> <td>그림을 디자인하는 데 사용</td></tr><tr><td>피지 / ImageJ</td><td>https://imagej.net/software/fiji/</td><td></td> <td>획득 한 이미지를 분석하는 데 사용</td></tr><tr><td>마이크로 소프트 파워 포인트</td><td>마이크로 소프트</td><td></td> 섬유 <td>유형을 스캔 한 후 전체 근육의 조직학을 재구성하는 데 사용</td></tr><tr><td>젠 블루 2.6</td><td>자이스</td><td></td><td>섬유 유형을 스캔한 후 전체 근육의 조직학을 재구성하는 데 사용됩니다.</td></tr></tbody></table>

골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

Fiber Type and Subcellular-Specific Analysis of Lipid Droplet Content in Skeletal Muscle

근막증으로 알려진 골격근 지질 침투는 비만과 노화에 따라 증가합니다. 근막증은 또한 최근에 심혈관 질환 및 암과 같은 여러 다른 장애에 대한 부정적인 예후 인자로 발견되었습니다. 과도한 지질 침투는 근육 질량과 힘을 감소시킵니다. 또한 총 교내 세포 지질 함량, 지질 액적 (LD) 형태 및 아세포 분포에 따라 지방 독성 및 인슐린 저항성을 초래합니다. 섬유 유형 (산화 대 글리콜 성)도 중요한데, 산화 섬유는 지질을 활용할 수있는 능력이 더 크기 때문입니다. 병태생리학에 중요한 영향을 미치기 때문에 LD 역학과 섬유 유형별 기능에 대한 심층적 인 연구가 보장됩니다.
본원에서, 섬유유형별 방식으로 교내 지질 함량의 정량화 및 LD 형태학 및 아세포 분포의 분석을 위한 완전한 프로토콜이 제시된다. 이를 위해, 직렬 근육 동결절편을 형광 염료 보디피 및 미오신 중쇄 이소형에 대한 항체로 염색하였다. 이 프로토콜은 서로 다른 근육을 동시에 처리하여 시간을 절약하고 가능한 아티팩트를 피할 수 있으며 피지에서 생성 된 개인화 된 매크로 덕분에 LD 분석의 자동화도 가능합니다.

본원에 기재된 프로토콜은 섬유 유형 및 아세포-특이적 방식으로 LDs를 용이하게 정량화하는 효율적인 방법을 제공한다. EDL과 발바닥과 같이 비슷한 크기의 두 근육을 함께 얼림으로써 다음 단계에 소요되는 시간과 자원이 어떻게 절반으로 감소하는지 보여줍니다.
성인 마우스 근육에서 발현된 상이한 MyHC 이소형의 면역염색, 이미지 획득 및 분석을 위한 완전한 프로토콜이 제공된다. 이 프로토콜은 1989 년 Schiaffino et al. 3 3에 의해 처음 설계된 것을 기반으로하며, 라미닌을 표지하기 위해 추가 항체를 사용하는 것과 같은 일부 조정이 있습니다. 이러한 나중의 변형은 IIb 타입 섬유의 위치에 매우 중요하며, 이는 어떠한 항체로도 염색되지 않기 때문에 검정될 것이다. 도 5에 도시된 바와 같이, 이러한 면역조직화학 프로토콜은 마우스의 느린 산화성(타입 I 및 IIa) 및 패스트-글리콜...

증가하는 증거는 골격근 내부의 지질의 과도한 침투가 지방 독성과 당뇨병을 초래한다는 것을 나타냅니다. 여기에서, 우리는 조직 처리, Bodipy로 염색, 이미지 획득 및 분석을 포함하는 완전한 프로토콜을 제시하여 섬유 유형 특이적 방식으로 지질 방울의 크기, 밀도 및 세포 내 분포를 정량화한다.

Skeletal muscle lipid infiltration, known as myosteatosis, increases with obesity and ageing. Myosteatosis has also recently been discovered as a negative ...

이 프로토콜은 지질 방울의 정량화와 섬유 유형 특정 방식으로 그들의 형태학 및 세포 내 분포의 분석을 허용한다. 이 기술은 서로 다른 근육을 동시에 처리 할 수있게하여 시간을 절약하고 독립적으로 처리 할 때 발생할 수있는 아티팩트를 피할 수 있습니다. 또한 지질 방울 정량화의 자동화를 허용합니다.근막증은 해양 근육에서 평가되었지만,이 프로토콜은 비만, 노화 및 암과 같은 다른 조건의 인간에게 번역 될 수 있습니다. 평행 한 섹션에서 동일한 섬유를 인식하는 것은 어려울 수 있지만 축삭 비틀기 또는 근육 스핀들과 같은 주목할만한 구조는 연구자가 두 슬라이드에서 동일한 섬유를 찾는 데 도움이되는 좋은 랜드 마크입니다. 먼저 근육 표본의 두 개의 연속 냉동 냉동 단면을 두 개의 사전 라벨링된 접착 슬라이드 상에 놓는다.하나는 섬유 유형을 결정하고 다른 슬라이드는 지질 함량을 정량화합니다. 근육 섬유 유형의 면역 조직 화학 검출을 위해, 소수성 펜으로 그려진 윤곽선으로 섹션을 둘러 쌉니다. 이를 습한 챔버에 넣고, 실온에서 1분 동안 얼음처럼 차가운 0.1몰 PBS로 헹구었다.다음으로, PBS를 제거하고, 블로킹 용액을 슬라이드에 첨가하고, 섭씨 37도에서 90분 동안 인큐베이션한다. 이후 블로킹 용액을 제거하고 슬라이드를 일차 항체를 함유하는 용액과 함께 섭씨 37도에서 90분 동안 인큐베이션한다. 슬라이드를 실온에서 각각 다섯 분 동안 PBS로 세 번 세척한다.이차 항체가 포함된 용액을 첨가하고 실온에서 한 시간 동안 어둠 속에서 슬라이드를 인큐베이션한 후, 슬라이드를 빛으로부터 멀리 떨어뜨리도록 보장하고 PBS로 세 번 세척을 각각 다섯 분 동안 진행한 다음, 슬라이드를 이중 증류수로 헹구고, 과량의 물을 제거한 후, 슬라이드를 안티페이드 시약으로 장착하고 빛으로부터 보호된 섭씨 네 도에 보관한다. 지질 액적을 체디피로 염색하기 위해, 10분 동안 얼음처럼 차가운 0.1 몰 PBS로 헹구기 전에 소수성 펜에 의해 그려진 윤곽선으로 근육 섹션을 둘러싸십시오. 두 슬라이드는 동시에 염색해야 합니다.실온에서 10 분 동안 메탄올이없는 차가운 4 % 파라 포름 알데히드로 섹션을 고정하십시오. 먼저 빠른 헹굼 후 슬라이드를 PBS로 세 번 세척하여 다섯 분 동안 세척한다. 슬라이드를 인간 챔버에서 한 시간 동안 PBS 중의 5% 정상 염소 혈청으로 차단한다.이어서, 슬라이드를 PBS 중의 2%정상 염소 혈청 및 래트 항라미닌을 포함하는 일차 항체의 용액과 함께 90분 동안 인큐베이션하였다. 슬라이드를 PBS로 세 번 세척한 후, 실온에서 한 시간 동안 PBS 중의 염소, 항래트, 알렉사 플루오르 647 항체를 함유하는 이차 항체 용액과 함께 다음 인큐베이션을 수행한다. 슬라이드가 빛으로부터 보호되어 있는지 확인합니다.배양 후 슬라이드 세배를 PBS로 세척한다. 다음으로, dapi 및 bodipy 용액으로 20 분 동안 섹션을 인큐베이션하십시오. 빠른 헹굼 후, PBS로 세 번 씻고, 이중 증류수로 한 번 한 번 과량의 물을 제거하고 퇴색 방지 시약으로 섹션을 장착하십시오.근육이 스캔되면 캡처 된 디지털 이미지를 재구성을 위해 이미지 처리 소프트웨어에 업로드하십시오. 섬유 형태학 및 근육 섹션의 조직학을 기반으로 모든 채널이 병합 된 적절한 형식으로 이미지를 저장하십시오. 보디피 이미지 관찰 및 수집을 위해 원고에 설명 된대로 40 X 오일 침지 대물 렌즈와 1.4의 숫자 조리개를 사용하여 공초점 현미경의 매개 변수를 설정하십시오.보디피와 558, 568, 및 라미닌 알렉사 플루오르 647 사이의 누화를 피하기 위해; 공초점 소프트웨어에서 순차적 스캔 모드를 사용합니다. 보디피 및 493, 503을 488 나노미터 레이저 라인 또는 아르곤 레이저 라인을 사용하여 여기시키고, 561 나노미터 다이오드 레이저 라인을 사용하여 보디피 및 555, 568을 여기시킨다. 마지막으로, 선택한 염료에 따라 640 나노 미터 다이오드 레이저 라인으로 라미닌 알렉사 플루오르 647을 감지하여 보디피의 경우 570 ~ 650 나노 미터로 방출 속도를 설정하고 493, 503으로 설정합니다.및 보디피에 대해 565 내지 620 나노미터이고 558, 568이다. 라미닌의 방출 범위를 656 ~ 700 나노 미터로 설정하십시오. 그런 다음 범위 표시기에서 포화 픽셀이 감지되지 않도록 게인과 디지털 게인을 적절하게 설정하십시오.오프셋을 조정하여 배경 신호를 수정합니다. 공초점 현미경에서 섬유의 유형을 확인하려면, 섬유 유형 면역 검출과 함께 이전에 재구성 된 슬라이드의 이미지를 확인할 수있는 노트북을 사용하십시오. 섬유 그룹이 올바르게 식별되면 보디피 및 라미닌 채널로 이미지를 획득하십시오.피지에서 바이오 포맷의 수입업자의 도움으로 각 이미지를 엽니 다. 옵션이있는 뷰 스택에서 하이퍼 스택을 선택한 다음 색상 모드와 기본값을 선택하십시오. 자동 크기 조정 창이 선택되어 있는지 확인합니다.자유로운 손 선택 도구를 사용하여 라미닌 채널을 기반으로 섬유의 사르콜레마를 수동으로 선택하십시오. 키보드의 T를 눌러 ROI 창에 관심 영역을 기록합니다. 피지의 메인 창으로 이동하여 분석을 클릭하고 측정을 설정하십시오.그런 다음 팝업 창에서 영역을 선택하고 지름을 올린 경우 나머지 상자를 선택하지 않고 다른 매개 변수를 기본적으로 나타나는 그대로 둡니다. ROI 창에서 측정을 클릭하여 선택한 섬유의 제기 된 직경에 대해 면적과 최소값을 얻고 나중에 사용할 수 있도록 기록하십시오. 섬유의 중앙 부분을 구분하기 위해 상승된 직경에 대한 최소 여섯 번째 값을 계산합니다.ROI 창을 클릭하고 추가를 클릭하여 첫 번째 ROI를 복제하고 창에 나타나는 두 번째 ROI를 선택하십시오. 피지의 메인 창에서 편집을 클릭 한 다음 선택 및 확대를 클릭하십시오. 숫자 앞에 빼기 기호가있는 이전에 계산 된 값을 소개하고 확인을 클릭하십시오.ROI 창에서 추가를 클릭하고 세 번째 ROI가 나타나야 하며 삭제하여 두 번째 ROI를 삭제합니다. ROI 창에서 두 ROI를 모두 선택하고 ZOR 이상을 클릭하고 추가 한 다음 섬유의 주변에 해당하는 세 번째 ROI가 나타날 때까지 기다립니다. 동일한 섬유를 다시 분석해야하는 경우 더 많은 것을 클릭하여 ROI를 저장 한 다음 저장하십시오.bodipy 채널을 선택하고 피지의 메인 창에서 이미지, 조정 및 임계 값 탭을 클릭하여 임계 값 도구를 엽니 다. 임계값 팝업 창에서 값을 70과 255로 설정합니다. 그런 다음 엔과 흑백 방법을 선택하십시오.어두운 배경을 클릭하기 전에. 마지막으로 적용 탭을 누르십시오. 피지의 메인 창으로 이동하여 분석을 클릭하고 측정을 설정하십시오.팝업 창에서 영역, 영역 부분을 선택하고 임계값으로 제한합니다. 나머지 상자와 매개 변수는 기본값으로 둡니다. ROI 창으로 이동하여 첫 번째 ROI를 선택합니다.피지의 메인 창에서 분석을 클릭 한 다음 입자 도구를 분석하십시오. 분석된 파티클 창에서 값을 두 개에서 무한대로 설정하고 픽셀 상자를 선택합니다. 기본 원형 값을 유지하고 확인을 클릭하기 전에 요약을 선택합니다.섬유의 중심과 둘레의 값을 얻으려면 매번 두 번째 및 세 번째 ROI의 선택을 반복하십시오. 그런 다음 파일을 클릭하여 결과를 저장 한 다음 요약 창에서와 같이 저장하십시오. 파일 이름에 광섬유 유형을 포함합니다.이러한 면역조직화학 프로토콜은 마우스, 타입 1 및 2A와 같은 느린 산화 섬유, 타입 2X 및 2B와 같은 빠른 글리콜 섬유, 및 하이브리드 섬유의 존재를 인식할 수 있게 한다. 근섬유의 상승된 직경에 대한 면적 및 최소를 측정함으로써 크기 의존적 감소를 적용하여 각 섬유의 중앙 및 주변 영역을 구하였다. 축삭 나뭇 가지나 근육 스핀들과 같은 각 근육 부분의 놀라운 구조는 양쪽에서 동일한 섬유를 찾는 데 도움이되는 좋은 랜드 마크입니다.공초점 현미경에 의한 보디피 라미닌 염색을 획득하기 위해 설명된 설정. 세 개에서 여섯 개의 섬유까지 지질 방울의 크기, 수 및 분포를 동시에 시각화하고 분석할 수 있습니다. 이 방법은 또한 세 가지 중요한 파라미터, 즉 지질 액적이 차지하는 섬유 영역의 백분율, 지질 액적의 밀도 및 평균 크기의 정량화를 허용했다.부적절한 동결 절차와 이소펜탄의 적절한 온도를 달성하지 못하면 근육 섬유 내부에 얼음 결정이 형성되었습니다. 절편이 횡단으로 정렬되지 않았을 때 지질 액적 정량화 및 섬유, 근육 또는 동물 간의 비교는 수행될 수 없었다. 두 번째 슬라이드의 처리는 첫 번째 슬라이드와 동시에 수행되어야 합니다.15분 동안 동결절편 후 슬라이드를 공기 건조하면 지질 액적의 크기 및 수가 크게 감소할 것이다. Bodipy는 지질 방울과 다른 세포 소기관, 또는 단백질 스택과 다른 스펙트럼의 형광 또는 유전자 변형 GFP 모델과의 상호 작용을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 근막증은 여러 질병에 대한 예후 불량 인자로 보고되었다.따라서이 기술은 질병의 진행을 모니터링하거나 치료 효과를 평가하는 데 사용될 수 있습니다.

fiber-type-subcellular-specific-analysis-lipid-droplet-content

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오에서는 세포 내 글리코겐 분포를 시각화하고 정량화하기 위해 인간 골격근 조직의 샘플 준비와 투과 전자 현미경을 위한 염색을 보여줍니다.

인간 골격근의 글리코겐 분포를 정량화하기 위한 투과 전자 현미경

인간의 근육에서 유래한 주요 부착 세포 유형은 근육 세포와 섬유아세포입니다. 여기에서 세포 집단은 CD56 항원을 기반으로 하는 자기 활성화 세포 분류를 사용하여 농축됩니다. 이후 특정 항체를 사용한 면역 라벨링과 이미지 분석 기법을 사용하여 개별 세포의 세포질 및 핵 특성을 정량화할 수 있습니다.

인간의 골격근에서 기본 근육 조직 세포와 섬유 아 세포의 분리 및 정량 면역 세포 화학 특성

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

골격 근육 섬유 타입의 최신의 판별자로 떠오르고 있다 Immunohistochemical myosin 무거운 체인 isoforms의 얼룩 (즉, 유형 I, 유형 IIA, IIX 입력, IIB를 입력). 여기, 우리는 섬유 유형 및 섬유 형태학의 급속 한 평가 용이 하 게 하는 소설 반 자동화 알고리즘 함께 얼룩 프로토콜을 제시.

마우스 골격 근육 형태와 섬유 형 구성의 반 자동화 된 분석

수정 된 고정 후 절차는 조직에서 글리코겐 입자의 대비를 증가시킵니다. 이 논문은 조직을 처리하고, 이미징을 수행하고, 입체 학적 방법을 사용하여 골격근에서 섬유 유형 별 세포 내 글리코겐 분포에 대한 편향되지 않은 정량적 데이터를 얻는 방법을 설명하는 단계별 프로토콜을 제공합니다.

투과 전자 현미경을 이용한 골격근섬유의 세포하 글리코겐 분포의 정량화

Shotgun 질량분석법 기반 지질체학은 다양한 설치류 조직에서 한 번의 측정으로 광범위한 지질 등급에 대한 민감한 정량적 스냅샷을 동시에 제공합니다.

설치류 조직의 산탄총 지질체

건강한 근육 조직을 근육 내 지방으로 대체하는 것은 인간의 질병과 상태의 두드러진 특징입니다. 이 프로토콜은 근육 내 지방을 시각화, 이미지 및 정량화하는 방법을 간략하게 설명하여 근육 내 지방 형성의 기초가되는 메커니즘에 대한 엄격한 연구를 가능하게합니다.

근육 내 지방 형성과 골격근의 세포 기원을 조사하는 가이드

여기에서 우리는 간 조직의 지질 액적 특성 분석을 위해 최적화된 BODIPY 493/503 형광 기반 프로토콜을 입증합니다. 직교 투영 및 3D 재구성의 사용을 통해 형광단은 미세소포와 대소포성 지방증 사이의 성공적인 구별을 가능하게 하고 간 지방증 평가를 위한 고전적인 조직학적 프로토콜에 대한 보완적인 접근 방식을 나타낼 수 있습니다.

간 지방증 평가를 위한 3D 재구성을 통한 형광 염색 지질 방울 분석

본 연구는 온전한 근육 부피를 통해 근육 내 지방 조직(IMAT) 침착을 시각화 및 정량화하고 IMAT를 구성하는 개별 지방 세포의 메트릭을 정량화하기 위한 탈세포화 기반 방법론을 설명합니다.

골격근 지방 침윤의 탈세포화 기반 정량화

이 프로토콜은 동결 건조된 인간 골격근에서 단일 섬유 분리 및 도트 블로팅 기술을 사용하여 미오신 중쇄(MHC) 동형에 따른 섬유 유형 분류를 보여줍니다. 확인된 MHC I 및 II 섬유 샘플은 웨스턴 블로팅을 사용하여 단백질 발현의 섬유 유형별 차이에 대해 추가로 분석할 수 있습니다.

인체 골격근의 섬유 유형 식별

우리는 성인 마우스의 6개 근육에서 다양한 길이와 유형의 효소로 해리된 섬유를 얻기 위한 프로토콜을 설명합니다: 그 중 3개는 이미 설명되었고(flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) 그 중 3개는 처음으로 성공적으로 해리되었습니다(extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis

배우세요 골격근 섬유 유형별 지질 액적 정량 및 형태 분석 방법을. 동시 처리로 시간을 절약하고 아티팩트를 방지하며, 비만과 암 등 인체 연구에도 적용 가능한 효율적인 프로토콜입니다.

골격근의 지질 액적 함량의 섬유 유형 및 세포내 특이적 분석

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