Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing

이 프로토콜은 생체 내 및 마우스 앞니 줄기 세포 틈새의 표지 유지 세포의 3차원 시각화 및 정량화 방법을 설명합니다. 이 기술은 새로운 학습자에게 시간을 절약하고 사용자 친화적입니다. 3D 이미지는 조직을 손상시키지 않고 획득됩니다.

3D 정량 분석은 데이터를 보다 신뢰성 있고 정확하게 만듭니다. 시작하려면 하악골을 해부하십시오. 샘플을 4% 파라포름알데히드에 고정하고 밤새 실온에 보관합니다.

부화 후 하악골에서 근육을 제거하십시오. 0.5몰 에틸렌디아민테트라아세트산 용액에 담가 섭씨 37도 셰이커에서 매일 배지를 교체하면서 4일 동안 석회질을 제거합니다. 섭씨 37도 셰이커에서 하루 동안 25% Quadrol 용액 15ml에 하악골을 탈색하여 남은 헴을 제거합니다.

전체 마운트 5-에티닐-2-프라임-데옥시우리딘 염색을 위해, 본문에 언급된 바와 같이 신선한 5-에티닐-2-프라임-데옥시우리딘 표지 칵테일을 제조한다. 섭씨 37도 셰이커에서 Tween 20 또는 PBST를 사용하여 인산염 완충 식염수로 하악골을 30분 동안 헹굽니다. 하악골을 인산염 완충 식염수로 각각 3분 동안 세 번 헹구는 것을 반복한 다음, 새로 제조된 5-에티닐-2-프라임-데옥시유리딘 표지 칵테일에서 밤새 진탕에서 배양합니다.

인산염 완충 식염수 세척을 3회 반복하고 섭씨 37도 셰이커에서 각각 6시간 동안 텍스트에 언급된 용액에 하악골을 넣어 연속 지질 제거를 수행합니다. tert- 부탄올 - 폴리에틸렌 글리콜 또는 tB-PEG 용액에서 하악골을 섭씨 37도에서 2 일 동안 탈수하고 매일 배지를 교체합니다. 이틀 후, 75 % 벤질 벤조 에이트, 22 % 폴리에틸렌 글리콜-메틸 에테르 메타 크릴 레이트 평균 500 또는 PEG-MMA500 및 3 % Quadrol을 함유 한 벤질 벤조 에이트-폴리에틸렌 글리콜 클리어링 배지에서 하악을 깨끗이하여 굴절률 일치를 얻고 투명성이 달성 될 때까지.

벤질 벤조에이트-폴리에틸렌 글리콜 투명 매체의 브랜드 캐비티 슬라이드에 조직 투명 전체 하악골을 장착하고 유리 커버 슬라이드로 덮습니다. 컨포칼 이미징 소프트웨어에서 원하는 이미지 획득 파라미터를 설정합니다. 형광 여기 패널에서 형광단을 최적으로 여기시키는 데 필요한 레이저를 활성화합니다.

형광 검출용 패널에서 슬라이더를 움직여 측정할 파장을 선택합니다. 커버슬립 위에 굴절률이 1.52인 침지 오일 한 방울을 추가하여 유리 커버슬립과 대물렌즈의 굴절률과 일치시키고 장착된 하악을 현미경 스테이지에 놓습니다. 형광등을 켜고 적절한 배율 대물렌즈를 선택하여 관심 영역을 이미지화합니다.

라이브 스캔 모드에서 시야를 식별하여 하악의 전체 영역을 X 및 Y 차원으로 시각화합니다. 마우스 앞니에서 줄기 세포 틈새의 부피를 정확하게 커버하는 상위 및 하단 Z 단계 획득 매개 변수를 설정합니다. 2마이크로미터의 Z 스텝 크기를 사용하거나 요구 사항에 따라 사용하십시오.

Z-stack 이미지 파일을 lif 형식으로 획득하고 저장합니다. 이미징 소프트웨어 파일 변환기를 사용하여 Z 스택 이미지 파일을 네이티브 형식 파일 형식으로 변환합니다. 이미징 소프트웨어에서 Arena 버튼을 클릭한 다음 Image를 선택합니다.

원본 lif 파일을 선택하고 병합된 파일을 선택합니다. 이미지를 이미징 소프트웨어로 가져옵니다. 가져온 파일을 두 번 클릭하여 이미지 데이터 세트를 엽니다.

이미징 소프트웨어에서 디스플레이 조정 패널을 방문하십시오. 디스플레이 조정 패널에서 채널 이름을 클릭합니다. 일반적으로 기본 모드에서는 빨간색으로 표시됩니다.

Image Properties(이미지 속성) 창에서 Mapped Color(매핑된 색상) 탭을 클릭합니다. Color Tab File(색상 탭 파일) 옵션에서 Fire Flow(Fire Flow)를 선택한 다음 OK(확인)를 클릭합니다. 배경 형광과 양성 형광을 샘플과 구별하기 위해 표시 색상을 선택합니다. 화면 왼쪽 상단의 Scene Properties 창에서 Add New Surface라는 파란색 아이콘을 클릭합니다.

볼륨 아이콘을 선택 취소하면 대부분의 배경 형광이 제거되어 수동 분할 중에 양성 형광이 뚜렷하게 표시됩니다. 그런 다음 Create 탭을 클릭하고 Skip automatic creation, edit manually 탭을 선택하여 관심 영역 또는 ROI의 수동 세분화를 시작합니다. 수동 서피스 작성 마법사에서 등고선 탭을 클릭하여 샘플을 기반으로 방향을 선택하여 ROI를 쉽게 컨투어링할 수 있습니다.

그런 다음 오른쪽 모서리에 있는 포인터 메뉴가 선택 모드인지 확인합니다. 슬라이스 위치를 조정하여 조직에서 ROI를 찾습니다. 앞서 언급했듯이 대부분의 배경 형광은 이미 제거되었습니다.

그리기 버튼을 클릭하고 잠정 관심 영역을 그립니다. ROI 이외의 다른 영역으로부터의 간섭을 피하기 위해 가시성(Visibility) 옵션을 없음(None)으로 선택한 다음, 관심 영역을 슬라이스별로 세그먼트화합니다. ROI 도면이 완료되면 표면 생성을 클릭하여 ROI의 3D 지오메트리를 가져옵니다.

수동 서피스 작성 마법사에서 편집(Edit) 버튼을 클릭하고 전체 마스크(Mask All)를 선택합니다. 튀어나온 마스크 채널 창의 채널 선택 옵션에서 채널 1을 선택합니다. 그런 다음 마스크를 적용하기 전에 채널 복제를 선택합니다.

마스크 설정에서 내부/외부 일정(Constant inside/outside)을 선택하고 복셀 외부 표면을 0으로 설정합니다. 장면 속성(Scene Properties) 창에서 서피스(Surface) 오브젝트를 선택 취소하고 볼륨(Volume) 오브젝트를 선택합니다. [디스플레이 조정]에서 원래 [빨강] 채널을 선택 해제하고 [마스크 빨강] 채널을 선택합니다.

그리고 색상 강도를 조정하여 원하는 3D 렌더링 및 포지티브 라벨링된 형광 ROI를 얻을 수 있습니다. 스팟 아이콘을 클릭하여 새 별색 오브젝트를 만들면 3D 렌더링된 레이블 유지 셀과 비슷하게 겹치는 3D 스팟을 만들어 3D 렌더링된 레이블 유지 셀을 수량화할 수 있습니다. 아래쪽 화살표를 사용하여 스팟 생성 마법사의 단계 사이를 이동합니다.

Finish(마침) 버튼을 클릭하고 Statistic(통계) 버튼을 선택합니다. 그런 다음 전체 탭을 선택하여 이미지의 총 스팟 수에 대한 값을 찾습니다. 5-에티닐-2-프라임-데옥시유리딘 표지 및 폴리에틸렌 글리콜-관련 용매 시스템 조직-투명 하악골 처리 후, 투명한 하악골을 수득하였다.

변형된 샘플을 조직 투명화 과정 없이 정상 하악과 비교하고, 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine-labeling으로 투명한 하악골을 공초점 이미징을 실시하였다. 앞니의 광학 섹션은 XY 평면에서 앞니 정점의 줄기 세포 틈새에서 표지 유지 세포를 보여주었습니다. 앞니 정점의 3D 이미지 구성은 상피 및 중간엽 줄기 세포 틈새 모두에서 5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine 양성 표지 유지 정지 줄기 세포를 보여주었습니다.

5-ethynyl-2-prime-deoxyuridine 양성 세포는 정량화를 위해 중간엽 표지 유지 세포와 비교적 겹치는 지점으로 옮겨졌습니다. 중간엽 표지 유지 세포와 상피 표지 유지 세포에 대해서만 생성된 반점이 이미지에서 볼 수 있습니다. 상피 및 중간엽 표지 유지 세포의 정량화도 수행하였다.

가공 및 제거에 대한 특성은 가장 중요한 단계이며 만족스러운 결과를 얻으려면 조직의 용도에 따라 최적화해야 합니다. 이 방법은 또한 S2VGFP 수준 LRC를 시각화하고 세포 계통 추적에서 자손 위치 및 정량 또는 기여도에 대한 세부 정보를 얻기 위해 수정할 수 있습니다.