Name: 인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: 학습하세요 장기 온 칩 기술과 생검 유래 장기 오가노이드를 통합하여 생리학적으로 관련된 장 칩을 생성하는 방법을. 이 플랫폼은 약동학 및 약물 상호작용을 예측하고 장 상피 장벽 기능 장애를 연구하는 데 활용됩니다.

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우리는 장 생검 유래 오가노이드를 제공 한 Mark Donowitz 교수와 칩, 휴대용 및 문화 모듈의 과학적 삽화를 설계 한 Brett Clair에게 감사드립니다. 나머지 모든 과학적 삽화는 BioRender를 사용하여 생성되었습니다.

<ol><li>Fritz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+clinically+relevant+drug-metabolizing+enzymes+along+the+human+intestine+and+their+correlation+to+drug+transporters+and+nuclear+receptors%3A+An+intra-subject+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+and+Clinical+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis.</a> Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).</li>
<li>Okumura, R., Takeda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+intestinal+homeostasis+by+mucosal+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammation+and+Regeneration%22%5BJournal%5D)">Maintenance of intestinal homeostasis by mucosal barriers.</a> Inflammation and Regeneration. 38 (1), 1-8 (2018).</li>
<li>Delgado, M. E., Grabinger, T., Brunner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+at+the+intestinal+epithelial+front+line%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Cell death at the intestinal epithelial front line.</a> FEBS Journal. 283 (14), 2701-2719 (2016).</li>
<li>Mestas, J., Hughes, C. C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Of+mice+and+not+men%3A+Differences+between+mouse+and+human+immunology%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Of mice and not men: Differences between mouse and human immunology.</a> The Journal of Immunology. 172 (5), 2731-2738 (2004).</li>
<li>Sun, H., Chow, E. C. Y., Liu, S., Du, Y., Pang, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caco-2+cell+monolayer%3A+Usefulness+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Drug+Metabolism+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The Caco-2 cell monolayer: Usefulness and limitations.</a> Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 4 (4), 395-411 (2008).</li>
<li>Yu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+contributions+of+human+mini-intestines+to+the+study+of+intestinal+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The contributions of human mini-intestines to the study of intestinal physiology and pathophysiology.</a> Annual Review of Physiology. 79, 291-312 (2017).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%E2%80%99s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Spence, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+into+intestinal+tissue+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells into intestinal tissue in vitro.</a> Nature. 470 (7332), 105-110 (2011).</li>
<li>Durel, J. F., Nerurkar, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+vertebrate+gut+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Genetics+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of vertebrate gut morphogenesis.</a> Current Opinion in Genetics and Development. 63, 45-52 (2020).</li>
<li>Gayer, C. P., Basson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+mechanical+forces+on+intestinal+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Signalling%22%5BJournal%5D)">The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology.</a> Cellular Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+activates+Piezo1+to+promote+mucin2+expression+in+goblet+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gastroenterology+and+Hepatology+%28Australia%29%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation activates Piezo1 to promote mucin2 expression in goblet cells.</a> Journal of Gastroenterology and Hepatology (Australia). 36 (11), 3127-3139 (2021).</li>
<li>Navabi, N., McGuckin, M. A., Lindén, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+cell+lines+form+polarized+epithelia+with+an+adherent+mucus+layer+when+cultured+in+semi-wet+interfaces+with+mechanical+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal cell lines form polarized epithelia with an adherent mucus layer when cultured in semi-wet interfaces with mechanical stimulation.</a> PLoS One. 8 (7), 68761(2013).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+primary+human+Small+Intestine-on-a-Chip+using+biopsy-derived+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li>
<li>Kasendra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenum+intestine-chip+for+preclinical+drug+assessment+in+a+human+relevant+model%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Duodenum intestine-chip for preclinical drug assessment in a human relevant model.</a> eLife. 9, 50135(2020).</li>
<li>Apostolou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microphysiological+colon+platform+to+decipher+mechanisms+driving+human+intestinal+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">A novel microphysiological colon platform to decipher mechanisms driving human intestinal permeability.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (5), 1719-1741 (2021).</li>
<li>Jalili-Firoozinezhad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Author+correction%3A+A+complex+human+gut+microbiome+cultured+in+an+anaerobic+intestine-on-a-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Author correction: A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip.</a> Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 583(2019).</li>
<li>Yin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluid+shear+stress+enhances+differentiation+of+jejunal+human+enteroids+in+Intestine-Chip%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fluid shear stress enhances differentiation of jejunal human enteroids in Intestine-Chip.</a> American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (3), 258-271 (2021).</li>
<li>Sontheimer-Phelps, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+colon-on-a-chip+enables+continuous+in+vitro+analysis+of+colon+mucus+layer+accumulation+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Human colon-on-a-chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).</li>
<li>Tovaglieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Species-specific+enhancement+of+enterohemorrhagic+E.+coli+pathogenesis+mediated+by+microbiome+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites.</a> Microbiome. 7 (1), 43(2019).</li>
<li>Huh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+of+human+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Microfabrication of human organs-on-chips.</a> Nature Protocols. 8 (11), 2135-2157 (2013).</li>
<li>Fujii, M., Matano, M., Nanki, K., Sato, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+genetic+engineering+of+human+intestinal+organoids+using+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Efficient genetic engineering of human intestinal organoids using electroporation.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1474-1485 (2015).</li>
<li>Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gut-on-a-chip+inhabited+by+microbial+flora+that+experiences+intestinal+peristalsis-like+motions+and+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow.</a> Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).</li>
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<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-gamma+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergize+to+induce+intestinal+epithelial+barrier+dysfunction+by+up-regulating+myosin+light+chain+kinase+expression%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Interferon-gamma and tumor necrosis factor-alpha synergize to induce intestinal epithelial barrier dysfunction by up-regulating myosin light chain kinase expression.</a> The American Journal of Pathology. 166 (2), 409-419 (2005).</li>
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<li>Grassart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+human+organ-on-chip+reveals+intestinal+microenvironment+and+mechanical+forces+impacting+shigella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Bioengineered human organ-on-chip reveals intestinal microenvironment and mechanical forces impacting shigella infection.</a> Cell Host and Microbe. 26 (3), 435-444 (2019).</li>
<li>Kerns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunocompetent+organ-on-chip+platforms+allow+safety+profiling+of+tumor-targeted+t-cell+bispecific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human immunocompetent organ-on-chip platforms allow safety profiling of tumor-targeted t-cell bispecific antibodies.</a> eLife. 10, 67106(2021).</li>
<li>Bhatia, S. N., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Microfluidic organs-on-chips.</a> Nature Biotechnology. 32 (8), 760-772 (2014).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+engineering+human+pathophysiology+with+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reverse engineering human pathophysiology with organs-on-chips.</a> Cell. 164 (6), 1105-1109 (2016).</li>
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Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi 및 Magdalena Kasendra는 Emulate Inc.의 현재 또는 이전 직원이며 지분을 보유 할 수 있습니다. Emulate Inc.는 오르간 칩 장치를 제조하고이 기사에 명시된 작업과 관련된 특허를 발표 한 회사입니다.

장기 온 칩 기술과 장내 오가노이드의 결합은 인간의 장 생리학 및 병리 생리학의 정확한 모델링을 약속합니다. 여기서, 우리는 미세유체 장치에서 공동 배양된 생검 유래 소장 또는 결장 상피 및 장 미세혈관 내피 세포를 함유하는 장 칩의 확립을 위한 간단하고 강력한 단계별 프로토콜( 도 1에 요약됨)을 제공한다. 인간 창자에 대한 이 칩 기반 시뮬레이션은 생리적, 발광적, 혈관 흐름과 연동 운동과 같은 움직임을 통합합니다. 또한, 우리는 십이지장 칩의 약물 대사 및 결장 칩의 장벽 기능과 같은 중요한 장 기능의 평가를위한 절차를 설명합니다.
장내 항상성의 유지와 칩상의 장 조직의 정확한 모델링에 필수적인 상피-내피 세포 상호작용을 재구하기 위해서는 PDMS 막의 양쪽에 기능적이고 온전한 세포 단층을 확립하는 것이 중요하다. 성공적인 칩 시딩을 향한 첫 번째 단계는 PDMS 표면과 ECM 단백질 사이의 안정적인 결합의 개발을 허용하...

인간의 창자는 자기 재생이 가능한 복잡하고 멀티 태스킹 기관입니다. 그것은 소장과 대장으로 나뉩니다. 소장의 주요 기능은 위장에서 나오는 음식을 더 소화하고 모든 영양소를 흡수하며 잔류 물을 대장으로 전달하여 물과 전해질을 회수하는 것입니다. 소장은 해부학적으로 구별되는 여러 영역으로 더 나뉘어집니다 : 십이지장, 제주눔 및 장폐색은 각각 특정 기능을 수행하도록 조정됩니다. 예를 들어, 십이지장은 제주눔에서 단백질, 탄수화물, 비타민 및 미네랄을 포함하는 영양소의 적절한 흡수를 가능하게하기 위해 chyme (위 내용물)을 분해하는 데 도움이됩니다. 소장의 이러한 근위 부분은 또한 장내 약물 흡수 및 대사의 주요 부위이며, 장폐색 및 결장1에서의 발현에 비해 약물 대사 효소 (예를 들어, CYP3A4)의 발현이 더 높은 것을 특징으로합니다. 영양소의 소화 및 흡수에 대한 주요 역할 외에도 창자는 병원성 미생물, 미생물 대사 산물,식이 항원 및 독소 2,3과 같은 잠재적으로 유해한 발광 내용물에 대한 효과적인 장벽이기도합니다. 인간의 결장에는 많은 수의 미생물이 서식하고 있으며, 인체의 총 세포보다 훨씬 많으며 영양, 신진 대사 및 면역에 많은 이점을 제공한다는 점은 주목할 만합니다. 따라서, 장 상피 세포에 의해 형성된 점막 장벽의 완전성의 유지는 불필요한 면역 세포 활성화를 피하기 위해 이들을 물리적으로 분리함으로써 장내 미생물과 숙주 세포 사이의 공생 관계를 허용하는 데 매우 중요하다2. 또한, 프로그램된 장 세포 사멸은 감염된 세포가 지속되거나 증식하는 것을 방지하여 잠재적 병원체3를 전파하는 것을 방지하는 자기 보호 메커니즘으로서 필수적인 역할을 하며, 사흘에서 칠일마다 장 상피의 지속적인 자기 재생은 장벽 완전성과 조직 항상성을 보장하는 세포 손실을 보상합니다. 영양 흡수, 장벽 완전성 또는 장 세포 사멸 및 자기 재생의 불균형을 포함하여 설명 된 장 기능의 손상은 영양 실조 및 염증성 장 질환 (IBD)2,3을 포함한 다양한 위장 장애의 발달을 초래할 수 있습니다.
이전에, 동물 모델 및 형질전환된 암 유래 장 세포주는 인간 장 조직의 생리학적 및 병리생리학적 기능을 연구하는데 사용되어 왔다. 그러나, 두 종 사이에 상당한 불균형의 존재로 인한 인간에 대한 동물 연구의 번역성에 대한 점점 더 두드러진 우려는 인간 관련 대안 방법4에 대한 필요성을 강조했다. 일반적으로 사용되는 시험관내 장 세포주는 T84, Caco-2 및 HT29 세포를 포함한다. 그들은 장 장벽 기능과 막 수송의 특정 측면을 모방하지만, 약물 대사 효소5, 표면 수용체 및 수송체4의 변경된 발현을 특징으로합니다. 또한, 그들은 장 세그먼트 특이성이 부족하고 장 상피의 복잡성을 회복하지 못하며, 각 모델은 장내에 존재하는 다섯 가지 상피 세포 유형 중 하나만 포함합니다6.
최근에, 소장 및 결장7,8 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)9의 신선한 생검으로부터 확립된 인간 장 오가노이드 배양물이 미래에 동물 실험을 보완, 감소 및 대체할 수 있는 잠재력을 갖는 대안적인 실험 모델로서 도입되었다. iPSC는 비침습적 방식으로 얻을 수 있지만, iPSC로부터 오가노이드를 확립하려면 복잡하고 긴 프로토콜(몇 가지 실험 단계 포함)을 사용해야 하며 인간 태아 조직과 유사한 배양물을 생성합니다. 대조적으로, 생검 유래 오가노이드는 장 조직의 고유 한 재생 능력을 활용할 수 있고 시험관 내에서 무기한 계대 및 전파 될 수 있기 때문에 확장성이 뛰어납니다. 중요하게도, 생검 유래 오가노이드는 이들이 개발된 일차 조직의 질환 및 장 부위 특이적 특성을 유지하고 장 상피의 세포 다양성을 에뮬레이트한다. 오가노이드는 다양한 위장 장애의 생물학 및 병인을 풀고 치료 관리를 개선하기 위해 시험관 내에서 환자 특이적 아바타로 사용할 수 있습니다. 장내 오가노이드는 인상적인 수준의 생리적 기능을 달성했지만, 혈관, 결합 조직, 말초 신경 및 면역 세포를 포함한 중요한 기질 구성 요소와 기계적 자극이 없기 때문에 네이티브 기관의 복잡성을 재현하지 못합니다. 유동, 전단 응력, 스트레치 및 압력과 같은 기계적 파라미터 는 생체내에서 조직 형태형성 및 항상성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 이전에 시험관내10,11,12,13에서 세포의 성숙을 향상시키는 것으로 나타났다. 오가노이드 시스템의 또 다른 중요한 단점은 내강이 접근 할 수 없기 때문에 상피의 정점 측에 접근 할 수 없다는 것입니다. 이는 이온 및 약물 수송체의 편광된 발현, 숙주-마이크로바이옴 상호작용, 및 제약 독성 시험과 관련된 다양한 메카니즘을 조사하기 위한 도전을 제시한다. 마지막으로, 오가노이드 배양물은 시험관내 자기 조직 과정 및 세포 운명 선택의 확률적 특성으로 인해 크기, 형태학 및 기능면에서 상당한 변동성을 겪습니다. 따라서 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 재생 의학에서 장 오가노이드의 잠재력을 최대한 실현하려면 오가노이드 개발의 변동성을 줄이고 발광 구획에 대한 접근성을 향상 시키며 누락 된 세포 - 세포 상호 작용을 통합하는 새로운 전략을 모색 할 필요가 있습니다.
Organ-on-a-Chip 기술은 시험관 내에서 장내 세포 배양물에 기계적 힘과 유체 흐름을 통합하기위한 많은 기술을 도입했습니다. 그러나, 초기 개념 증명 연구의 대부분은 충분한 세포 다양성을 나타내지 않은 암 유래 세포주를 사용했기 때문에, 이들 시스템의 관련성에 의문이 제기되어 왔다. 최근에, 우리는 장내 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 시너지 효과로 결합하여 각 접근법의 최상의 특징을 하나의 시험관 내 시스템14,15,16에 통합했습니다. 그 결과 장-칩은 장 상피의 다세포 구조, 상피-내피 조직 계면의 존재, 유체 흐름과 스트레칭의 기계적 힘을 되새겨 시험관 내에서 장기 수준 기능의 에뮬레이션을 가능하게 합니다. 추가적으로, 출발 물질로서 원발-조직 유래 오가노이드(인간 장의 상이한 영역으로부터 샘플링될 수 있음)의 사용은 인간 십이지장, 제주눔, 장폐색 및 결장을 나타내는 칩이 유사한 시딩 및 배양 절차에 따라 확립될 수 있기 때문에, 이 모델의 다재다능성을 증가시킨다. 중요하게도, 장-칩은 다음과 같은 실시간 평가를 가능하게 한다: 장 장벽 완전성; 브러쉬 경계 및 약물-대사 효소의 활성; 뮤신의 생산; 사이토카인의 분비; 이전에 발표 된 보고서에서 입증 된 바와 같이 장내 세포와 병원성 및 공생 미생물의 상호 작용. 특히, 다른 개인의 조직에서 생성 된 오가노이드를 사용하여 장 칩을 확립했을 때,이 모델은 다양한 약물 및 치료에 대한 기능적 반응에서 예상되는 기증자 간 변동성을 포착했습니다. 전체적으로 오가노이드를 Organ-on-a-Chip 기술과 병합하면 시험관 내 발견의 생리적 관련성과 정확성뿐만 아니라 인간에 대한 외삽을 향상시킬 수있는보다 진보되고 개인화 된 생체 관련 모델의 문이 열립니다. 여기에서, 장 칩을 확립하고 두 장의 세그먼트의 생리 기능 연구에 적용하기위한 상세한 프로토콜이 제시됩니다 : 십이지장과 결장. 먼저, 십이지장 칩에서 약물 대사 효소 CYP3A4의 활성을 평가하는 방법뿐만 아니라 리팜피신 및 비타민 D3와 같은 원형 화합물에 의한 그의 유도가 기재되어 있다. 둘째, 결장 칩에서 "새는 장"을 모델링하는 데 필요한 단계는 프로토콜에 요약되어 있으며, 상피 장벽의 붕괴는 IBD의 발병기전에 연루된 특징적인 사이토카인을 사용하여 수행됩니다. 간략하게, 인간 생검으로부터 유래된 오가노이드는 시험관내에서 전파되고, 효소적 소화를 겪고, 칩의 상부 채널에 도입된다. 성장 인자가 풍부한 배지와의 지속적인 관류가 존재할 때 그들은 3D 아키텍처와 쉽게 접근 할 수있는 정점 세포 표면을 갖춘 합류 상피 단층으로 발전합니다. 바닥, "혈관" 칩 구획은 소장 또는 대장으로부터 분리된 미세혈관 내피 세포로 시딩된다. 상피와 내피는 다공성 연신 가능한 막으로 분리되어 두 조직 간의 파라크린 상호 작용을 용이하게하고 순환 변형을 겪을 때 인간의 내장의 연동 운동과 같은 움직임을 모방합니다. 공동-배양은 적절한 세포 배양 배지를 사용한 발광 및 혈관 관류에 의해 생성된 동적 유동 조건 하에서 유지된다. 마지막으로, 우리는 온칩 또는 샘플링 된 세포 배양 유출물에서 직접 수행 할 수있는 수많은 유형의 분석 및 종점 분석을 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>소장 인간 장 미세혈관 내피 세포</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE15</td><td>0.5 세포 M/ml ; 냉동 보존</td></tr>된 <tr><td>결장 인간 장 미세혈관 내피 세포</td><td>AlphaBioRegen</td><td>ALHE16</td><td>0.5 세포 M/ml ; 냉동 보존</td></tr>된 <tr><td>생검 유래 인간 십이지장 오가노이드</td><td>John Hopkin's University</td><td>-</td><td>오가노이드는 Mark Donowitz 교수(Institutional Review Board 번호: NA_00038329)가 제공했습니다.</td></tr><tr><td>생검 유래 인간 결장 오가노이드</td><td>John Hopkin's University</td><td>-</td><td>오가노이드는 Mark Donowitz 교수(기관 검토 위원회 번호: NA_00038329)가 제공했습니다.</td></tr><tr><td>조&음; CM-1&트레이드; &nbsp; 문화 모듈</td><td>에뮬레이트&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>문화 모듈</td></tr><tr><td>Orb-HM1&trade; &nbsp; 허브 모듈</td><td>에뮬레이트&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>5% CO2, 진공 스트레치 및 전원 공급</td></tr><tr><td>장치 Chip-S1&trade; 스트레치블 칩</td><td>에뮬레이트&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>오르간 칩</td></tr><tr><td>팟&트레이드; 휴대용 모듈</td><td>에뮬레이트&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>휴대용 모듈</td></tr><tr><td>UV 라이트 박스</td><td>에뮬레이트&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>칩 요람</td><td>에뮬레이트&nbsp;Inc.</td><td>-</td><td>1 per square culture dish</td></tr><tr><td>Steriflip&reg;-HV 필터</td><td>EMD Millipore</td><td>SE1M003M00</td><td>0.45&nbsp; &뮤; 엠&nbsp; PVDF 필터</td></tr><tr><td>스퀘어 셀 배양 접시 (120 x 120 mm)</td><td>VWR</td><td>82051-068</td><td>-</td></tr><tr><td>핸드헬드&nbsp; 진공&nbsp; 흡인기</td><td>Corning</td><td>4930</td><td>&nbsp;-</td></tr><tr><td>흡인&nbsp; 피펫</td><td>Corning / Falcon</td><td>357558</td><td>2 mL,&nbsp; 폴리스티렌, 개별적으로&nbsp; 포장</td></tr><tr><td>흡인 팁</td><td>&nbsp;-</td><td></td><td>멸균(오토클레이브)</td></tr><tr><td>혈청학&nbsp; 피펫</td><td></td><td>&nbsp;-</td><td>2 mL, 5 mL,&nbsp; 10 mL,&nbsp; 과&nbsp; 25 mL&nbsp; 낮은 내독소, 멸균</td></tr><tr><td>피펫</td><td></td><td></td><td>P20, P200,&nbsp; P1000&nbsp; 및 표준 멀티채널</td></tr><tr><td>피펫&nbsp; 팁&nbsp;</td><td></td><td></td><td>P20, P200,&nbsp; 과&nbsp; P1000입니다.</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브&nbsp;( 단백질&nbsp; 로바인드&reg; 튜브)</td><td>Eppendorf</td><td>0030122216; &nbsp; 0030122240</td><td>15 mL, 50 mL 튜브</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; 튜브&reg; &nbsp; lo-bind</td><td>Eppendorf</td><td>022431081</td><td>1.5 mL 튜브</td></tr><tr><td>96 웰 블랙 월 플레이트</td><td>-</td><td>-</td><td>상피 투과성 분석용</td></tr><tr><td>현미경 (카메라 포함)</td><td>-</td><td>-</td><td>명시야용&nbsp; 이미징</td></tr><tr><td>수조(또는 구슬)</td><td>-</td><td>-</td><td>37°C로 설정; C</td></tr><tr><td>진공 설정</td><td>&nbsp;--</td><td></td><td>최소&nbsp; 압력: -70 kPa</td></tr><tr><td>세포 스크레이퍼</td><td>비오튬</td><td>220033</td><td></td></tr><tr><td>T75 플라스크</td><td>BD Falcon</td><td>353136</td><td>세포 배양 플라스크</td></tr><tr><td>에뮬레이트 시약-1&nbsp;( ER-1)</td><td>주식회사 에뮬레이트</td><td>-</td><td>칩 코팅 솔루션</td></tr><tr><td>에뮬레이트 시약-2&nbsp;( ER-2)</td><td>에뮬레이트 Inc.</td><td>●</td> <td>칩 코팅 용액</td></tr><tr><td>Dulbecco 」 s PBS&nbsp; (디펜스)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td>1X</td></tr><tr><td>세포 배양 등급 물</td><td>Corning</td><td>MT25055CV</td><td></td></tr><tr><td>Trypan 블루</td><td>시그마</td><td>93595</td><td>세포 계수용</td></tr><tr><td>TryplE&nbsp; 익스프레스</td><td>써모피셔&nbsp; 과학적</td><td>12604013</td><td>오가노이드&nbsp; 해리&nbsp; 및 내피 세포&nbsp; 분리&nbsp; 솔루션</td></tr><tr><td>고급 DMEM/F12</td><td>ThermoFisher&nbsp; 과학적인</td><td>12634028</td><td>Medium</td></tr><tr><td>IntestiCult&trade; 오가노이드 성장 매체 (인간)</td> <td>줄기 세포 기술</td><td>06010</td><td>오가노이드 성장 매체</td></tr><tr><td>내피 세포 성장 매체 MV 2</td><td>Promocell</td><td>C-22121</td><td>내피 매체</td></tr><tr><td>태아 소 혈청 (FBS)</td> <td>시그마</td><td>F4135</td><td>혈청</td></tr><tr><td>Primocin&trade; &nbsp;</td><td>InvivoGen</td><td>ANT-PM-1</td><td>항균제</td></tr><tr><td>부착 인자&거래;</td>플라스크 Matrigel용 <td>Cell Systems</td><td>4Z0-210</td><td>코팅 솔루션</td></tr><tr><td>- 성장 인자 감소</td><td>코닝</td><td>356231</td><td>용해된 기저막 매트릭스</td></tr><tr><td>콜라겐 IV</td><td>시그마</td><td>C5533</td><td>ECM 구성 요소</td></tr><tr><td>피브로넥틴</td><td>코닝</td><td>356008</td><td>ECM 구성 요소</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>줄기 세포 기술</td><td>72304</td><td>오가노이드 배지 보충제</td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Reprocell</td><td>04-0004-10</td><td>오가노이드 매체 보충제</td></tr><tr><td>세포 회수 용액</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>Basement 메브레인 매트릭스 해리 용액</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9576</td><td>30%, 멸균</td></tr><tr><td>세포 배양 등급 물</td><td>코닝</td><td>MT25055CV</td><td>멸균, 물</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td>솔벤트</td></tr><tr><td>3KDa Dextran Cascade Blue</td><td>Invitrogen</td><td>D7132</td><td>10 mg 분말</td></tr><tr><td>리팜피신 (RIF)</td> <td>Sigma</td><td>Cat# R3501</td><td>CYP 유도제</td></tr><tr><td>테스토스테론 수화물</td><td>Sigma</td><td>T1500</td><td>CYP 기질</td></tr><tr><td>1,25-dihyroxy 비타민 D3 (VD3)</td> <td>Sigma</td><td>Cat# D1530</td><td>CYP 유도제</td></tr><tr><td>아세토니트릴 0.1% (v/v) 포름산</td><td>Sigma</td><td>159002</td><td>LCMS 정지 용액</td></tr><tr><td>IFN&gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>4% 파라포름알데히드 (PFA)</td><td>EMS</td><td>157-4</td><td>고정제</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>일반 당나귀 세럼 (NDS)</td><td>Sigma</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>안티-오클루딘</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>33-1500</td><td>타이트 접합 마커</td></tr><tr><td>안티-Claudin 4</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>36-4800</td><td>tight junctions marker</td></tr><tr><td>anti-E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab1416</td><td>epithelial adherens junctions marker</td></tr><tr><td>anti-VE-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab33168</td><td>endothelial adherent junctions marker</td></tr><tr><td>anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)</td><td>Thermo Fischer</td><td>339194</td><td>tight junctions marker</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher&nbsp; Scientific</td><td>62248</td><td>핵 염색</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>PureLink RNA 미니 키트</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>12183020 RNA 용해, 분리 및 정제 키트</td></tr><tr><td>SuperScript&trade; IV 빌로&트레이드; 마스터 믹스</td><td>Invitrogen</td><td>11756050</td><td>역전사 효소 키트</td></tr><tr><td>TaqMan&trade; Fast Advanced Master</td><td>Mix Applied Biosystems</td><td></td><td>4444557 qPCR 시약</td></tr><tr><td>QuantStudio&trade; 5 Real-Time PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>A28573</td><td>Real-time PCR cycler</td></tr><tr><td>18S 프라이머</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs99999901_s1</td><td>진핵생물 18S rRNA</td></tr><tr><td>CYP3A4 프라이머</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Hs00604506_m1</td><td>Cytochrome&nbsp; 패밀리 3 subfamily A 회원 4</td></tr><tr><td>피어스&트레이드; Coomassie Plus(Bradford) 분석 키트</td>, <td>ThermoFisher Scientific</td><td>23236</td><td>단백질 정량화 키트</td></tr>, <tr><td>MSD Tris 용해 완충액</td>, <td>메조 스케일 진단</td>, <td>R60TX-3</td><td>단백질 용해 완충액</td></tr>, <tr><td>절단/총 카스파제-3 전체 세포 용해물 키트</td>, <td>메조 스케일 진단</td>, <td>K15140D</td><td>Caspase 3 검출 키트</td></tr>, <tr><td>V-PLEX, 혈관 손상 패널 2, 인간 키트</td>, <td>메조 스케일 진단</td><td>K15198D</td><td></td></tr><tr><td>V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)</td><td>메조 스케일 진단</td><td>K15053D</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 880</td><td>Zeiss</td><td>-</td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>Zeiss LD Plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27</td><td></td><td></td> <td>Zeiss-20X 장거리 대물 렌즈</td></tr><tr><td>Zeiss AXIOvert.A1</td><td></td><td></td> <td>Zeiss-Brightfield microscope</td></tr><tr><td>Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1</td><td></td><td></td><td>Zeiss-10X 대물 렌즈</td></tr></tbody></table>

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

Combining Human Organoids and Organ-on-a-Chip Technology to Model Intestinal Region-Specific Functionality

장 점막은 무수한 중요한 기능을 수행하는 복잡한 물리적, 생화학적 장벽입니다. 그것은 영양소와 이종 바이오틱스의 운반, 흡수 및 신진 대사를 가능하게하면서 미생물과의 공생 관계를 촉진하고 미생물의 침입을 제한합니다. 다양한 세포 유형과 물리적 및 생화학적 환경 간의 기능적 상호 작용은 장 조직 항상성을 확립하고 유지하는 데 필수적입니다. 이러한 복잡한 상호 작용과 통합 된 장 생리학을 시험관 내에서 모델링하는 것은 새로운 치료 표적 및 약물 후보가 발견되고 개발되는 방식을 변화시킬 수있는 잠재력을 가진 강력한 목표입니다.
Organoids 및 Organ-on-a-Chip 기술은 최근 시험 관 내에서 장 생리학 및 병리 생리학의 기능적 측면을 연구하는 데 적합한 인간 관련 장 칩을 생성하기 위해 결합되었습니다. 소장 (십이지장) 및 대장의 생검에서 유래 된 오가노이드는 장기 칩의 상부 구획에 시딩 된 다음 각 장 영역의 뚜렷한 세포, 분자 및 기능적 특징을 보존하면서 단층으로 성공적으로 확장됩니다. 인간 장 조직-특이적 미세혈관 내피 세포는 상피-내피 계면을 재생성하기 위해 기관 칩의 하부 구획에 혼입된다. 이 새로운 플랫폼은 영양소, 약물 및 미생물에 대한 발광 노출을 용이하게하여 장 수송, 투과성 및 숙주 - 미생물 상호 작용에 대한 연구를 가능하게합니다.
여기서, 인간 십이지장 (십이지장 칩) 및 결장 (결장 칩)을 나타내는 장 칩의 확립을 위한 상세한 프로토콜이 제공되고, 이들의 후속 배양은 연속 유동 및 연동 유사 변형 하에서 제공된다. 우리는 원형 유도제 및 기질을 사용하여 십이지장 칩에서 약물 대사 및 CYP3A4 유도를 평가하는 방법을 시연합니다. 마지막으로, 우리는 결장 칩에서 인터페론 감마(IFNγ) 매개 장벽 파괴(leaky gut syndrome)의 시험관 내 모델링을 위한 단계별 절차를 제공하며, 칩 내 세포의 부세포 투과성의 변화, 사이토카인 분비의 변화, 및 전사체 프로파일링을 평가하는 방법을 포함한다.

도 1D 는 장 칩 배양의 타임라인을 요약하고, 칩 상에 시딩하기 전과 시의 장 내피 세포 및 오가노이드를 예시한다. 또한, 십이지장과 결장 칩 사이의 뚜렷한 형태 학적 차이를 보여 주며, 십이지장 칩에 융모와 같은 형성의 존재와 작은 장 구조의 대표에 의해 강조됩니다.
도 3A,B는 3개의 상이한 오가노이드 공여체로부터의 십이지장 칩에서의 폴드 CYP3A4 유도 반응을 입증한다. 칩을 48시간 동안 20μM RIF 또는 100nM VD3에 노출시키고, CYP450 효소의 mRNA 수준(A) 및/또는 폴드 촉매 활성(B)을 평가하는데 사용되었다. 테스토스테론 대사산물인 6β-하이드록시테스토스테론(6β-OH-T)의 증가된 수준은 상승된 CYP3A4 mRNA 유전자 발현과 일치하며, RI...

생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술은 미세 생리학 플랫폼으로 결합되어 영역 별 장 기능을 재구성합니다.

The intestinal mucosa is a complex physical and biochemical barrier that fulfills a myriad of important functions. It enables the transport, absorption, ...

이 프로토콜은 생검 유래 장 오가노이드 및 장기 온 칩 기술을 사용하여 생리학적으로 관련된 장 칩을 생성한 다음 약동학 및 약물-약물 상호 작용을 예측하고 장 상피 장벽 기능 장애를 연구하는 데 사용할 수 있는 방법을 보여줍니다. organ-on-a-chip 기술에 유기체를 결합하면 장 상피의 복잡성을 재현 할 수 있습니다. 또한 기계적 단서, 유동 분포 및 생화학적 구배에 대한 더 큰 실험적 제어를 가능하게 합니다.이 방법은 인간 장의 복잡한 생리학을 모방하여 정상 및 병리학 적 장 기능의 세포 및 분자 적 기초에 대한 더 큰 이해를 제공합니다. 이는 약동학 및 약력학을 더 잘 예측하고 염증 손상을 예방할 수 있는 잠재적 약물 후보를 예측하는 데 도움이 됩니다. 시드는 프로토콜에서 중요한 단계입니다.장 오가노이드 단편의 과도한 단편화 또는 부정확한 파종 밀도는 상피 장벽의 발달 및 분화를 손상시킬 수 있습니다. 시작하려면 정적 오가노이드 배양에서 배지를 흡입합니다. 밀리리터당 800만 세포의 최종 파종 밀도를 달성하기 위해 충분한 웰에서 배지를 회수합니다.500 마이크로리터의 얼음처럼 차가운 BMM 해리 용액을 각 웰에 첨가하고 가용화된 BMM을 웰 표면으로부터 부착한다. 현탁액을 15 밀리리터의 저 단백질 결합 튜브에 모아서 얼음 위에 놓습니다. 1 시간 동안 15 분마다 튜브를 부드럽게 흔 듭니다.섭씨 4도에서 5분 동안 G를 300배로 원심분리하여 오가노이드 펠렛을 얻었다. 펠릿 위에 투명한 겔 층이 관찰되면 튜브에서 용액을 흡입하십시오. 펠릿을 다시 현탁시키고 동일한 부피의 BMM 해리 용액을 추가합니다.얼음 위에서 10 분 동안 배양하고 원심 분리합니다. 가용화된 BMM 잔류물이 없을 때까지 반복합니다. 그런 다음 상청액을 버리고 2 밀리리터의 오가노이드 소화 용액에 펠릿을 다시 현탁시킵니다.튜브를 섭씨 37도에서 1-3 분 동안 배양하고 8 밀리리터의 고급 DMEM F12를 추가하여 효소 반응을 중지시킵니다. 펠릿을 원심분리하고 완전한 오가노이드 성장 배지에 재현탁하여 밀리리터당 800만 개의 세포를 달성합니다. 분취량 360 마이크로리터를 멸균 1.5 밀리리터 저단백질 결합 튜브에 담았습니다.다음으로, 코팅된 칩의 상단 채널로부터 배지를 제거하고 30 마이크로리터의 세포 현탁액을 첨가한다. 칩을 섭씨 37도에서 밤새 배양하여 오가노이드 조각을 막에 부착시킵니다. 3 밀리리터의 사전 평형 된 완전한 유기체 성장 배지를 상단 입구 저장소에 추가하고 3 밀리리터의 사전 평형 된 내피 세포 성장 배지를 하단 입구 저장소에 추가합니다.각각의 상단 및 하단 배출구 저장소에 동일한 매체 300 마이크로 리터를 추가하십시오. 휴대용 모듈을 운반하는 트레이를 배양 모듈로 옮깁니다. 배양 모듈에서 칩을 성공적으로 연결하기에 충분한 액적이 형성될 때까지 프라임 사이클을 반복적으로 실행합니다.그런 다음 칩 캐리어를 휴대용 모듈에 밀어 넣습니다. 그런 다음 2시간의 긴 조절 주기를 시작하여 휴대용 모듈과 칩의 배양 배지에 압력을 가한 후 프로그래밍된 조건이 다시 시작됩니다. 다음으로, 스트레치 설정을 변경하고 문화권 모듈을 시작합니다.24 시간 후, 10 % 스트레칭과 동일한 빈도로주기를 반복하십시오. 투여 배지 또는 비히클 대조군을 준비하기 위해, CYP 유도제 스톡 용액 또는 DMSO를 완전한 오가노이드 성장 배지 및 내피 세포 성장 배지로 희석한다. 배양 모듈을 일시 중지하고 트레이를 생물안전 캐비닛으로 가져옵니다.모든 입구 및 출구 저장소의 매체를 인덕터 또는 차량 제어 장치가 있는 2밀리리터의 투여 매체로 교체하십시오. 휴대용 모듈을 배양 모듈로 다시 돌려보내고 시간당 30마이크로리터로 흐름을 다시 시작합니다. 배지를 24시간마다 새로 준비된 유도 용액으로 교체하고 48 내지 72시간 동안 배양을 계속한다.그런 다음 트레이를 생물 안전 캐비닛으로 가져 와서 모든 저장소에서 투여 매체를 흡입하십시오. 세척하고 상단 입구 저장소를 따뜻한 고급 DMEM F12 배지로 교체하고 하단 저장소를 내피 세포 성장 배지로 교체합니다. 세척 매체를 1 밀리리터의 프로브 기판 용액으로 교체하십시오.칩을 시간당 1, 000 마이크로 리터의 높은 유속으로 5 분 동안 관류하고 상단 및 하단 출구 저장소를 모두 흡입하십시오. 칩을 배양 모듈로 되돌리고 시간당 300 마이크로 리터의 일정한 흐름 하에서 1 시간 동안 배양한다. 1 시간의 치료 후, 흐름을 멈추고 트레이를 생물 안전 캐비닛으로 가져옵니다.상단 출구 저장소에서 100 마이크로 리터의 유출 물을 수집하고 200 마이크로 리터의 정지 용액이 들어있는 튜브에 첨가하십시오. 튜브를 즉시 드라이 아이스에 놓고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 200 마이크로 리터의 멸균 DPBS로 두 채널을 모두 세척하십시오.그런 다음 200 마이크로 리터 필터 피펫 팁으로 하단 채널 배출구를 막습니다. 50 마이크로리터의 해리 용액을 바닥 채널을 통해 관류시키고 실온에서 2분 동안 배양한다. 내피 세포의 완전한 분리를 보장하고 피펫팅으로 채널에서 해리 용액을 제거합니다.세척을 반복하십시오. 다음으로, 상단 채널 배출구를 차단하고 75 마이크로 리터의 단백질 용해 완충액을 관류하십시오. 피펫 팁을 삽입한 상태로 두고 실온에서 5분 동안 배양합니다.세포 용해물을 1.5 밀리리터 튜브에 5 내지 10회 피펫팅하여 수집한다. 관류 및 수집을 반복하여 세포의 완전한 분리를 얻고 분석될 때까지 용해물을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. RNA 용해의 경우 150마이크로리터의 RNA 용해 완충액을 사용하면서 동일한 절차를 따르십시오.먼저, 원액을 탈기된 내피세포 성장 배지에 희석하여 인터페론 감마 투여 용액을 제조한다. 생물안전 캐비닛에서 하단 채널 입구 저장소에서 배지를 제거하고 매일 3밀리리터의 투여 용액으로 교체합니다. 그런 다음 트레이를 배양 모듈에 넣고 칩을 시간당 1, 000 마이크로 리터의 높은 유속으로 5 분 동안 관류하십시오.유속을 시간당 60 마이크로 리터로 전환하고 유체 배양을 계속하십시오. 웰당 100마이크로리터의 DPBS를 96웰 검은색 벽 플레이트에 추가합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 모든 저장소에서 각 웰에 50 마이크로 리터의 유출 물을 추가합니다.표준 곡선을 제조하기 위해, DPBS 중 밀리리터당 100 마이크로그램의 3킬로달톤 덱스트란 캐스케이드 블루를 함유하는 배지의 3배 희석을 수행한다. 그런 다음 DPBS에서 내피 세포 성장 배지의 3 배 희석을 사용하여 연속 망상을 수행하십시오. 십이지장 및 결장 칩의 뚜렷한 형태 학적 특징은 소장의 구조를 나타내는 십이지장 칩에 융모와 같은 형성의 존재에 의해 강조되었습니다.시토크롬 P450 유도제 리팜피신 및 비타민 D3에 노출된 십이지장 칩에서 약물 대사 효소 시토크롬 P450 3A4에 대한 mRNA 유전자 발현이 상승하고 시토크롬 P450 효소의 촉매 활성이 향상되어 3가지 오가노이드 공여체 모두에 걸쳐 적절한 유도 반응을 나타냅니다. 결장 칩의 상피 단층을 인터페론 감마로 처리했을 때, 손상된 세포 형태 및 원주 상피의 손실이 관찰되었다. 또한, 인터페론 감마로 처리하면 비히클 대조군에 비해 단단하고 부착 접합 단백질의 세포질 신호가 증가하여 단단한 접합 마커 ZO-1 및 클라우딘 4의 변위와 폐색 및 E-카드헤린의 내재화를 보여줍니다.상피 세포 투과성의 현저한 증가는 결장 칩에 대한 인터페론 감마 자극 48 시간 후에 관찰되었다. 유사하게, 인터페론 감마는 절단된 Caspase 3의 세포내 함량의 증가에 의해 지시되는 세포자멸사의 활성화를 유도한다. 인터페론 감마는 VCAM-1 및 인터루킨-6의 기저측 분비와 ICAM-1 및 혈청 아밀로이드 단백질의 정점 분비에서 볼 수 있듯이 결장 칩에서 전염증성 분자의 분극 분비를 유도했습니다.장 칩의 성공적인 확립에 따라 장 흡수, 수송 및 대사, 영양소 수준 및 장 호르몬 분비, 숙주 미생물 병원체 상호 작용, 약물 안전성 및 효능, 환자 별 질병 메커니즘 및 치료법에 대한 반응을 연구 할 수 있습니다.

combining-human-organoids-organ-on-chip-technology-to-model

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 프로토콜은 인간 만능 세포를 장내 오가노이드로 분화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 세포를 최종 내배엽, 후장 내배엽 및 장 상피의 집단으로 분화하여 정상적인 인간 발달을 모방합니다. 따라서 이 프로토콜은 장 발달과 질병 모델링 응용 분야를 모두 연구하는 데 적합합니다.

발달 및 질병 모델링 응용 분야를 위한 hiPSC 유래 장 오가노이드 생성

여기서는 장 적정별 상호 작용을 모델링할 수 있는 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 오르가노이드 유래 장 단층층 및 공기-액체 인터페이스(ALI) 배양은 발광 및 바생측 모두에서 접근할 수 있는 잘 차별화된 상피생성을 용이하게 하는 반면, 극성 반전장 기관가의 측면은 그들의 정면을 노출시키고 높은 처리량 분석에 적합합니다.

장 관성 오르가노이드 모델을 사용하여 정법별 상호 작용을 연구하는 문화 방법

이 프로토콜은 극성이 역인 작은 장 장내염을 활용하여 정점 표면에 접근 할 수있는 apical-out 괴사 장염 (NEC) 인 - 접시 모델을 설명합니다. 우리는 NEC 관련 상피 파괴를 검출하기위한 면역 형광 염색 프로토콜 및 NEC-in-a-dish 프로토콜을 실시한 apical-out enteroids의 생존력을 결정하는 방법을 제공합니다.

체외 괴사성 장염의 Apical-Out Enteroid 모델

neuroHuMiX는 근접 및 대표 공동 배양 조건에서 박테리아, 상피 및 신경 세포의 상호 작용을 연구하기 위한 고급 gut-on-a-chip 모델입니다. 이 모델을 통해 장내 마이크로바이옴과 신경계 사이의 통신의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝힐 수 있습니다.

장내 마이크로바이옴-신경계 축을 연구하기 위한 gut-on-a-chip 모델

여기서는 쥐의 장 오가노이드를 생성하고 여러 다운스트림 응용 분야에서 사용하는 프로토콜을 제시합니다. 쥐는 종종 선호되는 전임상 모델이며, 강력한 장 오가노이드 시스템은 in vivo 연구에 수반되는 in vitro 시스템의 필요성을 충족시킵니다.

쥐 장 오가노이드의 생성과 조작

이 프로토콜은 질병 발병에 대한 기계론적 연구에 사용할 수 있는 괴사성 장염(NEC)의 시험관 내 모델을 설명합니다. 인간 신생아 장, 내피 세포 및 중증 NEC가 있는 신생아의 장내 마이크로바이옴에서 추출한 장내 장내형 칩을 파종한 것이 특징입니다.

인간 신생아 장 장내염과 디스바이오틱 마이크로바이옴을 통합한 괴사성 장염의 미세유체 모델

개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

당사의 상세 프로토콜은 3D 구조와 다양한 세포 유형으로 인간의 장 점막을 시뮬레이션하는 고급 intestine-on-chip 모델의 생성 및 사용을 간략하게 설명하여 미생물 집락화에 대한 면역 반응 및 세포 기능에 대한 심층 분석을 가능하게 합니다.

장 점막 면역 반응을 분석하기 위한 Immunocompetent Intestine-on-Chip 모델

이 프로토콜은 인간 장 오가노이드 기술과 단일 세포 전사체 분석을 결합하여 이전에 탐구되지 않은 장 생물학에 대한 중요한 통찰력을 제공합니다.

인간 장 오가노이드를 사용하여 단세포 전사 수준에서 소장 상피를 이해합니다.

인간 장 오가노이드는 천연 인간 장의 구조와 기능을 더 잘 재현할 수 있도록 신경을 분포시켜야 합니다. 여기에서는 장 신경계를 이러한 구조체에 통합하는 한 가지 방법을 제시합니다.

인간 장내 오가노이드(Intestinal Organoids)의 신경 분포(Nervation of Human Intestinal Organoids)

학습하세요 장기 온 칩 기술과 생검 유래 장기 오가노이드를 통합하여 생리학적으로 관련된 장 칩을 생성하는 방법을. 이 플랫폼은 약동학 및 약물 상호작용을 예측하고 장 상피 장벽 기능 장애를 연구하는 데 활용됩니다.

인간 오가노이드와 장기 온 칩 기술을 결합하여 장 영역별 기능 모델링

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