Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도^, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개

이 프로토콜은 두 번째 메신저로서의 나트륨의 역할을 강조하고 부분적으로 분화 된 유비 퀴놀 풀의 존재를 보여줍니다. 이 기술은 유비퀴놀 풀의 연구를위한 매우 간단한 접근법을 보여 주며, 그렇지 않으면 매우 구체적인 세포 모델을 필요로합니다. 이러한 접근법은 다른 막, 특히 지질 방울 내의 효소에서의 전자 전달의 연구에 사용될 수 있다.

샘플을 각각 20마이크로그램의 네 개의 하위 샘플로 분할하고 샘플 A와 B를 각각 10마이크로그램의 두 개의 하위 샘플로 분할하고 A1, A2, B1 및 B2로 레이블을 지정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 C1/C2 버퍼를 준비하고 섭씨 37도까지 예열합니다. 1 밀리리터 큐벳에서 각 하위 샘플을 30 마이크로 리터의 시토크롬 c 및 10 마이크로 리터의 말로네이트에 첨가하십시오. C1 / C2 버퍼를 추가하여 큐벳 A1 및 B1의 부피를 980 마이크로 리터로, A2 및 B2에서 979 마이크로 리터로 볼륨을 높입니다. 큐벳 A1 및 A2에 1 몰 염화칼륨 10 마이크로 리터를 넣고 B1 및 B2에 1 몰 염화나트륨 10 마이크로 리터를 넣으십시오. 큐벳 A2와 B2에 한 마이크로리터의 밀리몰 로테논을 넣으십시오. 측정 직전에 10 마이크로 리터의 10 밀리몰 NADH를 모든 큐벳에 넣으십시오.

큐벳을 세 번 뒤집어 분광 광도계에 놓습니다. 첨부 된 소프트웨어에서 측정 후 매개 변수를 클릭 한 다음 일반으로 이동하여 550 나노 미터의 파장과 판독 네 분의 시간에 측정 매개 변수를 설정하십시오. 확인을 클릭하고 실험을 시작을 클릭하십시오.

측정이 끝나면 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭하여 흡광도의 선형 증가를 포함하는 기울기를 저장합니다.분할 샘플 C와 D를 각각 10 마이크로 그램의 두 개의 하위 샘플로 분할하고 C1, C2, D1 및 D2로 레이블을 지정합니다. 각 서브 샘플을 한 밀리리터 큐벳에 30 마이크로리터의 시토크롬 c 및 한 마이크로리터의 로테논과 혼합한다. 섭씨 37도에서 예열된 C1/C2 버퍼를 추가하여 큐벳 C1 및 D1에서 980 마이크로리터, C2 및 D2에서 970 마이크로리터까지 부피를 높입니다. 큐벳 C1 및 C2에 10 마이크로 리터의 1 몰 염화칼륨을 넣고 D1 및 D2에 10 마이크로 리터의 1 몰 염화나트륨을 첨가하십시오. 측정 직전에 1 밀리몰 안티마이신 A 1 마이크로리터를 큐벳 C2 및 D2에 넣고 10 마이크로리터의 1 몰 숙시네이트를 모든 큐벳에 넣으십시오. 큐벳을 세 번 뒤집어 분광 광도계에 놓습니다.

측정을 수행하고 측정의 끝에서 흡광도의 선형 증가를 포함하는 기울기를 저장한다. 이 프로토콜은 NADH 또는 숙시네이트 첨가에 대한 미토콘드리아 막에 의한 시토크롬 c의 감소에 대한 나트륨 이온의 효과를 연구하는데 사용되었다. 샘플 A 및 B에 대해 550 나노미터에서 생성된 흡광도 트레이스를 이들의 상응하는 억제에 대해 보정하였다.

이들 트레이스는 유사한 기울기를 나타내었으며, 이는 유사한 NADH-시토크롬 c 산화환원효소 활성을 나타낸다. 그러나, 샘플 C 및 D에 대한 트레이스는 상이하였고, 샘플 C의 숙시네이트-시토크롬 c 산화환원효소 활성이 이러한 기술로 측정된 변화량을 정상화하기 위해 샘플 D.In 의 그것보다 높다는 것을 보여주며, 단리된 복합체 I 활성, 복합체 II 또는 콤플렉스 III과 같은 다른 방법이 추가로 수행될 수 있다. 이 기술을 사용하여 우리는 나트륨이 두 번째 메신저로 관여 할 수있는 생리 학적 설정을 탐구하고 있습니다.