Name: Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: 배우세요 미토콘드리아 막에서 나트륨 이온이 CoQ 풀 분화에 미치는 영향을 NADH와 석시네이트를 이용한 분광광도법으로 분석하는 방법을. 이 기법은 전자전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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기술 지원을 위해 R. Martínez-de-Mena 박사, M. M. Muñoz-Hernandez, A., C. Jimenez 박사 및 E. R. Martínez-Jimenez 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 MICIN: RTI2018-099357-B-I00 및 HFSP (RGP0016/2018)에 의해 지원되었다. CNIC는 Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) 및 Pro CNIC Foundation의 지원을 받으며 Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505)입니다. 그림 2는 BioRender.com 로 만들었습니다.

모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며 2010년 9월 22일 유럽 연합 지침(2010/63/UE)과 2013년 2월 1일(53/2013)의 스페인 왕실 법령에 따라 스페인 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III(CNIC)의 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 사용 된 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다.
참고: 미토콘드리아 CoQ 풀의 세분화를 연구하기 위한 이 비교 분석은 다음과 같이 기술된다:
1. 단백질 정량화
<ol><li>실험 전에 야생형 마우스 간(즉, 미토콘드리아 막)으로부터 분리된 미토콘드리아(26 )를 세 번 동결 및 해동하여 소기관을 반응 기질에 투과성으로 만든다.</li>
	<li>분리된 미토콘드리아 샘플의 단백질 양을 브래드포드 또는 비친코닌산(BCA) 방법에 의해 정량한다. 브래드포드의 경우, 샘플 2μL를 1x 브래드포드 시약 1mL에 첨가한다.</li>
	<li>샘플을 각각 20 μg의 네 개의 서브샘플로 분할한다(즉: A, B, C, D; 도 2A).</li>
</ol>2. CI+CIII 활성 측정
참고: 프로토콜의 이 부분은 샘플 A와 B를 사용하여 CI+CIII 활동을 측정합니다(그림 2B).
<ol><li>샘플 A 및 B를 각각 10 μg의 2개의 서브샘플(즉, A1, A2, B1 및 B2)로 분할한다. 각 서브샘플을 1mL 큐벳에 30μL의 cyt c (10mg/mL), 100mM 말로네이트 10μL와 혼합하고, 37°C에서 최대 980μL(큐벳 A2 및 B2의 경우 979μL)까지 예열된 C1/C2 완충액(표 1)을 첨가한다. 주의: 이 단계는 독성 시약 말로네이트와 시안화칼륨의 사용을 포함합니다. 참고: cyt c (10 mg/mL)는 10 mMK2HPO4 용액 1 mL에 cyt c 10 mg을 혼합하여 신선하게 준비해야 하며, pH는 7.2로 조정되어야 하며, 실험 내내 얼음 속에 유지되어야 합니다.</li>
	<li>큐벳 A1 및 A2에 10μL의 1M KCl을 첨가하고, 큐벳 B1 및 B2에 10μL의 1M NaCl을 첨가한다.</li>
	<li>1 μL의 1 mM 로테논을 서브샘플 A2 및 B2를 함유하는 큐벳에 첨가한다. 주의: 이 단계는 독성 시약 로테논을 사용하는 것을 포함합니다.</li>
	<li>측정 직전에 10 μL의 NADH (10 mM)를 모든 큐벳에 첨가하십시오. 참고: 10 μL는 큐벳의 단계에서 첨가되는 것이 바람직하므로, 혼합시 반응이 시작된다.</li>
	<li>큐벳을 조심스럽게 세 번 뒤집어 섞는다. 흡광도 큐벳 리더기(UV/VISJASCO 분광광도계)에 보관하십시오.</li>
	<li>일반에서 측정 > 매개 변수 > 클릭하고 파장 : 550nm 및 시간 : 판독 4 분으로 측정 매개 변수를 설정하십시오. 수락 및 시작 단추를 눌러 실험을 시작합니다.</li>
	<li>측정이 끝나면 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭하여 흡광도의 선형 증가를 포함하는 기울 기를 저장합니다. 경사면은 수동으로 수집 할 수도 있습니다.</li>
</ol>3. CII+CIII 활동 측정
참고: 프로토콜의 이 부분은 샘플 C와 D를 사용하여 CII+CIII 활동을 측정합니다(그림 2C).
<ol><li>샘플 C 및 D를 각각 10μg의 두 개의 서브샘플(즉, C1, C2, D1 및 D2)로 분할합니다. 각 서브샘플을 1 mL 큐벳에 30 μL의 cyt c (10 mg/mL), 1 μL의 1 mM 로테논과 혼합하고, 37°C에서 최대 980 μL까지 예열된 C1/C2 완충액을 첨가한다(큐벳 C2 및 D2의 경우 970 μL). 주의: 이 단계는 독성 시약 시안화 칼륨 및 로테논을 사용하는 것을 포함합니다. 참고: cyt c (10 mg/mL)는 10 mMK2HPO4 용액 1 mL에 cyt c 10 mg을 혼합하여 신선하게 준비해야 하며, pH는 7.2로 조정되어야 하며, 실험 내내 얼음 속에 유지되어야 합니다.</li>
	<li>큐벳 C1 및 C2에 10μL의 1M KCl을 첨가하고, 큐벳 D1 및 D2에 1M NaCl 10μL를 첨가한다.</li>
	<li>1 μL의 1 mM 안티마이신 A를 서브샘플 C2 및 D2를 함유하는 큐벳에 첨가한다. 주의: 이 단계는 독성 시약 항마이신 A의 사용을 포함한다.</li>
	<li>측정 직전에 10μL의 숙시네이트(1M)를 모든 큐벳에 첨가하십시오. 참고: 10 μL는 큐벳의 단계에서 첨가되는 것이 바람직하므로, 혼합시 반응이 시작된다.</li>
	<li>큐벳을 조심스럽게 섞어서 세 번 뒤집습니다. 흡광도 큐벳 리더기(UV/VIS 분광광도계)에 넣습니다.</li>
	<li>일반에서 측정 > 매개 변수 > 클릭하고 파장 : 550nm, 시간 : 판독 4 분으로 측정 매개 변수를 설정하십시오. 수락 및 시작 단추를 눌러 실험을 시작합니다.</li>
	<li>측정이 끝나면 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭하여 흡광도의 선형 증가를 포함하는 기울 기를 저장합니다. 경사면은 수동으로 수집 할 수도 있습니다.</li>
</ol>

<ol><li>Calvo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mice%3A+SCAF1+relevance+and+segmentation+of+the+Qpool%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool.</a> Science Advances. 6 (26), (2020).</li>
<li>Garcia-Poyatos, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scaf1+promotes+respiratory+supercomplexes+and+metabolic+efficiency+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish.</a> EMBO Reports. 21 (7), 50287(2020).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
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<li>Jeon, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+substrate+pool+revealed+by+cryo-EM+of+a+lipid-preserved+respiratory+supercomplex%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+and+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex.</a> Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).</li>
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<li>Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+architecture+of+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The architecture of respiratory supercomplexes.</a> Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).</li>
<li>Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+asymmetry+and+electron+flow+in+the+bovine+respirasome%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome.</a> Elife. 5, 21290(2016).</li>
<li>Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+orchestrate+proteostatic+and+metabolic+stress+responses%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses.</a> EMBO Reports. 20 (10), 47865(2019).</li>
<li>Berndtsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+supercomplexes+enhance+electron+transport+by+decreasing+cytochrome+c+diffusion+distance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51015(2020).</li>
<li>Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+respiratory+chain+is+partially+organized+in+a+supercomplex+assembly%3A+kinetic+evidence+using+flux+control+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).</li>
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<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+the+role+of+respiratory+supercomplexes+in+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria.</a> Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).</li>
<li>Letts, J. A., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clarifying+the+supercomplex%3A+the+higher-order+organization+of+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

이 프로토콜은 부분적으로 분할된 CoQ 풀의 존재를 식별하는 매우 간단한 절차이지만, 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 기질 (즉, NADH 또는 숙시네이트)은 바람직하게는 이들 화합물의 자가산화가 발생할 수 있기 때문에 마지막으로 첨가된다. Cuvette의 뒤집기는 독서를 방해 할 수있는 거품의 형성을 피하기 위해주의해야합니다.
또한, 본 기술은 언급할 가치가 있는 몇 가지 제한 사항을 제시한다. 측정은 손상되지 않은 미토콘드리아에서 수행되지 않습니다. 따라서, 완충제의 인위적인 함량 및 비율은 미토콘드리아의 천연 환경과의 차이를 초래할 수 있다. 시약은 과량으로 첨가되며, 이들은 무손상 조직에서 기질의 진정한 이용가능성을 나타내지 않을 수 있다.
현재의 방법은 많은 실험실에서 쉽게 구할 수없는 매우 구체적인 유전 모델 및 장비의 생성 및 사용을 의미합니다1. 이 프로...

미토콘드리아 산화 인산화 시스템 (OXPHOS)은 미토콘드리아에 의한 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 합성, 반응성 산소 종 (ROS) 생산, 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 (NADH) 또는 숙시네이트와 같은 환원 등가물의 소비를 유도하는 주요 경로이다. OXPHOS 시스템은 다섯 가지 단백질 복합체로 구성됩니다 : 복합체 I (CI)는 NADH를 산화시키고 CoQ를 유비퀴놀 (CoQH2)로 환원시킵니다. 콤플렉스 II (CII)는 숙시네이트를 푸마레이트로 산화시키고 CoQ를 CoQH2로 환원시킵니다. 콤플렉스 III (CIII)은 CoQH2를 다시 CoQ로 산화시켜 시토크롬 c (cyt c)를 감소시킵니다. 마지막으로, 복합 IV (CIV)는 cyt c를 산화시키고 산소를 물로 감소시킵니다. 이른바 전자 수송 사슬(mETC)이라고 불리는 이 산화환원 사슬은 IMM을 가로질러 H+의 펌핑에 결합되며, 이는 아데노신 디포스페이트(ADP)를 ATP로 인산화시키기 위해 복합 V(CV)에 의해 사용되는 전기화학적 구배를 생성한다.
mETC 복합체는 IMM에서 단독으로 있거나 수퍼 콤플렉스라는 사차 구조로 조립 될 수 있습니다. CIV는 CIII와 함께 조립하여III2+IV 또는 Q-레스피라솜(CoQH2의 존재하에 호흡할 수 있기 때문에)1,2,3을 형성하거나 동종이량체 또는 호모올리고머(4)를 형성할 수 있다. CIII는 CI와 상호 작용하여 초복합체 I+III25를 형성할 수 있다. 마지막으로, CI는 또한 Q-respirasome과 상호 작용하여 I + III2 + IV 또는 N- 스피라솜 (NADH 소모를 호흡 할 수 있음) 1,6,7,8,9,10을 구축 할 수 있습니다.
CoQ와 cyt c는 각각 CI/CII에서 CIII로, CIII에서 CIV로 전자를 전달하는 역할을 하는 이동 전자 운반체입니다. 초복합체가 이들 담체에 대해 기능적 국부적 제한을 부과하는지 여부는 지난 20년간 2,7,11,12,13,14,15,16,17 동안 격렬한 논쟁의 문제였다. 그러나 몇몇 독립 그룹은 CoQ 및 cyt c가 IMM의 풀로 기능적으로 분할 될 수 있음을 입증했습니다. CoQ와 관련하여, 기능적으로 CI (CoQ NAD)에 대한 특정 CoQ 풀과 FAD 의존성 효소 (CoQFAD)1,7,12,18,19에 전념하는 또 다른 풀로 분할될 수 있다. 그러나, 부분적으로 분절된 기능적 CoQ 풀의 존재를 분화시키기 위해, 대체 옥시다제(AOX)의 과발현 및 CIII의 부재 하에 CI를 조립할 수 있는 특정 mtDNA 돌연변이체의 생성은 1,19,20개가 요구되었다.
저산소증 동안 반응성 산소 종 (ROS) 생산의 메커니즘은 최근까지 알려지지 않았다. 급성 저산소증시, CI는 활성/비활성(A/D) 전이를 겪는데, 이는 H+ 펌핑 NADH-CoQ 산화환원효소 활성의 감소를 수반한다. 이러한 H+ 펌핑의 감소는 미토콘드리아 매트릭스를 산성화시키고 미토콘드리아 매트릭스에 칼슘-포스페이트 침전물을 부분적으로 용해시켜 가용성Ca2+를 방출한다. 가용성Ca2+의 이러한 증가는 Na+/Ca2+ 교환기(NCLX)를 활성화시키며, 이는 Na+와 교환하여Ca2+를 밀어낸다. 미토콘드리아 Na+ 증가는 IMM의 내측에서 인지질과 상호작용하여 CII와 CIII 사이의 유동성 및 CoQ 전달을 감소시키고, 최종적으로 산화환원 신호(21)인 슈퍼옥사이드 음이온을 생성한다. 흥미롭게도, CoQ 전달은 CII와 CIII 사이에서만 감소되었지만 CI와 CIII 사이에는 감소하지 않았으며, 1) Na+는 미토콘드리아의 기존 CoQ 풀 중 하나만 변조 할 수 있었다는 것을 강조했다. 2) IMM에는 기능적으로 차별화된 CoQ 풀이 존재한다. 따라서, 미토콘드리아 효소 활성의 연구를 위해 널리 사용되는 프로토콜이 언급된 CoQ 풀의 존재를 평가하는데 사용될 수 있다.
현재의 프로토콜은 숙시네이트 (즉, CII 기질) 또는 NADH (즉, CI 기질)의 존재 하에서의 흡광도에 의한 CIII의 기질인 산화된 cyt c의 환원의 측정에 기초한다. 동일한 샘플은 두 개로 나뉘며, 그 중 하나는 KCl로 처리되고 다른 하나는 동일한 농도의 NaCl로 처리됩니다. 이런 식으로, Na+가 IMM 유동성을 감소시킨다는 점을 감안할 때, CoQ가 IMM의 고유한 풀에 존재한다면, CI+CIII와 CII+CIII 둘 다 Na+의 존재하에서 감소할 것이다. 그러나 CoQ가 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀에 존재한다면, Na+의 효과는 CII+CIII 활성에 대해 대부분 (또는 만) 명백할 것이지만, CI+CIII에는 미치지 못할 것이다. 최근 발표된21과 같이 Na+는 CII와 CIII 간의 CoQ 전달에만 영향을 미치지만(그림 1C,D), CI와 CIII 간에는 영향을 미치지 않습니다(그림 1A,B).
이 프로토콜은, 기술의 파노플리와 함께, IMM에서 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀의 존재를 확인하는데 사용되어왔으며, 하나는 CI (즉, CoQ NAD)에 전용이고, 다른 하나는FAD 결합 효소 (즉, CoQFAD)에 전념한다 1,3,7; 22 번 논의가 계속되고 있지만 여러 그룹 7,19에 의해 독립적으로 확증되었다는 관찰. 따라서, CI를 초복합체로 수퍼 어셈블리하는 것은 CoQ의 로컬 이동성에 영향을 미치며, 초복합체1,7,13,14,23,24,25 내에서 CIII에 의한 사용을 용이하게 한다.

<table><tbody><tr><td>안티마이신 A</td><td>시그마-알드리치</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>브래드포드 단백질 분석</td> 말 심장의 <td>바이오-라드</td><td>5000001</td><td></td></tr><tr><td>사이토크롬 c</td><td>시그마-알드리치</td><td>C7752</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>말론산</td><td>시그마-알드리치</td><td>M1296</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>시그마-알드리치</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>로슈</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>시안화칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>207810</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>시그마 Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>분광 매니저 소프트웨어</td><td>JASCO</td><td>버전 2</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>UV/VISJASCO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>숙시네이트</td><td>시그마 Aldrich</td><td>398055</td><td></td></tr></tbody></table>

na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도, 부분적으로 분할된 기능적 coq 풀 공개

Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools

내부 미토콘드리아 막 (IMM)의 유비퀴논 (CoQ) 풀은 부분적으로 복합체 I 또는 FAD 의존성 효소로 분할된다. 이러한 세분은 동결-해동된 미토콘드리아에서 전자 공여체로서 NADH 또는 숙시네이트를 사용하는 비교 검정에 의해 용이하게 평가될 수 있으며, 여기서 시토크롬 c(cyt c) 감소가 측정된다. 이 분석은 IMM에 대한 Na+의 효과에 의존하여 유동성을 감소시킵니다. 여기에서, NaCl 또는 KCl의 존재 하에서 NADH-cyt c 산화환원효소 활성 및 숙시네이트-cyt c 산화환원효소 활성을 측정하기 위한 프로토콜을 제시한다. 단계적으로 큐벳 내의 시약의 혼합물에 의존하는 반응은 Na+ 또는 K+의 존재하에 4분 동안 분광광도법으로 측정된다. 동일한 혼합물은 흡광도의 비특이적 변화를 뺄 수 있도록 특정 효소 억제제의 존재 하에 병렬로 수행된다. NADH-cyt c 산화환원효소 활성은 이들 양이온 중 임의의 존재하에서 감소하지 않는다. 그러나, 숙시네이트-cyt c 옥시도리덕타제 활성은 NaCl의 존재하에서 감소한다. 이 간단한 실험은 다음을 강조합니다 : 1) IMM 유동성 및 CoQ 전달을 감소시키는 Na +의 효과; 2) 초복합 I+III2가 유비퀴논(CoQ) 전달이 IMM 유동성을 저하시킴으로써 영향을 받지 않도록 보호한다는 것; 3) CII와 CIII 사이의 CoQ 전송이 CII와 CIII 사이의 CoQ 전달과 기능적으로 다르다는 것. 이러한 사실은 IMM에서 기능적으로 차별화 된 CoQ 풀의 존재를 뒷받침하며 미토콘드리아의 변화하는 Na + 환경에 의해 조절 될 수 있음을 보여줍니다.

이 프로토콜의 일반적인 결과는 아래에 나와 있습니다(그림 3). 감소된 cyt c 흡광도가 550 nm에서 위치함에 따라, 억제되지 않은 모든 서브샘플은 550 nm에서 흡광도의 증가를 보여줘야 한다. 억제된 서브샘플은 이상적으로 평탄한 선 또는 약간 증가하는 기울기를 보여준다(그림 3). 억제된 하위샘플로부터의 기울기는 억제되지 않은 서브샘플로부터 차감되어야 한다.
샘플 A 및 B는 둘 다 그들의 특파원 억제에 의해 보정되고 NADH:cyt c 산화환원효소 활성을 나타내지만, 유사한 기울기를 갖는다(도 3A). 그러나, 하위샘플 C 및 D는, 둘 다 그들의 특파원 억제에 의해 보정되고 숙시네이트:cyt c 산화환원효소 활성을 나타내지만, 서브샘플 C의 활성이 서브샘플 D의 활성보다 높다는 점에서 다르다(<strong c...

이 프로토콜은 Na+의 존재 또는 부재 하에 미토콘드리아 복합 활성 CI+CIII 및 CII+CIII를 사용하여 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀의 존재를 연구하는 비교 분석을 기술한다.

Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개

Ubiquinone (CoQ) pools in the inner mitochondrial membrane (IMM) are partially segmented to either complex I or FAD-dependent enzymes. Such subdivision ...

이 프로토콜은 두 번째 메신저로서의 나트륨의 역할을 강조하고 부분적으로 분화 된 유비 퀴놀 풀의 존재를 보여줍니다. 이 기술은 유비퀴놀 풀의 연구를위한 매우 간단한 접근법을 보여 주며, 그렇지 않으면 매우 구체적인 세포 모델을 필요로합니다. 이러한 접근법은 다른 막, 특히 지질 방울 내의 효소에서의 전자 전달의 연구에 사용될 수 있다.샘플을 각각 20마이크로그램의 네 개의 하위 샘플로 분할하고 샘플 A와 B를 각각 10마이크로그램의 두 개의 하위 샘플로 분할하고 A1, A2, B1 및 B2로 레이블을 지정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 C1/C2 버퍼를 준비하고 섭씨 37도까지 예열합니다. 1 밀리리터 큐벳에서 각 하위 샘플을 30 마이크로 리터의 시토크롬 c 및 10 마이크로 리터의 말로네이트에 첨가하십시오. C1 / C2 버퍼를 추가하여 큐벳 A1 및 B1의 부피를 980 마이크로 리터로, A2 및 B2에서 979 마이크로 리터로 볼륨을 높입니다. 큐벳 A1 및 A2에 1 몰 염화칼륨 10 마이크로 리터를 넣고 B1 및 B2에 1 몰 염화나트륨 10 마이크로 리터를 넣으십시오. 큐벳 A2와 B2에 한 마이크로리터의 밀리몰 로테논을 넣으십시오. 측정 직전에 10 마이크로 리터의 10 밀리몰 NADH를 모든 큐벳에 넣으십시오.큐벳을 세 번 뒤집어 분광 광도계에 놓습니다. 첨부 된 소프트웨어에서 측정 후 매개 변수를 클릭 한 다음 일반으로 이동하여 550 나노 미터의 파장과 판독 네 분의 시간에 측정 매개 변수를 설정하십시오. 확인을 클릭하고 실험을 시작을 클릭하십시오.측정이 끝나면 파일 및 다른 이름으로 저장을 클릭하여 흡광도의 선형 증가를 포함하는 기울기를 저장합니다.분할 샘플 C와 D를 각각 10 마이크로 그램의 두 개의 하위 샘플로 분할하고 C1, C2, D1 및 D2로 레이블을 지정합니다. 각 서브 샘플을 한 밀리리터 큐벳에 30 마이크로리터의 시토크롬 c 및 한 마이크로리터의 로테논과 혼합한다. 섭씨 37도에서 예열된 C1/C2 버퍼를 추가하여 큐벳 C1 및 D1에서 980 마이크로리터, C2 및 D2에서 970 마이크로리터까지 부피를 높입니다. 큐벳 C1 및 C2에 10 마이크로 리터의 1 몰 염화칼륨을 넣고 D1 및 D2에 10 마이크로 리터의 1 몰 염화나트륨을 첨가하십시오. 측정 직전에 1 밀리몰 안티마이신 A 1 마이크로리터를 큐벳 C2 및 D2에 넣고 10 마이크로리터의 1 몰 숙시네이트를 모든 큐벳에 넣으십시오. 큐벳을 세 번 뒤집어 분광 광도계에 놓습니다.측정을 수행하고 측정의 끝에서 흡광도의 선형 증가를 포함하는 기울기를 저장한다. 이 프로토콜은 NADH 또는 숙시네이트 첨가에 대한 미토콘드리아 막에 의한 시토크롬 c의 감소에 대한 나트륨 이온의 효과를 연구하는데 사용되었다. 샘플 A 및 B에 대해 550 나노미터에서 생성된 흡광도 트레이스를 이들의 상응하는 억제에 대해 보정하였다.이들 트레이스는 유사한 기울기를 나타내었으며, 이는 유사한 NADH-시토크롬 c 산화환원효소 활성을 나타낸다. 그러나, 샘플 C 및 D에 대한 트레이스는 상이하였고, 샘플 C의 숙시네이트-시토크롬 c 산화환원효소 활성이 이러한 기술로 측정된 변화량을 정상화하기 위해 샘플 D.In 의 그것보다 높다는 것을 보여주며, 단리된 복합체 I 활성, 복합체 II 또는 콤플렉스 III과 같은 다른 방법이 추가로 수행될 수 있다. 이 기술을 사용하여 우리는 나트륨이 두 번째 메신저로 관여 할 수있는 생리 학적 설정을 탐구하고 있습니다.

inner-mitochondrial-membrane-sensitivity-to-na-reveals-partially

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 mitochondrial 투과 전환 기공 개구의 측정을위한 spectrofluorometric 프로토콜이 여기에 제공됩니다. 검정은 미토콘드리아 칼슘의 동시 측정을...

미토콘드리아 절연 마우스 중심부에 투과율 전환 기공 영업의 다중 매개 변수 측정

이 프로토콜은 기능적 미토콘드리아 전자 수송 사슬 복합체 (Cx) IV와 그 복합체 (supercomplexes)의 분리를 기술하여 네이티브 전기 영동을 사용하여 어셈블리 및 구조에 대한 정보를 나타냅니다. 네이티브 젤은 면역 블로 팅 (immunoblotting), 겔 (in-gel) 분석법, 전기 분해 (electroelution)로 정제하여 개별 복합체를 추가로 특성 분석 할 수 있습니다.

네이티브 전기 영동, In-gel Assay 및 Electroelution으로 미토콘드리아 전자 수송 사슬의 수퍼 콤플렉스 분석

여기, 우리는 고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 캘리포니아2 + 유입의 측정에 대 한 두 개의 프로토콜을 제시. 고립 된 미토 콘 드리 아에 대 한 우리는 플레이트 리더 기반 Ca2 + 가져오기 세부 분석 결과 사용 하 여 Ca2 + 민감한 염색 칼슘 그린-5N. 경작된 한 세포에 대 한 우리 confocal 현미경 검사 법 방법 Ca2 + 염료 오전-2/로드를 사용 하 여 설명 합니다.

고립 된 미토 콘 드리 아 및 경작된 한 세포에 있는 미토 콘 드 리아 칼슘 유입의 분석

여기에서는 세제 및 Coomassie 청색에 대 한 노출을 최소화 하는 미토 콘 드리 아 슈퍼 복합체를 추출, 해결 및 식별 하는 프로토콜을 제시 합니다. 이 프로토콜은 분해능과 효소 활동의 보존 사이에 최적의 균형을 제공 하는 동시에 불안정 한 단백질-단백질 상호작용을 잃을 위험을 최소화 합니다.

미토 콘 드리 아 호흡기 사슬 슈퍼 복합체의 분리 및 분석을 위한 하이브리드 클리어/블루 천연 전기 영동

최근 진행에도 불구하고 많은 효모 미토콘드리아 단백질은 여전히 완전히 알려지지 않은 기능으로 남아 있습니다. 이 프로토콜은 분자 기능의 해명에 대한 기본이었던 단백질의 제출국국화를 결정하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.

신진 효모 사카로미세스 세레비시아에 제출 단백질 지역화 평가

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배우세요 미토콘드리아 막에서 나트륨 이온이 CoQ 풀 분화에 미치는 영향을 NADH와 석시네이트를 이용한 분광광도법으로 분석하는 방법을. 이 기법은 전자전달 메커니즘 연구에 활용됩니다.

Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도^, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개

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