Name: 진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:40:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: 배우세요 진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 생체내 광역 형광 현미경법으로 폐 미세순환의 백혈구-내피세포 상호작용과 모세관 관류를 실시간 관찰하는 방법. 이 기술은 최소한의 물리적 외상으로 고해상도 영상을 제공합니다.

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저자는이 원고의 편집 및 수정에 상당한 전문 지식을 제공 한 Pina Colarusso 박사에게 감사하고 싶습니다.

여기에 설명 된 모든 절차는 Dalhousie University Committee on Laboratory Animals (UCLA)의 사전 승인을 받아 수행되었습니다.
1. 준비
<ol><li>폐 이미징 시스템 : 창을 준비하려면 진공 채널의 오염을 피하면서 외부 링의 상단에 얇은 진공 그리스를 투여하십시오. 깨끗한 8mm 유리 커버슬립을 창문에 놓고 부드럽게 눌러 씰을 만듭니다.</li>
	<li>광역 형광 현미경: 20x/0.40 장거리 대물렌즈와 프레임 속도가 25FPS인 흑백 전하 결합 장치(CCD) 카메라가 장착된 기존의 광역 형광 현미경으로 이미징을 수행합니다. 530-550nm 대역통과 여기 필터를 적용하여 로다민-6G를 여기시키고 460-490nm 대역통과 필터를 적용하여 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)를 여기시킵니다.</li>
	<li>진공 시스템: 보충 그림 1과 같이 50-60mmHg 일정한 흡입을 제공할 수 있는 디지털 압력 게이지가 장착된 진공 펌프에 이미징 창을 연결합니다. 간단히 말해서, 이미징 윈도우를 1.0 mm I.D. 폴리에틸렌 튜빙, 1.0 cm I.D. 폴리에틸렌 튜빙, 진공 플라스크 및 인라인 0.2 μm 필터를 통해 펌프에 연결한다.</li>
	<li>인공 호흡기 : 작은 설치류 인공 호흡기를 설정하여 마우스의 체중을 기준으로 계산 된 속도와 부피로 압력 조절 환기를 제공하십시오. 실험 기간 동안 5cmH2O에서 양의 말단 내쉼 압력(PEEP)을 제공하고, 목표 압력을 20cmH2O로 설정한다.</li>
	<li>마취제: 저유량 마취 전달 시스템을 사용하여 99.9% 이소플루란으로 5.0mL 주사기를 프라임화합니다. 폐가스 청소 시스템을 사용하여 외과 의사의 흡입 위험을 최소화하십시오.</li>
</ol>2. 마취
<ol><li>20-25 g의 12주령 수컷 C57Bl/6 마우스를 마취 유도 챔버에 넣는다. 챔버를 단단히 닫은 상태에서 3 %의 농도와 500 mL / min의 유속으로 이소플루란 가스로 유도를 시작하십시오.</li>
	<li>마우스가 마취되면 (느린 호흡 속도로 시각화), 삽관 스탠드로 옮기고 상부 절치를 교수형 봉합사에 고정시킵니다.</li>
	<li>봉합사를 조여서 코 콘 안쪽에 주둥이를 고정시킵니다. 2.5 %의 농도로 코 콘을 통한 가스 흐름을 시작합니다.</li>
	<li>다음 단계로 이동하기 전에 발가락 꼬집음을 통해 적절한 마취 깊이를 확인하십시오.</li>
</ol>3. 삽관
<ol><li>마우스의 스탠드 뒷면과 등쪽이 외과 의사를 향하도록 스탠드를 회전시킵니다.</li>
	<li>20cm 길이의 광섬유 케이블의 끝을 20G 기관내 캐뉼라를 통해 통과시키고 팁을 Lidocaine HCl (1 %)에 담그면 후두를 통한 케이블 통과가 용이합니다.</li>
	<li>무딘 포셉을 사용하여 아래턱을 들어 올리고 혀를 대체하여 호흡기로 명확한 통로를 제공합니다.</li>
	<li>상부 절치가 검경의 틈새 내에 맞도록 수정 된 이토스코프 (~ 60 ° 사경 둘레 제거)를 삽입하십시오. epiglottis와 성대가 명확하게 보일 때까지 범위와 혀 위치를 조정하십시오.</li>
	<li>기관내 캐뉼라가 장착된 광섬유 케이블을 검경의 틈새를 통해 후두에 삽입합니다. 작은 원형 움직임을 사용하여 케이블을 성대를 통과시켜 기관으로 전달하십시오.</li>
	<li>광섬유 케이블을 따라 캐뉼라를 밀어 성대 사이와 기관으로 통과시킵니다.</li>
</ol>4. 환기
<ol><li>삽관 스탠드에서 마우스를 회수하여 오른쪽 측면 욕창 위치의 가열 패드에 놓습니다.</li>
	<li>캐뉼라를 인공 호흡기 튜브에 연결하고 인공 호흡기를 시작하십시오. 마취 농도를 1.5 %로 줄이고 페달 반사를 테스트하여 깊이를 모니터링하십시오. 반사가 지속되면 농도를 점진적으로 2 %까지 높입니다.</li>
	<li>건조를 방지하기 위해 마우스의 눈에 눈물 젤을 놓습니다.</li>
	<li>의료용 테이프를 사용하여 캐뉼라를 주둥이에 고정하십시오. 라벨링 테이프를 사용하여 오른쪽 앞발을 대략 9시 위치에 가열 패드에 고정하십시오. 왼쪽 뒷발을 구불구불 뻗어 대략 6시 위치에 고정하십시오.</li>
	<li>천 테이프를 사용하여 왼쪽 앞발을 12시 위치로 가볍게 스트레칭하고 그림 2A와 같이 테이프의 다른 쪽 끝을 IVM 플랫폼의 상단에 고정합니다 (여기에 약간의 장력을 유지하면 후속 흉부 절제술이 용이 해집니다).</li>
	<li>직장 온도 프로브를 삽입하고 가열 패드에 테이핑하여 프로브를 고정하십시오. 오른쪽 뒷발에 맥박 산소 포화도 측정기를 놓고 가열 패드에 고정하여 순환을 방해하지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>일단 온도가 37.0°C ± 0.1°C에서 안정되면, 흉부 절제술을 진행한다.</li>
</ol>5. 흉부 절제술
<ol><li>70 % 알코올 닦음으로 흉부와 복부를 살균하십시오. 미네랄 오일의 가벼운 코트를 발라서 흉골에서 척추 기둥으로, 어깨에서 흉곽 바닥까지 마우스의 왼쪽에있는 머리카락을 적셔줍니다.</li>
	<li>무딘 포셉과 직선 가위로 흉곽 바닥 근처에 작은 세로 절개를 만들어 기본 근육층을 노출시킵니다.</li>
	<li>심실로 이동하면 무딘 해부를 사용하여 상피 및 지방 조직을 근육층에서 분리하십시오. 노출 된 혈관을 소작하십시오. 혈액 손실의 위험이 완화되면 xiphoid 과정까지 원래의 절개를 심실로 연장하십시오.</li>
	<li>척추 기둥에 ~ 5mm 측면이 될 때까지이 과정을 기숙사로 반복하십시오.</li>
	<li>두개골로 움직이면 무딘 해부를 사용하여 흉곽을 노출시킵니다. 혈역학적 안정성을 보존하기 위해 노출된 혈관을 소작하십시오.</li>
	<li>혈액 손실의 위험이 완화되면 xiphoid 과정에서 겨드랑이로 절개를 확장하십시오.</li>
	<li>왼쪽 귀보다 ~ 1cm 정도 열등해질 때까지 절개의 등쪽에서이 과정을 반복하십시오.</li>
	<li>지혈 포셉을 사용하여 해부된 상피 및 지방 조직을 잡고 수술 부위를 깨끗하게 만듭니다(그림 2B).</li>
	<li>백혈구의 시각화를 위해 Rhodamine-6G (0.5 mg / mL; 1.5 mL / kg) 용액을 주입하고 꼬리 정맥을 통한 모세관 관류의 시각화를 위해 소 FITC 알부민 (50 mg / mL, 1 mL / kg)을 주입하십시오.</li>
	<li>이빨이 달린 포셉을 사용하여 갈비뼈를 끝에서 폐 기저부의 위치보다 즉시 열등하게 잡고 약간 후퇴하여 갈비뼈를 폐에서 떼어냅니다. 기흉을 유도하기 위해 갈비뼈를 자르십시오.</li>
	<li>늑간 근육을 따라 양쪽으로 절개를 옆으로 연장하여 노출 된 폐 표면에 닿지 않도록주의하십시오.</li>
	<li>무딘 포셉을 사용하여 다음으로 높은 갈비뼈를 잡고 약간 후퇴하여 폐가 가슴 벽에서 떨어지도록하십시오. 폐가 분리되지 않으면 흉벽을 폐에 가볍게 눌러 폐가 하부 흉막에 달라 붙게하여 더 쉽게 떨어집니다.</li>
	<li>흉골이 나타날 때까지 심실로 원래의 절개를 계속하고 폐의 정점이 노출 될 때까지 두개골로 계속하십시오. 면화 도포기와 거즈를 사용하여 발생하는 출혈을 감쇠시킵니다.</li>
	<li>흉곽을 들어 올려 흉강의 등쪽 측면에 늑간 혈관을 노출시킵니다. 폐를 손상시키지 않도록주의하고, 척추 기둥 근처에서 가장 열등한 늑간 혈관을 소작 한 다음 갈비뼈를 자릅니다. 두개골 및 심실로 이동하면서 흉곽의 약 1cm x 1.5cm 부분이 절제될 때까지 반복한다(그림 2C).</li>
	<li>거즈의 작은 스트립을 사용하여 모세관 작용을 통해 흉강에 축적 된 과도한 체액을 제거하십시오.</li>
	<li>현미경 검사를 진행하는 동안 흉막 내 유체가 폐와 이미징 창 사이에보다 안전한 인터페이스를 위해 소산되도록 ~ 5 분 정도 허용하십시오.</li>
</ol>6. 현미경 검사
<ol><li>진공 펌프를 켜고 압력을 ~ 50-60 mmHg로 조정하십시오.</li>
	<li>IVM 플랫폼을 현미경 단계로 전송하십시오. 이미징 창이 노출된 폐 바로 위에 있고 창 암이 대략 3시 위치에서 폐에 접근하도록 금속 포스트와 미세 조작기를 배치합니다.</li>
	<li>미세 조작기를 사용하여 이미징 창이 폐 표면에 부착되고 안정화될 때까지 조심스럽게 낮춥니다(그림 3A).</li>
	<li>20x 대물 및 460-490 nm 대역 통과 여기 필터를 사용하여 혈류의 수렴 패턴을 기반으로 폐 정맥을 식별합니다. 시야에 선박을 집중시키고 30 초의 비디오를 녹화하십시오.<ol>
<li>530-550nm 대역 통과 여기 필터로 전환하고 동일한 시야각에서 30초의 비디오를 녹화합니다.</li>
		<li>다섯 개의 폐 정맥이 이미징 될 때까지 이전 단계를 반복하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>460-490 nm 대역 통과 여기 필터를 사용하여 혈류의 발산 패턴을 기반으로 폐 세동맥을 확인합니다. 시야에 선박을 집중시키고 30 초의 비디오를 녹화하십시오.<ol>
<li>530-550nm 대역 통과 여기 필터로 전환하고 동일한 시야각에서 30초의 비디오를 녹화합니다.</li>
		<li>다섯 개의 폐 세동맥이 이미징 될 때까지 이전 단계를 반복하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>460-490nm 대역 통과 여기 필터를 사용하여 더 큰 혈관에 의해 교차되지 않는 폐포 및 모세 혈관의 영역을 찾고 30 초의 비디오를 녹화하십시오.<ol>
<li>530-550nm 대역 통과 여기 필터로 전환하고 동일한 시야각에서 30초의 비디오를 녹화합니다.</li>
		<li>다섯 개의 모세관 영역이 이미징될 때까지 이전 단계를 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 안락사 및 청소 프로토콜
<ol><li>현미경 단계로부터 IVM 플랫폼을 제거하고, 이소플루란 전달을 5분 동안 5%로 조정하여 마우스를 안락사시켰다.</li>
	<li>기다리는 동안 커버 글래스를 버리고 플랫폼에서 이미징 창을 분리하십시오. 작은 브러시로 이미징 창을 청소하고 채널에 삽입 된 30G 주사기를 사용하여 증류수로 여러 번 플러시하십시오. 그런 다음, 진공 펌프를 사용하여 95% 에탄올로 플러싱한다.</li>
	<li>5 분이 경과 한 후 인공 호흡기를 멈추고 자궁 경부 탈구를 통해 완전한 안락사를 보장하십시오.</li>
</ol>

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Kamala D. Patel 박사는 Luxidea의 사장이자 공동 설립자이며,이 실험에서 활용 된 이미징 창을 구입 한 기업입니다.

여기에 제시된 프로토콜은 몇 가지 중요한 단계에 대한 연습과주의가 필요합니다. 첫째, 삽관 및 수술을 시작하기 전에 이미징 창을 준비하는 것이 중요합니다. 최소한의 진공 그리스를 사용하여 이미징 창의 외부 링을 코팅하고, 커버 글라스를 적용하고, 증류수 한 방울로 흡입을 테스트합니다. 이것을 미리 준비하면 그렇지 않으면 설치 중에 노출 된 폐가 건조되는 것을 방지 할 수 있습니다. 따뜻한 식염수로 씻어 낼 수는 있지만 그렇게하면 깨지기 쉬운 폐 조직이 손상 될 위험이 있습니다.
삽관 후, 마우스를 IVM 플랫폼으로 옮기는 동안, 캐뉼러는 때때로 변위될 수 있다. 이를 방지하려면 캐뉼라를 마우스의 앞니에 묶거나 입 주위의 피부에 봉합하는 것을 고려하십시오. 압력 조절 환기를 사용하는 경우 절차 전반에 걸쳐 조력량을주의 깊게 모니터링해야합니다. 약 0.20 mL에서 일정하게 유지되어야하며, 상당히 낮은 값 (예 : ~ 0.10 mL)은 단일 폐 환기를 나타낼 수 있습니다. 이 경우 ...

생체 내 현미경 (IVM)은 생체 내에서 다양한 생물 물리학 적 과정을 시각화하고 연구하는 데 유용한 이미징 도구입니다. 폐는 밀폐 된 위치, 조직의 깨지기 쉬운 특성 및 호흡 및 심장 박동에 의해 유도 된 모션 아티팩트 1,2로 인해 생체 내에서 이미지화하기가 매우 어렵습니다. 이러한 도전을 극복하기 위해 폐 미세순환에서 백혈구-내피 상호작용의 실시간 이미징을 위해 다양한 생체내 현미경(IVM) 설정이 개발되었습니다. 이러한 접근법은 영상화를 위해 폐를 외과 적으로 노출시키고 안정화시키는 것을 기반으로합니다.
동물은 전형적으로 외과적 절차에 의해 폐 IVM을 위해 제조된다. 첫째, 동물들은 삽관되고 환기되어 흉부 창문을 외과 적으로 절제하고 이미징을 위해 폐를 안정시키기위한 후속 개입을 허용합니다. 한 가지 기술은 실질종을 유리 커버 슬립3에 붙이는 것인데, 이는 이미지 된 조직에 심각한 신체적 외상을 줄 위험이 있습니다. 보다 진보된 것은 유리 창 하에서 폐를 안정화시키기 위한 진공 시스템의 활용이다(4). 이 설정은 넓은 국소 영역에 걸쳐 확산되는 가역적 진공을 통해 커버슬립에 대한 폐 표면의 느슨한 부착을 용이하게 하고, x, y 및 z 치수4에서의 이동을 제한하면서 폐를 확장시킨다. 진공은 셋업의 이미징 영역을 둘러싸는 채널을 통해 고르게 적용되고, 이미징 등급 커버슬립(4)을 향하는 얕은 원뿔형 영역으로 조직을 당긴다. 이 시청 창을 통해, 폐 미세 순환은 다양한 광학 이미징 양식을 사용하여 연구 될 수 있습니다.
폐 IVM은 다수의 미세순환 파라미터의 정량적 이미징을 가능하게 한다. 여기에는 백혈구 추적 속도 및 길이5, 적혈구 유속6 및 산소화7, 종양 전이8, 면역 세포 하위집단의 구별 9,10,11, 미세입자의 시각화 12, 폐포 역학13,14, 혈관 투과성15, 및 모세관 기능 16과 같은 측정이 포함됩니다. . 여기서 초점은 백혈구 모집 및 모세관 기능에 있습니다. 폐 미세순환에서 백혈구 모집의 개시는 백혈구와 내피 세포 사이의 일시적인 롤링 상호작용 및 확고한 접착 상호작용을 포함하며, 둘 다 염증 조건 하에서 증가된다16,17. 전형적으로, 압연은 오퍼레이터-정의된 기준선을 통과하는 백혈구의 수에 의해 정량화되는 반면, 부착은 내피(16) 상에서 움직이지 않는 백혈구의 수에 의해 정량화된다. 모세관 기능은 또한 염증 상태에서 영향을 받을 수 있으며, 종종 관류 감소를 초래합니다. 이는 적혈구 변형성(18)의 감소 및 병리학적 션트(19)를 초래하는 내피 세포에 의한 유도성 NO 신타제의 잡색발현을 포함하는 몇몇 인자에 기인할 수 있다. 전형적으로, 면적당 관류된 모세혈관의 응집체 길이는 측정되고 기능적 모세관 밀도(FCD)로서 보고된다.
폐에서 백혈구 모집을 실시간으로 연구하려면 형광 염료 또는 형광 표지 항체20으로 생물학적 표적을 표지해야합니다. 대안적으로, 리소자임 M-녹색 형광 단백질(LysM-GFP) 마우스와 같은 다양한 트랜스제닉 마우스 균주는 호중구21,22와 같은 특이적 면역 세포 서브세트를 이미지화하는데 이용될 수 있다. 형광 표지된 백혈구는 광역 형광 현미경, 공초점 현미경 또는 다중 광자 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다. 이러한 기술은 특정 여기 파장을 활용하고 방출된 형광을 검출하는 동시에 여기 파장의 검출을 차단함으로써 대조를 달성함으로써 라벨링된 물체를 강조한다.
뮤린 폐에서 백혈구 롤링, 접착 및 기능적 모세관 밀도의 정량화에 관한 기존 연구는 주로 수동 비디오 분석에 의존해 왔습니다. 이것은 피지(6,23)와 같은 오픈 소스 소프트웨어, CapImage12와 같은 독점 소프트웨어 또는 맞춤형 이미지 처리 시스템(24)을 통해 가능하게 된다. 반대로, 다양한 독점 소프트웨어 플랫폼(예를 들어, NIS Element, Imaris, Volocity, MetaMorph)은 이전에 언급한 5,6,7,8,9,10,11,12,13,15를 포함하는 다양한 다른 생리학적 파라미터들의 자동화된 측정을 가능하게 한다.
폐 IVM을 이용한 급성 폐 손상 (ALI) 및 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS)의 병리학에 관한 중요한 관찰이 이루어졌습니다. ARDS는 내피 및 상피 장벽(25)의 기능장애로 인한 폐부종 및 폐포 손상을 포함하는 폐의 병리생리학적 과정의 숙주를 특징으로 한다. 뮤린 모델을 사용하여, 패혈증-유도된 ALI가 폐 환경에서의 면역 세포 밀매의 유의한 해로운 변화와 연관된다는 것이 밝혀졌다(26). 패혈증 유발 ALI를 가진 마우스의 모세혈관으로 모집된 호중구는 미세순환을 방해하는 것으로 밝혀졌으며, 이로써 ALI26에서 저산소증이 증가하였다. 또한, IVM은 ARDS27의 발병 후 수리의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 사용되었습니다. 폐 IVM은 또한 다양한 폐쇄성 폐 질환의 병리생리학적 변화를 이해하는 데 유용한 도구이다. 예를 들어, 낭포성 섬유증 (CF) 및 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD)과 같은 질병에서 점액 수송의 시각화는 점액 클리어런스28에 대한 신규 및 기존 치료법의 연구를 촉진시켰다. 이러한 조건하에서의 백혈구 밀매는또한 17 뿐만 아니라 분석되었다.
이 프로토콜은 Lamm et al.29 에 의해 초기에 기술된 접근법을 확장하여 기존의 형광 현미경을 사용하여 백혈구-내피 상호작용을 연구한다. 설명된 절차는 16.5 cm x 12.7 cm 금속 베이스, 미세 조작기 및 진공 이미징 윈도우를 포함하는 생체내 폐 영상 시스템을 채용한다(도 1). 이 시스템은 20cm x 23.5cm 3D 인쇄 플랫폼(보충 파일 1)에 장착되어 인공 호흡기 튜브 및 난방 패드에 안전하게 부착할 수 있습니다. 이 방법은 생체 내에서 뮤린 폐 미세 순환의 재현 가능하고 정량화 가능한 이미징을 제공합니다. 수술 준비의 중요한 측면뿐만 아니라 진공 안정화 폐 영상 시스템의 적절한 활용이 자세히 설명된다. 마지막으로, ALI의 실험 모델은 염증과 관련된 변경된 백혈구 롤링, 백혈구 부착 및 모세관 관류의 대표적인 이미징 및 분석을 제공하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜의 사용은 급성 질환 상태 동안 폐 미세 순환의 병리 생리학적 변화에 대한 더 중요한 조사를 촉진해야한다.

<table><tbody><tr><td>1 mL BD Luer Slip Tip 주사기 멸균, 일회용</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>309659</td><td>1 mL 주사기</td></tr><tr><td>ADSON 드레싱 집게, 팁 너비 0.6 mm, 톱니 길이 11.5 mm, 12 cm</td><td>RWD Life Science Co.</td><td>F12002-12</td><td>무딘 집게</td></tr><tr><td>알부민 - 플루오레세인 이소 티오 시아네이</td>트 <td>시그마 - 알드리치</td><td>A9771-1G</td><td>FITC- 알부민</td></tr><tr><td>알코올 면봉 이소 프로필 알코올 70 % V / V</td><td>캐나다 사용자 정의 포장 회사</td><td>80002455</td><td>알코올 닦음</td></tr><tr><td>AVDC110 고급 디지털 비디오 컨버터</td><td>Canopus</td><td>00631069602029</td><td>디지털 비디오 컨버터</td></tr><tr><td>B / W - CCD - 카메라</td><td>혼 이미징</td><td>BC-71</td><td>카메라</td></tr><tr><td>Bovie Deluxe 고온 소작 키트</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>18010-00</td><td>소작기</td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Charles River Laboratories International</td><td>C57BL/6NCrl</td><td>C57BL/6 마우스</td></tr><tr><td>코튼 팁 애플리케이터</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td>Cotton 애플리케이터</td></tr><tr><td>CS-8R 8mm 라운드 유리 커버슬립</td><td>워너 인스트루먼트</td><td>64-0701</td><td>유리 커버슬립</td></tr><tr><td>디지털 압력계</td><td>ITM Instruments Inc.</td><td>DG2551L0NAM02L0IM& V</td><td>디지털 압력 게이지</td></tr><tr><td>Dr Mom Slimline 스테인리스 LED 검이경</td><td>Dr. Mom 검이경</td><td>1001</td><td>검이경</td></tr><tr><td>에틸 알콜 95% Vol</td><td>상업용 알코올</td><td>P016EA95</td><td>95% 에탄올</td></tr><tr><td>미세 가위 - 마르텐사이트 스테인리스 스틸</td><td>미세 과학 도구</td><td>14094-11</td><td>가위</td></tr><tr><td>Fisherbrand 컬러 라벨링 테이프</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>1590110</td><td>라벨링 테이프</td></tr><tr><td>Gast DOA-P704-AA 대용량 진공 펌프</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>ZA-07061-40</td><td>진공 펌프</td></tr><tr><td>Hartman Hemostats</td><td>Fine Science Tools</td><td>13003-10</td><td>지혈 집게</td></tr><tr><td>고진공 그리스</td><td>Dow Corning</td><td>DC976VF</td><td>진공 그리스</td></tr><tr><td>Isoflurane USP</td><td>Fresenius Kabi</td><td>CP0406V2</td><td>Isoflurane</td></tr><tr><td>LIDOcaine HCl 주입 1% 50mg/5mL</td><td>Teligent Canada</td><td>0121AD01</td><td>리도카인 HCl 1%</td></tr> <tr><td>폐 수술Board</td><td>Luxidea, Inc.</td><td>IMCH-0001</td><td>폐의 생체 내 현미경 검사용으로 설계</td></tr><tr><td>미네랄 오일</td><td>Teva Canada</td><td>00485802</td><td>미네랄 오일</td></tr><tr><td>마우스 기관내 삽관 키트</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>ETI-MSE</td><td>삽관 스탠드, 마취 마스크, 20G 기관내 캐뉼라, 광섬유 케이블</td></tr><tr><td>MST49 형광 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 450 022</td><td>형광 현미경</td></tr><tr><td>N Plan L 20x/0.40 긴 작동 거리 현미경 대물</td>렌즈 <td>Leica Microsystems</td><td>566035</td><td>20x 대물렌즈</td></tr><tr><td>부직포 스폰지 2" x 2"</td> <td>AMD-Ritmed</td><td>A2101-CH</td><td>거</td></tr><tr><td>즈 Optixcare 눈 윤활제 플러스</td><td>Aventix</td><td>5914322</td><td>눈물 젤</td></tr><tr><td>Original Prusa i3 MK3S+ 3D 프린터</td><td>Prusa Research</td><td>PRI-MK3S-KIT-ORG-PEI</td><td>3D 프린터</td></tr><tr><td>산소, 압축 린</td><td>데 캐나다 Inc.</td><td></td><td>산소</td></tr><tr><td>PrecisionGlide 바늘 30 G x 1/2 (0.3 mm x 13 mm)</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>30 G 바늘</td></tr><tr><td>Pyrex 5340-2L 5340 필터링 플라스크, 2000 mL</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>5340-2L</td><td>진공 플라스크</td></tr><tr><td>Rhodamine 6 G</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252433</td><td>Rhodamine 6G</td></tr><tr><td>Secure Soft Cloth Medical Tape - 3"</td><td>Primed</td><td>PM5-630709</td><td>천 테이프</td></tr><tr><td>실라스틱 의료용 튜빙 .040 in. ID x .085 인치 OD</td><td>Dow Corning</td><td>602-205</td><td>1.0mm I.D. 폴리에틸렌 튜빙</td></tr><tr><td>Somnosuite 저유량 마취 시스템</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>SS-01, SS-04-모듈</td><td>소형 설치류 인공호흡기, 저유량 마취 시스템, 가열 패드, 직장 온도 프로브, 맥박 산소 측정기</td></tr><tr><td>조직 집게, 길이 12.5cm, 곡선, 1 x 2 치아</td><td>세계 정밀 기기</td><td>501216</td><td>톱니 집게</td></tr><tr><td>Transpore 의료용 테이프, 1527-1, 1인치 x 10야드(2.5cm x 9.1m)</td><td>3M</td><td>7000002795</td><td>의료용 테이프</td></tr><tr><td>튜브, 투명, 3/8인치 내부 직경</td><td>Grainger Canada</td><td>USSZUSA-HT3314</td><td>1.0 cm I.D. 폴리에틸렌 튜빙</td></tr><tr><td>Whatman 6720-5002 50 mm 인라인 필터, PTFE, 0.2 &마이크로; m</td><td>Cole-Parmer Canada Company</td><td>6720-5002</td><td>인라인 0.2&마이크로; M 필터</td></tr></tbody></table>

진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사

Intravital Widefield Fluorescence Microscopy of Pulmonary Microcirculation in Experimental Acute Lung Injury Using a Vacuum-Stabilized Imaging System

백혈구 - 내피 상호 작용의 생체 내 영상은 살아있는 동물의 면역 매개 질환에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 생체 내에서 급성 폐 손상 (ALI) / 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS) 및 기타 호흡 병리에 대한 연구는 제한된 접근성과 폐의 고유 한 운동 아티팩트로 인해 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 이러한 도전을 극복하기 위해 다양한 접근법이 개발되었습니다. 이 프로토콜은 ALI의 실험 모델에서 폐 미세순환에서의 실시간 백혈구-내피 상호작용을 연구하기 위해 생체내 형광 현미경 검사에 대한 방법을 기술한다. 생체 내 폐 영상 시스템과 3-D 프린팅된 생체내 현미경 플랫폼은 마취된 마우스를 고정하고 폐를 안정화시키면서 혼란스러운 폐 손상을 최소화하는 데 사용됩니다. 준비 후, 광역 형광 현미경 검사는 백혈구 부착, 백혈구 롤링 및 모세관 기능을 연구하는 데 사용됩니다. 여기에 제시된 프로토콜은 염증성 폐 질환의 급성 모델에서의 이미징에 초점을 맞추지 만, 폐의 다른 병리학 적 및 생리적 과정을 연구하기 위해 적용될 수도 있습니다.

이 프로토콜을 통해 달성가능한 결과를 예시하기 위해, 급성 폐 손상 (ALI)은 비강 내 박테리아 리포폴리사카라이드 (LPS) 점적의 모델을 사용하여 이미징하기 전에 6 h 동안 유도되었다. 간단히 말해서, 마우스 (n = 3)는 이소플루란으로 마취되었고, 멸균 식염수 (10 mg / mL)의 슈도모나스 aeruginosa 의 LPS의 작은 물방울을 5 mg / kg의 용량으로 왼쪽 나리스에 피펫팅했습니다. 이를 순진한 마우스와 비교하였다 (n=3; 비내 투여 없음).
이미징시 성공적인 수술 준비는 여러 가지 요인으로 식별 할 수 있습니다. 폐는 25 μm 이하의 순환 프레임 시프트를 일으키는 호흡으로 비교적 안정적이어야합니다. 폐포는 명확하게 볼 수 있어야하며 갯벌 팽만감 / 수축을 나타낼 수 있습니다. 청색광 (450-490 nm 파장)에 의한 여기는 혈류 방향성의 시각화를 허용하며, 개별 적혈구 (보충 영화 1, 보충 영화 <s...

생체 내 형광 현미경 검사는 백혈구 - 내피 상호 작용 및 모세관 관류를 실시간으로 연구하는 데 활용 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 진공-안정화된 폐 영상화 시스템을 사용하여 폐 미세순환에서 이러한 파라미터를 영상화하고 정량화하는 방법을 기술한다.

Intravital imaging of leukocyte-endothelial interactions offers valuable insights into immune-mediated disease in live animals. The study of acute lung ...

이 프로토콜은 생체내에서 폐 백혈구 부착 및 모세관 관류를 이미지화하기 위해, 외과적 준비 및 진공 안정화 시스템의 사용을 상세히 기술한다. 이 기술의 가장 큰 장점은 최소한의 물리적 외상으로 손상되지 않은 미러링 폐의 안정적인 고해상도 생체 내 이미징을 허용한다는 것입니다. 시작하려면, 진공 채널의 오염을 피하면서 외부 링의 상부에 얇은 층의 진공 그리스를 투여하여 이미징 윈도우를 준비하십시오.깨끗한 8mm 유리 커버 슬립을 창문에 놓고 부드럽게 눌러 씰을 만듭니다. 이미징 창을 디지털 압력 게이지가 장착된 진공 펌프에 연결하고 50~60mm의 수은 정수 흡입을 제공할 수 있습니다. 길이 광섬유 케이블을 20 게이지 기관내 캐뉼라를 통과시키고 팁을 리도카인 HCL에 잠기십시오.마취 후, 상부 절치가 검경의 틈새 내에 맞도록 수정 된 이토스코프를 삽입하십시오. epiglottis와 성대가 명확하게 보일 때까지 범위와 혀 위치를 조정하십시오. 검경의 틈새를 통해 광섬유 케이블을 삽입하고 작은 원형 움직임을 사용하여 성대 사이의 케이블을 통과 한 다음 광섬유 케이블을 가이드로 사용하여 캐뉼라를 기관으로 부드럽게 밀어 마우스를 삽관시킵니다.1.5 % 이소플루란으로 환기를 시작한 후 페달 반사 검사를 통해 마취 깊이를 확인하십시오. 캐뉼라를 의료용 테이프로 주둥이에 고정하십시오. 라벨링 테이프를 사용하여 오른쪽 앞발을 아홉 시 방향의 가열 패드에 고정하고 왼쪽 뒷발을 가성으로 뻗어 여섯 시 위치에 고정하십시오.천 테이프를 사용하여 왼쪽 앞발을 12시 위치로 가볍게 펴고 테이프의 다른 쪽 끝을 생체 내 현미경 검사 플랫폼 상단에 고정시킨 다음 직장 온도 프로브와 발 맥박 산소 포화도 측정기를 적용하여 실험 전반에 걸쳐 활력 징후를 모니터링합니다. 수술을 위해 마우스를 준비하려면 70 % 알코올로 흉부와 복부를 살균하고 미네랄 오일의 라이트 코트를 적용하여 마우스 왼쪽의 머리카락을 적셔야합니다. 흉곽 케이지의 바닥 근처에 작은 절개를 만들어 기본 근육층을 노출 시킨 다음 초기 절개를 연장하고 무딘 해부를 사용하여 흉곽을 노출시킵니다.지혈 포셉을 사용하여 해부 된 상피 및 지방 조직을 파악하고 수술 부위를 깨끗하게하십시오. 백혈구와 혈류를 형광 표지하려면 꼬리 정맥을 통해 로다민 6G 및 FITC 알부민의 킬로그램 당 2.5 밀리리터의 볼루스를 투여하십시오. 이빨이 달린 집게를 사용하여 갈비뼈를 최종 영감에서 폐 기저부의 위치보다 즉시 열등하게 잡으십시오.포셉을 약간 후퇴시켜 갈비뼈를 폐에서 떼어낸 다음 갈비뼈를 잘라 기흉을 유발합니다. 절개를 양쪽 방향으로 옆으로 뻗어 폐에 닿지 않도록주의하십시오. 무딘 포셉으로 다음으로 높은 갈비뼈를 잡고 폐가 흉벽에서 떨어지도록 약간 후퇴하십시오.폐가 분리되지 않으면 흉벽을 폐에 가볍게 눌러 폐가 하부 흉막에 달라 붙게하여 더 쉽게 떨어집니다. 결국 흉골까지 원래의 절개를 계속하고 폐의 정점이 노출 될 때까지 두개골로 계속하십시오. 면화 도포기와 거즈를 사용하여 발생하는 출혈을 감쇠시킵니다.흉곽을 들어 흉강의 등쪽 측면에 늑간 혈관을 노출시키고, 폐를 손상시키지 않도록주의하고, 척추 기둥 근처에서 가장 열등한 늑간 혈관을 소작 한 다음 인접한 갈비뼈를 자릅니다. 두개골로 움직이고, 결국 반복되는 소작 및 절단 패턴을 사용하여 흉곽의 약 한 두 센티미터 부분을 소비합니다. 이미징을 준비하려면 생체 내 현미경 플랫폼을 현미경 단계로 옮기고 이미징 창을 노출 된 폐 바로 위에 놓습니다.마이크로 조작기를 사용하여 이미징 창이 폐 표면에 부착되고 안정화될 때까지 조심스럽게 낮춥니다. 폐 미세 순환을 시각화하려면 20x 대물 및 표준 FITC 및 로다민 필터 세트가 장착 된 넓은 필드 형광 현미경을 사용하십시오. 흑백 CCD 카메라를 사용하여 최적의 대비로 비디오를 녹화하십시오.FITC 필터 세트를 사용하여 혈류의 수렴 패턴을 기반으로 폐 장소를 식별하고 장소에 초점을 맞춘 30 초 비디오를 녹화 한 다음 백혈구를 시각화하기 위해 로다민 필터 세트를 사용하여 동일한 시야각에서 녹화를 반복하십시오. 폐 동맥을 찾으려면 FITC 필터 세트를 사용하여 다양한 혈류 패턴이 있는 혈관을 식별하고 30초 분량의 비디오를 녹화합니다. 백혈구를 시각화하기 위해 로다민 필터 세트를 사용하여 동일한 시야에서 기록을 반복하십시오.관심 있는 모세관 영역을 찾으려면 FITC 필터 세트를 사용하여 더 큰 혈관에 의해 교차되지 않는 폐포 및 모세혈관의 영역을 식별하고 30초 비디오를 녹화합니다. 백혈구를 시각화하기 위해 로다민 필터 세트를 사용하여 동일한 시야에서 기록을 반복하십시오. 이 비디오는 녹색 화살표로 표시된 대로 폐 부위 내의 혈류에 대한 FITC 이미징을 묘사합니다.로다민 이미징은 빨간색 화살표로 표시된 두 개의 부착성 백혈구가있는 동일한 장소에서 백혈구를 시각화 할 수 있습니다. 이들 방법은 또한 동일한 현상과 폐동맥 및 모세혈관 관심 영역을 시각화하기 위해 적용되었다. 미세순환 파라미터의 정량화를 입증하기 위해, 마우스를 폐 염증을 유도하기 위해 비강내 LPS로 처리하였다.폐 장소에서의 백혈구 밀매는 순진하고 LPS 처리된 마우스에서 분석된 내피 영역을 나타내는 윤곽이 그려진 영역과 함께 여기에 표시된다. 백혈구 부착 및 압연은 LPS 처리된 마우스에서 증가하였다. 폐동맥에서의 백혈구 밀매는 순진한 및 LPS 처리된 마우스에서 분석된 내피 영역을 나타내는 개략적인 영역과 함께 여기에 도시되어 있다.백혈구 부착은 LPS 처리된 마우스에서 더 높았다. 이 그림은 순진하고 LPS 처리 된 마우스에서 폐 모세 혈관 내 백혈구 부착을 보여줍니다. 백혈구 부착은 LPS 처리된 마우스에서 순진한 마우스에 비해 더 높은 것으로 나타났다.이 그림은 순진하고 LPS 처리 된 마우스에서 폐 모세 혈관의 관류를 보여줍니다. 기능적 모세관 밀도는 LPS 처리된 마우스에서 나이브 대비 더 낮은 것으로 나타났다. 이 프로토콜에는 많은 도전적인 측면이 있습니다.플랫폼에서 마우스의 위치를 최적화하는 것은 수술 및 이미징 단계를 훨씬 더 재현 할 수있는 간단한 단계입니다. 이 절차는 광범위한 연구 매개 변수 및 현미경 접근법에 적용 할 수 있습니다. 따라서 건강한 상태와 병든 상태 모두에서 폐 미세 순환에 대한 추가 연구를 촉진해야합니다.

intravital-widefield-fluorescence-microscopy-pulmonary

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 비디오는 마우스 모델에서 혈전 형성을 연구하기 위한 생체 내 형광 현미경 검사 기술을 보여줍니다. 마우스는 혈액 순환을 모니터링하기 위해 형광단이 표지된 다당류를 주입합니다. 고강도의 빛으로 조명을 비추면 귀의 미세 혈관 구조에서 손상의 광독성 유도가 혈전을 형성하게 되며, 이는 혈류의 방해를 시각화하여 확인됩니다.

미세혈관 혈전 형성을 연구하기 위한 Intravital Fluorescence Microscopy

고립 된 혈액 관류 폐 준비는 폐 표면에 미세 혈관의 네트워크를 시각화하는 것이 가능합니다. 여기에서 우리는 실시간 형광 이미징을 사용하여 격리 된 폐의 단일 미세 혈관의 투과성을 정량화하는 방법을 설명합니다.

고립 된 혈액 관류 쥐 폐 준비에 단일 미세 혈관 투과성의 양을

폐쇄 흉부 폐폐 생체 내 현미경을 사용하여 자동화된 방식으로 쥐의 흉막 표면 전이에서 미세순환 혈류 속도를 측정하는 방법을 제시합니다. 이 모델은 설치류의 폐 전이에 대한 생리학적 연구를 수행하기 위한 광범위한 도구로 사용될 가능성이 있습니다.

쥐의 폐 전이의 미세 혈류 속도의 자동 측정

우리는 쥐에 형광 기자를 활용, 폐 전이에서 종양 세포 기질 상호 작용의 생체 라이브 영상에 대한 비교적 간단한 방법을 설명합니다. 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하여,이 기술은 최소 4 시간 동안 생균의 시각화를 가능하게하고 다른 염증성 폐 상태를 학습하도록 구성 될 수있다.

예는 폐 전이 및 그들의 미세 환경의 라이브 영상을 생체 내

이 프로토콜은 다광자 현미경을 사용하여 진공 안정화 이미징 창을 사용하여 실시간으로 온전한 폐의 장기 고해상도 단일 세포 이미징을 수행하는 방법을 설명합니다.

진공 안정 이미징 창으로 폐의 장기 고해상도 생체 내에 현미경

이 연구에서는 선물이 인플루엔자 바이러스 감염 후 murine tracheal 점 막에서 2 광자 intravital 이미징 및 세포 상호 작용 분석을 수행 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 호흡기 감염 시 면역 세포 역학을 공부 하는 연구자와 관련이 있을 것입니다.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

백혈구와 혈소판의 모집은 동맥 형성 동안 측부 동맥의 효과적인 성장에 필요한 필수 구성 요소를 구성합니다. 다광자 현미경은 동맥 형성 중 백혈구 모집 및 유출을 연구하기 위해 생체 내에서 높은 시공간 분해능과 더 적은 광독성으로 세포 역학을 추적하는 효율적인 도구입니다.

쥐 뒷다리 모델에서 동맥 형성 중 백혈구 모집을 모니터링하기 위한 다광자 생체 내 이미징

여기에서는 이광자 현미경을 사용하여 이식된 쥐의 왼쪽 폐를 생체 내 이미징하는 프로토콜을 제시합니다. 이는 쥐 폐 이식 후 실시간으로 세포 역학 및 상호 작용을 연구하는 데 유용한 도구입니다.

이식된 마우스 폐의 생체 내 2광자 현미경

여기서는 BSL-2 승인 마이코박테리움 결핵 증의 감쇠 체내 영상 프로토콜을 제시합니다. 영구 폐 창을 이용한 쥐 폐 내 스트레스. 이 접근법은 동일한 폐 미세환경 내에서 세균 위치, 혈관 역학, 대식세포 흡수 등 초기 숙주-병원체 상호작용의 종단적 단일 세포 분해 분석을 가능하게 합니다.

초기 혈관 내 감염 중 쥐 폐에서 희석된 위영양성 결핵 균의 생명체 내 영상

배우세요 진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 생체내 광역 형광 현미경법으로 폐 미세순환의 백혈구-내피세포 상호작용과 모세관 관류를 실시간 관찰하는 방법. 이 기술은 최소한의 물리적 외상으로 고해상도 영상을 제공합니다.

진공 안정화 이미징 시스템을 이용한 실험적 급성 폐 손상에서의 폐 미세순환의 생체내 광역 형광 현미경 검사

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