Name: 높은 처리량의 극저온 전자 현미경을 위해 두께 조절이 가능한 마이크로 패턴 칩 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 20 s
Description: 학습하세요 MEMS 기술을 활용한 마이크로 패턴 칩 제조 방법으로, 그래핀 산화물 창을 통해 극저온 전자 현미경에서 생체분자와 나노물질의 고효율 고처리량 이미징을 실현합니다. 이 기술은 신경과학 및 바이오테크놀로지 연구에 활용됩니다.

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M.-H.K., S.K., M.L., J.P.는 기초 과학 연구소의 재정 지원을 인정합니다 (보조금 번호. IBS-R006-D1). S.K., M.L., J.P.는 서울대학교(2021)를 통한 창의적 선구자 연구자 프로그램의 재정 지원과 한국 정부가 지원하는 NRF 보조금(MSIT; 그랜트 번호 NRF-2020R1A2C2101871 및 NRF-2021M3A9I4022936). M.L.과 J.P.는 포스코TJ 파크재단 포스코사이언스 펠로우십의 재정 지원과 한국 정부가 지원하는 NRF 보조금(MSIT; 그랜트 번호 NRF-2017R1A5A1015365). J.P.는 한국 정부가 지원하는 NRF 보조금의 재정 지원을 인정합니다 (MSIT; 그랜트 번호 NRF-2020R1A6C101A183), 서울대학교 공과대학 및 의과대학별 학제간 연구이니셔티브 프로그램(2021). M.-H.K.는 한국 정부가 지원하는 NRF 보조금의 재정 지원을 인정합니다 (MSIT; 그랜트 번호 NRF-2020R1I1A1A0107416612). 저자들은 서울대학교 거대분자세포영상센터(서울대 CMCI)의 직원과 승무원들이 cryo-EM 실험에 대한 끊임없는 노력과 인내에 감사를 표한다. 저자들은 FIB-SEM 실험에 도움을 준 국립 대학 간 연구 시설 센터의 김 S. J. 김 씨에게 감사드립니다.

1. GO 윈도우를 사용한 마이크로 패턴 칩 제작(그림 1)
<ol><li>실리콘 질화물을 증착하십시오.<ol><li>830°C에서 저압 화학 기상 증착(LPCVD)을 사용하여 Si 웨이퍼의 양면에 저응력 질화 실리콘(SixNy)을 증착하고, 150 mTorr의 압력에서, 170 sccm 디클로로실란(SiH2Cl2, DCS) 및 38 sccm 암모니아(NH3)의 흐름 하에서 증착한다.</li>
		<li>~ 30 Å / min의 증착 속도를 사용하여 증착 시간을 변화시켜 SixNi 두께를 25-100 nm 이내로 제어하십시오. 참고: Si 웨이퍼를 취급할 때는 웨이퍼가 매우 얇고 깨지기 쉽기 때문에 각별히 주의해야 합니다. 웨이퍼가 장비에 취급되거나 적재되는 동안 웨이퍼가 구부러지지 않도록 주의하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>포토레지스트를 패턴화합니다.<ol><li>웨이퍼의 전체 표면을 덮을 수 있을 충분한 부피의SixNi증착된 Si 웨이퍼에 헥사메틸디실라잔(HMDS) 용액을 적용하고, 스핀 코터를 3,000rpm으로 30초 동안 스핀 코터로 스핀 코트하고, 핫플레이트에서 95°C에서 30초 동안 베이킹하여 웨이퍼 표면을 소수성으로 렌더링하여 포토레지스트(PR)로 우수한 코팅 성능을 보장합니다.</li>
		<li>웨이퍼의 전체 표면을 덮기에 충분한 부피의 포지티브 PR(Table of Materials)을 적용하고, 스핀 코트를 30초 동안 3,000rpm으로 스핀 코트하고, 핫 플레이트 상에서 90초 동안 100°C에서 베이킹한다. 스핀-코팅된 PR은 500 nm의 두께를 갖는다.</li>
		<li>PR 코팅 웨이퍼를 얼라이너를 사용하여 크롬 마스크(그림 2A-D)를 통해 5초 동안 자외선(365nm 파장 및 20mW/cm2 강도)으로 노출합니다.</li>
		<li>현상제(Table of Materials)를 이용하여 1분 동안 PR을 개발하고, 웨이퍼를 탈이온화(DI) 물 2x에 침지시켜 헹구었다. PR 패턴화된 웨이퍼를 웨이퍼 표면 상에N2 가스를 송풍하여 완전히 건조시킨다. 참고: 웨이퍼가 매우 얇고 깨지기 쉽기 때문에N2 가스를 Si 웨이퍼에 불어 넣는 동안 각별한주의를 기울여야합니다. 웨이퍼에 수직인 방향으로 고압으로N2 가스를 불어 넣지 마십시오, 이것은 웨이퍼를 파단시킬 수 있기 때문입니다.</li>
	</ol></li>
	<li>SixNy를 패턴화합니다.<ol><li>노출된SixNy를 실험실에서 구축한 반응성 이온 에칭기(RIE)를 사용하여 PR의 패터닝에 이어서, 50 W의 고주파(RF) 전력에서 3 sccm 황 육불화물(SF6) 가스로 에칭한다. 이러한 설정의 에칭 속도는 ~ 6 Å/s입니다. 증착된SixNy층의 두께에 따라 에칭 시간을 설정한다. 참고: 에칭 속도는 다를 수 있으며 사용되는 RIE 장비의 사양에 따라 실험실 내 최적화가 필요합니다.</li>
		<li>SixNi패턴화된 웨이퍼를 실온에서 30분 동안 아세톤에 침지시켜 PR을 제거하고, 이를 DI 물 2x에 침지시켜 웨이퍼를 헹구었다. N2 가스를 웨이퍼 표면 상에 송풍하여 웨이퍼를 완전히 건조시킨다. 참고: 용액의 표면 장력에 의해 웨이퍼가 파괴될 수 있기 때문에 용액에서 웨이퍼를 침지하거나 꺼내는 동안 극도의 주의를 기울여야 합니다. 웨이퍼를 용액 표면에 평행하게 담그거나 꺼내지 마십시오. 탄소 섬유 팁으로 핀셋을 취급하는 정밀 웨이퍼를 사용하십시오. 트위저로 웨이퍼를 강하게 잡지 마십시오. 웨이퍼가 용액에서 꺼낼 수 있는 각도로 기울어질 때까지 웨이퍼의 한쪽을 들어올립니다. 웨이퍼는 리프팅 중에 확고한 그립으로 인해 구부러질 때 골절 될 수 있습니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Si를 에칭하십시오.<ol><li>KOH 분말을 80°C에서 DI 물에 용해시켜 1.5 M 수산화칼륨(KOH) 용액을 제조하였다.</li>
		<li>노출된 Si를 에칭하기위해 패턴화된 SixNy 웨이퍼를 KOH 용액에 침지시켜 자유 랜딩 SixNy 윈도우가 패턴화된SixNy의 반대쪽에서 관찰될 수 있을 때까지 교반하면서용액 중에 웨이퍼를 남겨둔다. 참고: 습식 에칭 시간은 Si의 두께에 따라 다를 수 있습니다. 100μm 두께의 웨이퍼의 경우 습식 에칭에는 일반적으로 몇 시간이 걸립니다. Si 에칭 중에 교반 속도를 너무 높게 설정하지 마십시오, 왜냐하면 독립형SixNi윈도우는 매우 얇고 유체의 흐름에 의해 파괴될 수 있기 때문이다. 본 실험에서, 교반 속도는 250 rpm으로 설정되었다.</li>
		<li>에칭된 웨이퍼를 DI 수조에 여러 번 침지하여 청소하여 에칭 잔여물을 제거한다. 웨이퍼를 공기 중에 말리십시오. 참고: 독립형 SixNiy 윈도우는 매우 얇고 깨지기 쉽고 용액의 표면 장력에 의해 파괴될 수 있으므로 용액에서 Si 패턴화된 웨이퍼를 침지하거나 꺼내는 동안 극도의 주의를 기울여야 합니다. 웨이퍼는 웨이퍼의 가장자리가 먼저 용액으로 들어오고 나가도록 비스듬히 침지되거나 꺼내져야 한다.</li>
	</ol></li>
	<li>KOH 에칭 잔류 물을 제거하십시오.<ol><li>핀셋으로 칩 어레이의 경계를 가볍게 눌러 마이크로 패턴화될 칩 어레이를 얻습니다(그림 1B).</li>
		<li>교반하면서 80°C에서 1.5 M KOH 용액을 제조하였다.</li>
		<li>칩 어레이를 KOH 용액에 30초 동안 담그고 DI 물 2x에 담가 헹구십시오. N2 가스를 불어 칩을 완전히 건조시킵니다. 참고 : 칩을 용액에 담그고N2 가스로 블로우 드라이하는 동안 독립형 SixNi 창문이 매우 얇고 깨지기 쉽기 때문에 극도의주의를 기울여야합니다. 칩이 KOH 용액에 침지되는 동안, 교반은 중단되어야 한다. 칩은 먼저 용액에 수직인 방향으로 가장자리를 담그고 평행 방향으로N2 가스로 날려야합니다.</li>
		<li>칩 어레이를 공기 중에서 최소 1시간 동안 완전히 건조시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>PR을 패턴화합니다.<ol><li>고체 지지체로서 블랭크 525 μm Si 웨이퍼를 제조하였다. 전술한 바와 같이 Si 웨이퍼를 HMDS 및 포지티브 PR로 스핀 코팅하되, PR을 베이킹하기 전에 Si 웨이퍼 상에 칩 어레이(자립형SixNy윈도우 측을 위쪽으로 갖는)를 부착한다. PR은 웨이퍼와 칩 어레이 사이의 접착제 역할을 한다. 칩 어레이와 함께 부착된 Si 웨이퍼를 핫플레이트 상에서 90초 동안 100°C에서 굽는다.</li>
		<li>상기 기재된 바와 같이 HMDS 및 포지티브 PR로 설정된 칩을 스핀 코팅한다.</li>
		<li>얼라이너를 사용하여 크롬 마스크(그림 2E,F)를 통해 자외선(365nm 파장, 20mW/cm2 강도)으로 칩 세트를 5초 동안 노출합니다.</li>
		<li>현상제를 이용하여 PR을 15초 동안 개발하고, 칩 세트를 DI 물 2x에 침지하여 헹구고, N2 가스를 불어 PR 패턴화된 칩 세트를 완전히 건조시킨다.</li>
	</ol></li>
	<li>마이크로 패터닝된SixNy를 준비한다.<ol style="margin-left: 40px;"><li>식각SixNy는 실험실에서 구축한 RIE를 이용한 PR 패터닝에 이어, 50 W의 RF 전력에서 3 sccm SF6 가스로 SixNy층의 두께에 따라 에칭 시간을 제어한다.</li>
	</ol></li>
	<li>PR을 제거하십시오.<ol><li>패터닝된 칩 세트를 60°C에서 1-메틸-2-피롤리디논(NMP) 용액에 침지하고 밤새 방치함으로써 PR을 제거한다. 칩 세트를 DI 물 2x에 침지하여 헹구고, N2 가스를 불어 패턴화된 칩 세트를 완전히 건조시킨다.</li>
		<li>실험실에서 제작한 RIE로 1분 동안 150W의 RF 전력에서 100sccm O2 가스를 사용하여O2 플라즈마 공정으로 PR 잔류물을 제거합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>마이크로 패터닝된 칩을 헹구십시오.<ol><li>80°C에서 1.5 M KOH 용액을 제조하였다.</li>
		<li>마이크로 패턴화된 칩을 KOH 용액에 30초 동안 담그면 PR 잔류물을 완전히 제거하고 칩을 DI 물 2x에 침지하여 헹구십시오. N2 가스를 불어 칩을 완전히 건조시킵니다.</li>
		<li>칩을 공기 중에서 적어도 1 시간 동안 완전히 건조시킵니다.</li>
	</ol></li>
	<li>드롭 캐스팅 방법에 의해 그래핀 옥사이드 (GO)를 전송한다.<ol><li>GO 용액 (2 mg / mL)을 DI 물로 0.2 mg / L로 희석하고 10 분 동안 초음파 처리하여 GO 시트의 응집체를 분해하십시오. 희석된 GO 용액을 30 x g 에서 30 s 동안 원심분리한다.</li>
		<li>마이크로 패터닝된 칩의 Si 에칭된 측면을 글로우 방전시켜 1분 동안 15mA에서 글로우 디스캐터(Table of Materials)를 사용하여 칩 표면을 양전하로 렌더링한다.</li>
		<li>3 μL의 GO 용액을 마이크로패터닝된 칩의 글로우 배출 측면 상에 떨어뜨리고 1분 동안 칩 상에 드롭을 남겨둔다. 1분 후, 과량의 GO 용액을 여과지로 칩 위에 뽑아낸다.</li>
		<li>파라핀 필름에 준비된 DI 물방울로 GO 전사 칩을 세척하고 칩의 DI 물을 여과지로 닦아냅니다. GO 전송 측에서 2x, 반대쪽에서 1x이 절차를 반복하십시오. GO 이송 칩을 실온에서 하룻밤 동안 건조시킨다.</li>
		<li>마이크로 패턴화된 칩을 GO 윈도우로 세척하여 DI 물에 담그고 칩을N2 가스로 블로우 드라이한다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Cryo-EM 이미징
<ol><li>냉동 샘플을 준비하십시오.<ol><li>온도, 습도, 블롯팅 시간 및 힘을 제어하는 기계식 냉동 플런징 기계 (재료 표)를 사용하여 냉동 샘플을 준비하십시오. 블롯팅 패드를 블롯터 상에 로딩한 후, 챔버 내의 습도 및 온도가 각각 100% 및 15°C로 유지되도록 보장한다.</li>
		<li>일반적인 냉동 핀셋으로 마이크로 패턴화 된 칩을 집어 들고 핀셋을 냉동 플런징 기계에로드하십시오. 3 μL의 샘플 용액을 구멍 패턴화된 측면의 마이크로 패턴화된 칩 상에 피펫팅하고, 바닥에 GO 윈도우를 부착한다. 샘플 용액에 따라 블롯팅 시간 및 힘을 조절한다. 참고: 여기에서, 생물학적 표본, 즉 인간 면역결핍 바이러스 (HIV-1), 페리틴, 프로테아좀 26S, groEL, 아포페리틴 단백질 입자 및 타우 필라멘트 단백질이 cryo-EM 영상화에 사용되었다. 또한,Fe2O3나노입자(NP), Au 나노입자, Au 나노입자, 및 실리카 나노입자와 같은 다양한 유형의 무기 물질이 cryo-EM 이미징에 사용되었다. 원하는 블롯팅 시간 및 힘을 상이한 유형의 샘플에 대해 냉동 플런저 상에 설정하였다.</li>
		<li>블롯팅 공정 후, 플런지-로딩된 칩을 액체 에탄에 즉시 동결시킨다. 칩을 액체 질소(LN2)의 그리드 박스로 옮기고 cryo-EM 이미징 전에 LN2 에 보관합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>cryo-EM 이미징을 수행하십시오.<ol><li>cryo-샘플을 -180°C로 유지되는 cryo-EM 홀더에 로딩하십시오.</li>
		<li>cryo-EM 홀더를 TEM에 로드하고 최소 용량 시스템(MDS) 모드로 샘플을 관찰합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Chuang, W. H., Fettig, R. K., Ghodssi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electrostatic+actuator+for+fatigue+testing+of+low-stress+LPCVD+silicon+nitride+thin+films%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+a-Physical%22%5BJournal%5D)">An electrostatic actuator for fatigue testing of low-stress LPCVD silicon nitride thin films.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 121 (2), 557-565 (2005).</li>
<li>Shafikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengthening+ultrathin+Si3N4+membranes+by+compressive+surface+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+and+Actuators+a-Physical%22%5BJournal%5D)">Strengthening ultrathin Si3N4 membranes by compressive surface stress.</a> Sensors and Actuators a-Physical. 317, 112456(2021).</li>
<li>Ng, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+and+modelling+the+wetting+properties+of+III-V+semiconductor+surfaces+using+re-entrant+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Controlling and modelling the wetting properties of III-V semiconductor surfaces using re-entrant nanostructures.</a> Scientific Reports. 8, 3544(2018).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore-templated+silver+nanoparticle+arrays+photopolymerized+in+zero-mode+waveguides%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Nanopore-templated silver nanoparticle arrays photopolymerized in zero-mode waveguides.</a> Frontiers in Chemistry. 7, 216(2019).</li>
<li>Escobedo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-chip+nanohole+array+based+sensing%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">On-chip nanohole array based sensing: a review.</a> Lab Chip. 13, 2445-2463 (2013).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

GO 윈도우를 사용하여 마이크로 패턴화된 칩을 생산하기 위한 미세 제조 공정이 여기에 소개되어 있습니다. 제작된 마이크로 패터닝된 칩은 분석하고자 하는 물질의 크기에 따라 GO 윈도우로 마이크로홀의 깊이를 제어함으로써 유리체 얼음층의 두께를 조절하도록 설계되었다. GO 윈도우가 있는 마이크로 패턴화된 칩은 일련의 MEMS 기술과 2D 나노시트 전달 방법을 사용하여 제작되었다(그림 1). MEMS 제조 기술을 사용하는 가장 큰 장점은 대량 생산 능력과 포토 리소그래피 중에 크롬 마스크의 다양한 디자인을 사용하여 마이크로 칩의 구조와 치수를 조작 할 수있는 타당성입니다 (그림 2). 낮은 응력을 갖는 LPCVD 증착된 SixNy층은 수십 나노미터 두께의 독립형SixNy23,24,25,26의 안정성을 보장한다.</sup...

극저온 전자 현미경 (cryo-EM)은 그들의 자연 상태 1,2,3,4에서 단백질의 3 차원 (3D) 구조를 해결하기 위해 개발되었습니다. 이 기술은 유리체 얼음의 얇은 층 (10-100nm)에 단백질을 고정시키고 샘플을 액체 질소 온도에서 유지하면서 투과 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 무작위로 배향 된 단백질의 돌출 이미지를 획득하는 것을 포함합니다. 수천 내지 수백만 개의 프로젝션 이미지들이 획득되어 계산 알고리즘(5,6)에 의해 단백질의 3D 구조를 재구성하는데 사용된다. cryo-EM을 통한 성공적인 분석을 위해 블롯팅 조건, 습도 및 온도를 제어하는 장비를 급락 동결시킴으로써 냉동 시료 준비가 자동화되었습니다. 샘플 용액은 구멍이 많은 탄소 멤브레인이있는 TEM 그리드에 로딩되고, 연속적으로 블롯팅되어 과량의 용액을 제거한 다음 액체 에탄으로 급락 동결시켜 얇은 유리체 얼음 1,5,6을 생성합니다. cryo-EM의 발전과 시료 준비7의 자동화로 인해 cryo-EM은 세포막 8,9,10에서 바이러스용 엔벨로프 단백질 및 이온 채널 단백질을 포함한 단백질의 구조를 해결하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 병원성 바이러스 입자의 외피 단백질의 구조는 바이러스 감염 병리를 이해하고 COVID-19 전염병을 일으킨 SARS-CoV-211과 같은 진단 시스템 및 백신을 개발하는 데 중요합니다. 더욱이, cryo-EM 기술은 최근 배터리(12,13,14) 및 촉매 시스템(14,15)에 사용되는 빔 감응성 물질을 이미징하고 용액 상태(16)에서 무기 물질의 구조를 분석하는 것과 같은 재료 과학에 적용되고 있다.
cryo-EM 및 관련 기술의 눈에 띄는 발전에도 불구하고 냉동 샘플 준비에는 한계가 존재하여 고처리량 3D 구조 분석을 방해합니다. 최적의 두께로 유리체 얼음 필름을 준비하는 것은 원자 분해능을 가진 생물학적 물질의 3D 구조를 얻는 데 특히 중요합니다. 얼음은 얼음에 의해 흩어져있는 전자의 배경 잡음을 최소화하고 전자 빔 경로1,17을 따라 생체 분자의 겹침을 금지 할만큼 충분히 얇아야합니다. 그러나, 얼음이 너무 얇으면, 단백질 분자가 바람직한 방향으로 정렬되거나 변성(18,19,20)될 수 있다. 따라서 유리체 얼음의 두께는 관심있는 물질의 크기에 따라 최적화되어야합니다. 또한, 일반적으로 준비된 TEM 그리드 상에서 얼음 및 단백질 무결성의 샘플 준비 및 수동 스크리닝을 위해 광범위한 노력이 필요합니다. 이 프로세스는 매우 시간이 많이 걸리므로 고처리량 3D 구조 분석의 효율성을 저해합니다. 따라서 cryo-EM 샘플 준비의 신뢰성과 재현성의 향상은 재료 과학뿐만 아니라 구조 생물학 및 상업용 약물 발견에서 cryo-EM의 활용도를 향상시킬 것입니다.
여기에서는 제어된 얼음 두께(21)를 갖는 고처리량 cryo-EM을 위해 설계된 산화그래핀(GO) 윈도우를 갖는 마이크로 패턴화된 칩을 만들기 위한 미세 제조 공정을 소개한다. 마이크로 패턴화된 칩은 이미징 목적에 따라 칩의 구조와 치수를 조작할 수 있는 미세전자기계 시스템(MEMS) 기술을 사용하여 제작되었습니다. GO 윈도우를 갖는 마이크로패터닝된 칩은 샘플 용액으로 충전될 수 있는 마이크로웰 구조를 가지며, 마이크로웰의 깊이는 유리체 얼음의 두께를 제어하도록 조절될 수 있다. 생체 분자에 대한 GO의 강한 친화력은 시각화를위한 생체 분자의 농도를 향상시켜 구조 분석의 효율성을 향상시킵니다. 또한, 마이크로 패턴화된 칩은 그리드(19)에 높은 기계적 안정성을 제공하는 Si 프레임으로 구성되어, 샘플 준비 절차 및 cryo-EM 이미징 동안 칩을 취급하는 데 이상적입니다. 따라서 MEMS 기술로 제작된 GO 윈도우가 있는 마이크로 패턴 칩은 cryo-EM 샘플 준비의 신뢰성과 재현성을 제공하여 cryo-EM을 기반으로 효율적이고 높은 처리량의 구조 분석을 가능하게 합니다.

<table><tbody><tr><td>1-메틸-2-피롤리디논(NMP)</td><td>Sigma Aldrich, 미국</td><td>443778</td><td></td></tr><tr><td>아세톤</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM</td><td>Park Systems, 한국</td><td>NX-10</td><td></td></tr><tr><td>Aligner</td><td>Midas System, 한국</td><td>MDA-600S</td><td></td></tr><tr><td>AZ 300 MIF 개발자</td><td>AZ Electronic Materials USA Corp., 미국</td><td>184411</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-EM 홀더</td><td>Gatan, 미국</td><td>626 단일 틸트 cryo-EM 홀더</td><td></td></tr><tr><td>극저온 플런지 머신</td><td>Thermo Fisher SCIENTIFIC, 미국</td><td>Vitrobot Mark IV</td><td></td></tr><tr><td>집속 이온 빔 주사 전자 현미경 (FIB-SEM)</td> <td>FEI Company, 미국</td><td>Helios NanoLab 650</td><td></td></tr><tr><td>글로우 배출기</td><td>Ted Pella Inc., 미국</td><td>PELCO easiGlow</td><td></td></tr><tr><td>그래핀 산화물 (GO) 솔루션</td><td>Sigma Aldrich, 미국</td><td></td><td></td>763705</tr><tr><td>Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%</td><td>Alfa Aesar, 미국</td><td>10226590</td><td></td></tr><tr><td>저압 화학 기상 증착 (LPCVD)</td><td>Centrotherm, 독일</td><td>LPCVD E1200</td><td></td></tr><tr><td>maP1205 positive PR</td><td>Micro resist technology, 독일</td><td>A15139</td><td></td></tr><tr><td>수산화칼륨 (KOH), 플레이크</td><td>대정화학 & METALS Co. LTD., South Korea</td><td>6597-4400</td><td></td></tr><tr><td>Raman Spectrometer</td><td>NOST, South Korea</td><td>Confocal Micro Raman System HEDA</td><td></td></tr><tr><td>Reactive ion etcher (RIE)</td><td>Scientific Engineering, South Korea</td><td>Lab-built</td><td></td></tr><tr><td>SEM</td><td>Carl Zeiss, Germany</td><td>SUPRA 55VP</td><td></td></tr><tr><td>Si wafer</td><td>JP COMMERCE, South Korea</td><td></td><td>4" 실리콘 웨이퍼, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um</td></tr><tr><td>스핀 코터</td><td>동아 무역 공사, 한국</td><td>ACE-200</td><td></td></tr><tr><td>TEM</td><td>JEOL, 일본</td><td>JEM-2100F</td><td></td></tr></tbody></table>

높은 처리량의 극저온 전자 현미경을 위해 두께 조절이 가능한 마이크로 패턴 칩 제조

Fabrication of Micro-Patterned Chip with Controlled Thickness for High-Throughput Cryogenic Electron Microscopy

극저온 전자 현미경 (cryo-EM)을 사용하는 생체 분자의 효율적이고 높은 처리량 구조 분석을위한 주요 한계는 나노 규모에서 제어 된 얼음 두께를 가진 cryo-EM 샘플을 제조하는 것이 어렵다는 것입니다. 두께 조절 질화 실리콘(SixNy) 막에 패터닝된 산화그래핀(GO) 윈도우를 갖는 마이크로홀의 규칙적인 어레이를 갖는 실리콘(Si) 기반 칩은 미세전자기계시스템(MEMS) 기술을 적용하여 개발되었다. UV 포토리소그래피, 화학 기상 증착, 박막의 습식 및 건식 에칭, 2D 나노시트 재료의 드롭 캐스팅은 GO 윈도우를 갖는 마이크로 패턴화된 칩의 대량 생산에 사용되었다. 마이크로 홀의 깊이는 cryo-EM 분석을 위한 시편의 크기에 따라 필요에 따라 얼음 두께를 제어하도록 조절됩니다. 생체분자에 대한 GO의 유리한 친화력은 cryo-EM 샘플 준비 동안 마이크로홀 내에서 관심있는 생체분자를 집중시킨다. GO 윈도우가 있는 마이크로 패턴 칩은 무기 나노 물질뿐만 아니라 다양한 생물학적 분자의 고처리량 cryo-EM 이미징을 가능하게 합니다.

GO 윈도우를 갖는 마이크로 패턴화된 칩은 MEMS 제조 및 2D GO 나노시트 트랜스퍼에 의해 제작되었다. 마이크로 패터닝용 칩은 대량 생산되었으며, 웨이퍼의 4개 칩에서 약 500개의 칩이 생산되었다(그림 1B 및 그림 2A,B). 마이크로 패턴화된 칩의 설계는 포토리소그래피 절차 중에 크롬 마스크의 다양한 설계(그림 2)를 사용하여 조작할 수 있습니다. 제작된 마이크로 패턴화된 칩은 독립형 SixNy 멤브레인의 수와 치수를 제어했습니다. 독립형SixNi멤브레인의 수는 48 (6 x 8)에서 50 (5 x 10)까지, 치수는 50 x 40 μm2에서 250 x 40μm2로 제어되었다 (그림 3A</str...

산화 그래핀 윈도우를 갖춘 새로 개발된 마이크로 패턴 칩은 미세 전자 기계 시스템 기술을 적용하여 제작되어 다양한 생체 분자 및 나노 물질의 효율적이고 높은 처리량의 극저온 전자 현미경 이미징을 가능하게합니다.

A major limitation for the efficient and high-throughput structure analysis of biomolecules using cryogenic electron microscopy (cryo-EM) is the ...

이 프로토콜은 Cryo EM을 사용하여 다양한 크기의 단백질 및 나노 물질을 성공적으로 관찰하기 위해 나노 스케일에서 사진 크기의 두께를 조절하는 데 중요합니다. Mem의 제조 기술은 마이크로 칩의 대량 생산을 가능하게합니다. 또한 마이크로 패턴 웰의 깊이와 디자인을 선택할 수 있습니다. 실험 목적에 따라.이 기술은 상업적 약물 발견에 활용되는 생체 분자의 고처리량 3D 구조 분석의 효율성을 높이는 데 기여할 수 있으며, 실리콘 니트로 멤브레인을 관리하는 위험이 있는 얇은 웨이퍼와 마이크로칩은 까다로울 수 있습니다. 웨이퍼를 구부리거나 질산 규소 창에 수직으로 힘을 가하지 않는 것이 중요합니다. 실리콘 질화물 증착된 실리콘 웨이퍼를 헥사메틸디실라잔 용액으로 덮음으로써 포토레지스트 또는 PR을 패터닝하기 시작하고, 이어서 상기 웨이퍼를 스핀 코더 상에서 30초 동안 3000RPM으로 스핀 코팅한다.코팅된 웨이퍼를 핫플레이트에서 섭씨 95도에서 30초 동안 굽어 수면을 소수성으로 만들고 PR로 우수한 코팅 성능을 보장합니다. 다음으로, 웨이퍼를 포지티브 PR로 스핀 코팅하고 섭씨 100도에서 90초 동안 굽습니다. 스핀 코팅된 PR은 500나노미터의 두께를 갖는다. PR 코팅 웨이퍼를 얼라이너를 사용하여 크롬 마스크를 통해 5초 동안 자외선에 노출시킵니다.현상액을 사용하여 1분 동안 PR을 현상하고 웨이퍼를 탈이온수에 침지하여 2회 헹굽니다. 그런 다음 물 표면에 질소 가스를 불어 PR 패턴 웨이퍼를 건조시킵니다. PR의 패턴을 따릅니다. 실험실에서 제작한 반응성 이온 에처를 50와트의 무선 주파수 전력과 분당 3 표준 입방 센티미터의 육불화황 가스와 함께 사용하십시오.노출된 실리콘 질화물을 초당 6옹스트롬의 속도로 에칭한다. 실리콘 질화물 패턴화된 웨이퍼를 실온에서 30분 동안 아세톤에 침지하여 PR을 제거한다. 이어서 웨이퍼를 탈이온수에서 2회 헹구고 웨이퍼를 질소 가스로 건조시켰다.노출된 si를 에칭하려면 실리콘 질화물 패턴 웨이퍼를 새로 준비된 수산화칼륨 용액에 담그십시오. 자유로운 입식 실리콘 질화물 윈도우가 패턴화된 웨이퍼의 반대측에서 관찰될 수 있을 때까지 계속 교반한다. 에칭된 웨이퍼를 탈이온수 수조에 여러 번 담가 세척합니다.그런 다음 웨이퍼를 공기 중에서 건조시킵니다. 에칭 잔류물을 제거하기 위해, 핀셋으로 칩 어레이의 경계를 가볍게 누르고 마이크로 패터닝될 칩 어레이를 얻는다. 그런 다음 칩 어레이를 새로 준비된 수산화 칼륨 용액에 30 초 동안 담근 다음 두 번 헹구고 칩을 질소 가스로 불어 1 시간 동안 공기 중에서 건조시킵니다.견고한 지지를 위해 앞에서 설명한 것처럼 스핀 코팅이 된 블랭크 525 마이크로 미터 실리콘 웨이퍼를 준비하십시오. 웨이퍼를 베이킹하기 전에 실리콘 웨이퍼 상에 치퍼레이를 부착하고 앞서 설명한 바와 같은 절차에 따라 마이크로패턴 실리콘 웨이퍼를 얻는다. 패턴 칩 세트를 섭씨 60도에서 1개의 메틸 2개의 순수한 리탄올 용액에 밤새 침지시켜 PR을 제거한다.다음날, 칩 세트를 탈 이온수로 두 번 헹굽니다. 패턴 칩 세트를 질소로 건조시킨 후, 반응성 이온 에처로 1분 동안 150와트의 무선 주파수 전력에서 분당 100 표준 입방 센티미터의 산소 가스를 사용하는 산소 플라즈마 공정으로 PR 잔류물을 제거한다. 나중에 마이크로 패턴 칩을 수산화칼륨 용액에 30초 동안 담그면 PR 잔류물이 완전히 제거됩니다.그런 다음 칩 세트를 헹구고 완전히 말리십시오. 그래핀 옥사이드 밀리리터당 2밀리그램 또는 용액을 탈이온수로 10배 희석하고 희석된 용액을 10분 동안 초음파 처리하여 시트의 응집체를 분해합니다. 그 후 희석된 용액을 실온에서 30초 동안 300배 G로 원심분리한다.1,500만 암페어의 글로우 방전기를 사용하여 마이크로 패턴 칩의 실리콘 에칭 면을 1분 동안 글로우 방전하고 칩 표면을 양전하로 렌더링합니다. 완료되면 3 마이크로 리터의 용액을 마이크로 패턴 칩의 글로우 방전면에 떨어 뜨립니다. 1 분 후, 여분의 용액을 여과지로 칩에 닦아냅니다.전사 된 칩을 파라핀 필름에 탈 이온수 방울로 씻고 여과지로 초과분을 닦아냅니다. 드롭 캐스팅 절차를 전송 된 쪽에서 두 번, 반대쪽에서 한 번 반복하십시오. 전사된 칩을 실온에서 밤새 건조시킨다.포토리소그래피 절차 동안 마이크로 패턴 칩의 디자인은 크롬 마스크의 다른 디자인을 사용하여 조작되었습니다. 독립형 실리콘 질화물 막의 수와 치수가 제어되었습니다. 제조 된 마이크로 패턴 칩은 최대 25, 000 개의 부유 구멍을 가질 수 있음이 관찰되었다.창에서의 라면 스펙트럼은 또한, 다층 배향 육각형 굴절 패턴은 창은 다층으로 구성되어 있음을 나타내고, 창과 함께 미세 구멍의 구조와 깊이는 주사전자현미경과 원자간력현미경으로 연구하였다. 창문이 있는 마이크로 홀의 웰타입 구조를 이미지에서 관찰하여 창문을 갖는 마이크로 패턴 칩의 설계 가능성을 확인하였다. 마이크로 패턴 칩의 도움으로 몇 가지 생물학적 표본과 무기 나노 입자를 초저온 전자 현미경으로 이미지화했습니다.패턴의 크기와 디자인에 따라 마이크로 패터닝을 위한 강도와 현상 시간을 사용하여 순수한 코팅 두께와 같은 조건을 최적화하는 것이 중요합니다. FIB 또는 리소 그래 핀과 같은 나노 패터 링 기술을 적용함으로써 다른 분석 기술과 함께 사용되는이 마이크로 장치의 응용 프로그램을 확장 할 수있는 일부 마이크로 미터 패턴을 생성 할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Engineering

공학

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