3차원 오가노이드 배양을 사용한 생체 외 인간 교모세포종 세포 다양성 유지

교모세포종에 대한 치료법을 찾는 것은 종양에 존재하는 세포 다양성과 다양한 미세 환경 간의 상호 작용으로 인해 어렵습니다. 오가노이드는 공간적 다양성의 일부를 재현하는 데 도움이 될 수 있으며, 이를 사용하여 종양의 생물학을 더 잘 이해할 수 있습니다. 전통적인 세포 배양 방법은 균일한 종양 세포 집단을 생성하는 경향이 있지만 오가노이드는 교모세포종의 분자 및 세포 다양성을 더 잘 모방하고 종양 내 상호 작용을 더 잘 모델링할 수 있습니다.

오가노이드는 약물 효능 및 내성 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 임상 요법에 대한 내성은 이 질병의 임상적 현실을 반영하여 전통적인 구체 문화가 아닌 오가노이드에서만 나타날 수 있습니다. 오가노이드는 화학요법의 지역적 효과를 입증하는 데 도움이 될 수 있습니다.

그들은 새로운 틈새 특정 치료법을 발견하는 데 사용될 수 있으며 미래에 개인화 된 의학을위한 예측 도구 역할을 할 수도 있습니다. 오가노이드를 만드는 데 사용되는 일부 재료는 온도에 민감하며 이러한 재료를 적절한 온도로 유지하지 않으면 오가노이드를 만들거나 유지하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 파라필름 시트에서 왁스 페이퍼를 꺼내 두 개의 멸균 96웰 중합효소 연쇄 반응 또는 PCR 플레이트 사이에 배치하여 배양 후드 아래에서 오가노이드 몰드 준비를 시작합니다.

파라필름 내부가 깨끗한지 확인하십시오. 상판에 균일한 압력을 가하여 구멍을 만들지 않고 파라필름에 2mm 깊이의 작은 딤플을 형성합니다. 플레이트를 분리하십시오.

보조개 파라 필름이 상판에 달라 붙습니다. 그런 다음 상판을 드라이 아이스에 30 초 동안 놓습니다. 멸균 집게를 사용하여 빠른 동작으로 상판에서 파라필름을 당깁니다.

냉동 파라 필름은 제거하기가 더 쉽습니다. 완성된 파라필름 몰드를 뚜껑이 덮인 멸균 10cm 세포 배양 접시에 넣습니다. 교모세포종 또는 GBM 부착성 배양물로부터 단세포 현탁액을 제조하기 위해, 사용된 배지를 플레이트로부터 제거한다.

그런 다음 실온에서 2 밀리리터의 세포 분리 용액을 플레이트에 넣고 플레이트를 37도에서 3 분 동안 배양합니다. 현미경으로 플레이트에서 세포 분리를 확인한 후 8 밀리리터의 신경 기저 배지 완료 또는 NBMc 배지를 추가하여 세포 분리 용액을 중화시킵니다. 단일 70-마이크론 세포 스트레이너를 통해 현탁액을 변형시킨다.

세포를 120 배 G에서 5 분 동안 스핀 다운합니다. 그런 다음 상청액을 제거하고 세포를 NBMc 1 밀리리터에 재현탁시킵니다. 세포 불 투과성 염색을 사용하여 단일 세포 현탁액으로부터 세포를 계수합니다.

단일 세포 현탁액에서 오가노이드를 만들려면 얼음 양동이 또는 콜드 블록의 작은 원심분리 튜브에 적절한 양의 라미닌이 풍부한 세포외 기질(lrECM)을 추가합니다. 유기체 당 20, 000 개의 세포를 함유하는 세포 혼합물을 제조한다. lrECM 세포 현탁액 혼합물을 완전히 혼합하여 세포가 침전되어 불균일한 오가노이드 형성을 초래하지 않도록 합니다.

다음으로, 20 마이크로 리터의 혼합물을 파라 필름 몰드에 조심스럽게 피펫하여 진주 모양의 물방울을 형성합니다. lrECM 중합을 방지하기 위해 2-3개의 오가노이드마다 피펫 팁을 냉각시키십시오. 원하는 수의 오가노이드가 10cm 배양 플레이트의 파라필름 몰드에 피펫팅되면 세포 배양 인큐베이터에서 섭씨 37도의 오가노이드를 1-2시간 동안 배양합니다.

오가노이드가 응고된 후 P1000 팁을 사용하여 NBMc 배지로 파라필름 몰드에서 오가노이드를 부드럽게 씻어내고 20ml의 NBMc가 포함된 새로운 10cm 배양 플레이트에 수집합니다. 배양 플레이트를 4일 동안 흔들지 않고 인큐베이터에 넣습니다. 4 일 후 플레이트의 미디어를 교체하십시오.

이렇게 하려면 세포 배양 플레이트 아래에 어두운 종이 한 장을 놓습니다. 플레이트를 기울이고 20 초 동안 기다립니다. 유기체가 접시 바닥에 완전히 가라 앉으면 큰 유리 피펫으로 천천히 미디어를 제거하십시오.

새 배지를 추가한 후 플레이트를 80RPM의 궤도 셰이커의 인큐베이터에 놓고 그 후 2-3일마다 배지를 교환합니다. 오가노이드의 성장은 광학 현미경을 사용하여 관찰하였다. 중앙도에서 초기 오가노이드 성장은 lrECM을 통한 이동 및 단일 세포 침습을 보여주었습니다.

7 주에 성숙한 유기체는 동전의 크기에 상대적이었습니다. GBM 오가노이드를 포스포-히스톤 H3로 염색한 결과, 코어에 비해 오가노이드 둘레에서 갈색 또는 보라색으로 나타나는 고도로 증식된 세포가 나타났습니다. 0.1%DMSO의 오가노이드에 대한 세포 생존율 데이터는 오가노이드 내 및 오가노이드 간 일관성을 입증했습니다.

유기체 바이오 매스 및 매체 산성화에주의하십시오. 오가노이드가 배지를 너무 빨리 통과하는 경우 배지를 더 자주 교환하거나 추가 플레이트 간에 오가노이드를 분할해야 합니다. 성숙한 오가노이드는 치료법 실험에 사용하거나 면역조직화학 또는 면역형광과 함께 사용하기 위해 포매 및 절편화할 수 있습니다.

해리된 오가노이드는 FACS 분석에 사용될 수 있다. 이러한 오가노이드는 최근 공간적으로 구별되는 암 줄기 세포 틈새에서 필수적인 표적을 발견하기 위해 3차원 기능 스크리닝에 사용되었습니다. 우리는 또한 이러한 모델을 사용하여 생체 내 테스트 전에 다양한 약물과 치료법의 우선 순위를 정하고 있습니다.