Name: 인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 학습하세요 광유전학 자극과 영상 처리를 이용한 3D 인간 신경근 접합부 공학 방법을. 이 기술은 중증근무력증 환자 혈청과 신경독소의 영향을 정량화하여 신경근 병리 연구와 치료제 테스트에 활용됩니다.

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우리는 NIH [보조금 번호 EB025765 및 EB027062], DOD [수상 번호 W81XWH-18-1-0095] 및 엔지니어링을 통한 UCSF 건강 혁신 (HIVE 펠로우십)의 자금 지원을 감사하게 생각합니다. 우리는 컬럼비아 대학 줄기 세포 코어가 세포 재 프로그래밍에 대한 도움과지도에 대해 감사하게 인정합니다.

이 작업을위한 모든 세포주는 미국 뉴욕 컬럼비아 대학의 제도적 지침에 따라 만들어지고 사용되었습니다.
1. 생물반응기 준비
<ol><li>생물반응기 주형 만들기<ol>
<li>보충 CAD 파일에서 생물반응기 CAD 파일을 다운로드하거나 사용자 정의 자체 설계를 작성하십시오.</li>
		<li>CAM 소프트웨어를 사용하여 3D 모델에서 CNC 공구 경로를 생성합니다.</li>
		<li>CNC 밀링 머신을 사용하여 기계 아세탈 금형.</li>
	</ol>
</li>
	<li>생물반응기 제조<ol>
<li>폴리디메틸실록산(PDMS, 4개의 플랫폼/몰드 당 77g의 혼합물)의 경화제 혼합물에 10:1 염기를 혼합한다.</li>
		<li>혼합물을 진공 챔버에 넣고, 모든 밸브를 닫고, 진공을 켜고, 기포가 남지 않을 때까지 혼합물을 적어도 30 분 동안 탈기하십시오. 혼합물을 몰드에 붓고 진공 챔버에서 금형을 1 시간 동안 가스 제거합니다.</li>
		<li>금형의 위쪽 절반을 올바른 방향으로 닫습니다. 강철 육각형 막대를 중앙에 놓고 양쪽에 클램프를 놓습니다.</li>
		<li>상단을 PDMS로 다시 채웁니다.</li>
		<li>몰드를 65°C 오븐에서 적어도 4시간 동안 경화시킨다.</li>
		<li>실온으로 냉각한 후 금형에서 플랫폼을 제거하십시오.</li>
		<li>1 시간 사이클의 접시 비누, 400 mL의 100 % 이소프로판올 및 증류수를 사용하여 초음파 욕조에서 장치를 청소하십시오.</li>
		<li>65°C에서 하룻밤 동안 건조시킨다.</li>
		<li>유리 커버슬립을 1% 비이온성 계면활성제 폴리올에 30분 동안 담그고 커버슬립이 모두 제대로 코팅되도록 쌓이지 않도록 하십시오.</li>
		<li>증류수로 잘 헹구고 65°C에서 밤새 건조시킨다.</li>
		<li>6 L/min의 산소와 함께 높은 곳에 플라스마 클리너를 1-2분 동안 사용하여 처리 유리 커버슬립 및 PDMS 플랫폼에 사용하십시오. 일단 처리되면, PDMS를 커버슬립 상으로 적어도 30초 동안 눌러서 둘을 함께 결합시킨다.</li>
		<li>셀을 추가하기 전에 접합된 장치를 오토클레이브합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 광학 자극 설정 구축
<ol><li>30mm 케이지 큐브 시스템을 사용하여 중앙에 573nm 이색성 거울을 부착합니다. 빨간색 627nm LED를 594nm 장역 여기 필터와 결합하고 LED가 거울을 향하도록 큐브의 위쪽에 연결합니다. 그런 다음 546nm 단거리 통과 여기 필터가 있는 파란색 488nm LED를 큐브의 인접한 측면에 부착하고 도 3A의 개략도에 표시된 것처럼 LED가 거울을 향하게 합니다.</li>
	<li>링 작동 아이리스 다이어프램을 케이지 큐브의 하단에 부착하여 조명 영역의 크기를 제어합니다.</li>
	<li>T-큐브 LED 드라이버로 각 LED에 전원을 공급하고 Arduino Uno Rev3 보드를 통해 제어합니다. LED 드라이버의 측면 입력을 전원 플러그에 연결하고 중간 출력을 Arduino에 연결한 다음 측면 출력을 LED에 직접 연결합니다.</li>
	<li>USB 케이블로 아두 이노 우노를 PC에 연결하십시오.</li>
	<li>GitHub 링크에서 파일을 다운로드합니다(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis).</li>
	<li>GitHub 폴더에서 "Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino" 파일을 엽니다.</li>
	<li>시작 매개 변수 설정: 단계 = 30; 시작 주파수 = 0.5; 끝 주파수 = 3; 펄스 길이 = 100.</li>
	<li>핀 출력 4가 파란색 LED 드라이버에 할당되고 핀 출력 2가 빨간색 LED 드라이버에 할당되었는지 확인합니다. LED 드라이버의 중간 전선이 접지 및 각 핀 출력에 연결되어 있는지 확인합니다.</li>
	<li>"Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino"프로그램을 컴파일하고 Arduino에로드하십시오.</li>
	<li>각 LED 드라이버를 해당 채널에 연결합니다.</li>
</ol>3. 세포 배양 셋업 (일-21-0일)
<ol><li>원발성 골격근 세포<ol>
<li>해동 및 Myotonic 성장 배지 (+ 보충)를 사용하여 최대 여섯 계대 동안 일차 골격 근세포 (쿡 Myosite로부터 수득)를 확장한다. 세포를 37°C 및 5%CO2로 설정된 인큐베이터에서 유지한다.</li>
		<li>2일마다 미디어를 변경합니다.</li>
		<li>일단 세포가 약 60% 합류하면, 0.05% 트립신-EDTA(1x, 37°C에서 5분 동안)를 사용하여 이를 통과시킨다. 해리 된 세포를 수집하고 트립신을 중화시키기 위해 신선한 배지를 추가하십시오.</li>
		<li>세포를 300 x g 에서 스핀 다운하고 세포 펠릿 위의 상청액을 흡인한다.</li>
		<li>세포를 MGM으로 재현탁시키고 삼중층 플라스크 당 60 mL로 시드 1:3으로 재현탁시킨다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>ChR2-hiPSC 참고 :이 작업을위한 모든 세포주는 미국 뉴욕 컬럼비아 대학의 제도적 지침에 따라 만들어지고 사용되었습니다. 이 프로토콜에서, ChR2-발현 hiPSCs는 앞서 기술된 방법18을 사용하여 CRISPR-Cas9 게놈 편집을 통해 생성되었지만, 임의의 안정한 광유전학적 세포주(렌티바이러스, piggyBac 등)는 동일한 방식으로 사용될 수 있다. iPSCs 및 모토뉴런 둘 다에서 발현되는 구성적 프로모터(CAG)를 선택하였다. 세포는 이전 간행물18,19에서 언급된 바와 같이 건강한 핵형을 갖는 것으로 밝혀졌다.<ol>
<li>6웰 플레이트를 DMEM/F12(1:80)에 희석된 가용화된 기저막 매트릭스 1mL/웰로 코팅하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한다.</li>
		<li>2mL의 피더프리 세포 배양 배지(iPSC 배지)로 코팅된 6-웰 플레이트 상에 시드된 iPSCs를 격일로 2mL의 배지를 교환하고 5-7일마다 통과시킨다. 세포를 37°C 및 5% CO2로 설정된 인큐베이터에 유지하십시오.</li>
		<li>패시징<ol>
<li>1 mL의 효소가 없는 줄기세포 방출시약과 함께 4분 동안 인큐베이션하고 넓은 팁 P1000 피펫으로 기계적으로 전단하여 줄기세포를 해리시킨다.</li>
			<li>시드 세포를 iPSC 배지에서 1:24 또는 1:48의 비율로 2 mL/웰의 Y-27632 디하이드로클로라이드 2 μM과 코팅된 6-웰 플레이트 상에 상에.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 골격근 조직 파종 (-3 일째)
<ol><li>자동화된 셀 카운터를 사용하여 30 x 106 근모세포를 분리하고 계수합니다.</li>
	<li>3 mg/mL 콜라겐 I과 가용화된 기저막 매트릭스(콜라겐 혼합물 800 μL + 기저막 매트릭스 200 μL의 4:1 혼합물의 혼합물)에 근아세포를 재현탁시켜 최종 부피 1 mL에 도달한다. 콜라겐 성분에 대해, 수반되는 중화제 (중화제에 콜라겐의 9:1 혼합)를 첨가하고, 혼합물을 1x PBS로 희석하여 800 μL의 부피를 달성한다.</li>
	<li>15μL의 세포-콜라겐 현탁액을 생물반응기의 각 근육 챔버에 첨가하고, 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 두 기둥 전체에 걸쳐 확산시킨다(그림 2).</li>
	<li>세포-겔 혼합물을 37°C에서 30분 동안 중합시킨 다음, 각 생물반응기 웰을 450 μL의 근긴장성 성장 배지로 채운다.</li>
	<li>3 일 후 (일단 젤이 압축되면), myotube 분화를 시작하십시오.</li>
</ol>5. Myotube 분화 (0-14 일)
<ol><li>조직을 450 μL의 융합 유도 배지 (FS, 표 1)로 7일 동안 전환하고, 격일로 배지를 변경함으로써 근관 주입을 시작한다. 참고: 두 세포 유형의 분화 스케줄의 끝에 모토뉴런을 시드하기 위해 hiPSCs로부터의 모토뉴론 분화와 같은 날에 근관 분화를 시작하려고 노력한다.</li>
	<li>7일째에 배지를 450 μL의 성숙 배지 Ia로 변경한다(MMIa, 표 1).</li>
	<li>9일째에, 450 μL의 성숙 배지 Ib로 변경한다(MMIb, 표 1).</li>
	<li>11일째에, 배지를 450 μL의 NbActiv4로 변경한다. 모토뉴런이 시드될 때까지 2일마다 배지를 계속 바꿔 놓으십시오(단계 7).</li>
</ol>6. 모토네론 분화 (0-14일)
참고 : 우리의 모토네론 차별화 프로토콜은 Maury et al8에서 채택되었습니다.
<ol><li>0일째에, 4 x 106 ChR2-hiPSCs를 15 mL의 모토뉴론 현탁액 배양 배지가 있는 초저 부착 페트리 디쉬에 옮긴다(MSCM, 표 1). MSCM을 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 수화물 및 5 μM Y-27632 디하이드로클로라이드로 보충하십시오.</li>
	<li>2일째에, 신경구(NS)를 37 μM 가역성 스트레이너로 분리하고, 3 μM CHIR99021, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431542 수화물, 및 0.1 μM 레티노산으로 15 mL의 MSCM에 재접종한다. NS는 2 일째 후에 현미경을 사용하지 않고 페트리 접시에서 볼 수 있어야합니다.</li>
	<li>4 일째에 세포와 배지를 50 mL 튜브로 옮기고 신경 구가 바닥에 정착하도록하십시오 (5 분). 상청액을 흡인하고, 세포를 0.5 μM SAG, 0.2 μM LDN193189, 40 μM SB431541, 및 0.1 μM 레티노산으로 보충된 MSCM의 15 mL에 재현탁시켰다.</li>
	<li>7일째에 6.3단계를 반복합니다. 세포를 0.5 μM SAG 및 0.1μM 레티노산으로 보충된 MSCM 15 mL에 재현탁시켰다.</li>
	<li>9일째에 6.3단계를 반복합니다. 세포를 10 μM DAPT로 보충된 MSCM의 15 mL에 재현탁시켰다.</li>
	<li>11일째에 6.3단계를 반복합니다. 그러나 세포를 20 ng / mL BDNF 및 10 ng / mL GDNF로 보충 된 MSCM 15 mL에 재현탁하십시오.</li>
	<li>14 일째에 모토 뉴런을 플랫폼에 뿌립니다.</li>
</ol>7. 생물 반응기에서 모토뉴런 응집체 시딩 (14 일째)
<ol><li>2 mg/mL 콜라겐 I과 마트리겔(800 μL의 콜라겐 혼합물 + 200 μL의 마트리겔을 1 mL의 최종 부피에 도달)의 4:1 겔 혼합물을 준비한다. 콜라겐 성분에 대해, 수반되는 중화제 (중화제에 콜라겐의 9:1 혼합)를 첨가하고, 혼합물을 1x PBS로 희석하여 800 μL의 최종 부피를 달성한다.</li>
	<li>400nm 세포 스트레이너를 사용하여 큰 신경 구체를 선택하고 젤 혼합물에 재현탁하십시오.</li>
	<li>저수지에서 배지를 흡인하고 신경권 우물에서 조심스럽게 흡인하십시오 (그림 2).</li>
	<li>15 μL의 겔 혼합물을 신경구 채널에 첨가한다.</li>
	<li>10 μL의 젤로 10 μL 피펫을 로딩한 다음 하나의 신경구를 선택하십시오.</li>
	<li>NS를 신경구 채널에 증착하고 NS가 챔버에 있는지 확인하십시오. NS가 증착되면 나머지 겔을 방출하면서 피펫을 천천히 올립니다. NS가 올바르게 침착되었는지 확실하지 않은 경우 현미경을 사용하여 위치를 확인하십시오.</li>
	<li>겔을 37°C에서 30분 동안 중합시키도록 허용한다.</li>
	<li>20 ng/mL BDNF 및 10 ng/mL GDNF로 보충된 NbActiv4 450 μL를 저수지에 첨가하십시오.</li>
	<li>NS에서 근육 조직으로의 축삭 성장을 허용하기 위해 격일로 배지를 변경하십시오.</li>
</ol>8. NMJ 기능의 동시 광학 자극 및 비디오 녹화 (24 +일)
<ol><li>이미징의 경우 과학적 상보성 금속 산화물 반도체(sCMOS) 카메라와 함께 반전 형광 현미경을 사용하십시오.</li>
	<li>카메라 소프트웨어 비닝을 2x2, 노출 20ms, 롤링 셔터 ON, 판독 속도 540MHz, 다이나믹 레인지: 12비트 및 게인 1, 센서 모드: 오버랩으로 설정합니다.</li>
	<li>현미경에서 2x 대물렌즈를 사용하여 미세 조직을 이미지화하십시오.</li>
	<li>라이브 셀 챔버(37°C, 5%CO2)를 현미경 스테이지에 부착한다.</li>
	<li>신경 골격 조직 조직을 포함하는 관심 영역(ROI)을 선택하여 파일 크기와 처리 시간을 최소화합니다.</li>
	<li>샘플과 이미징 대상 사이에 594nm 장역 방출 필터를 배치하여 카메라에서 청색광 펄스를 필터링합니다.</li>
	<li>4개의 생물반응기(24개 조직)가 들어있는 직사각형 4-웰 플레이트를 살아있는 세포 챔버에 넣는다.</li>
	<li>라이브 뷰를 클릭합니다. 원하는 ROI로 이미지를 중심에 맞추고 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>GitHub 폴더(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)에서 사용자 지정 매크로 코드를 업로드하여 스테이지 위치, Arduino 보드 및 비디오 수집을 제어합니다.</li>
	<li>출력 동영상을 day_tissue group_tissue name_experiment.nd2로 설정합니다.</li>
	<li>스테이지에서 원하는 X,Y 좌표를 설정하여 매크로 코드를 실행하고 50 프레임 / s에서 1700 프레임으로 빠른 시간 경과를 얻습니다.</li>
	<li>이미징 후 매체를 교체하고 샘플을 인큐베이터로 되돌립니다. 조직 피로를 피하기 위해 이미지 획득 세션 사이에 최소 24시간을 허용하십시오.</li>
</ol>9. 배치 처리 및 분석 (24 일 이상)
<ol><li>동영상 처리<ol>
<li>사용자 지정 MATLAB 코드를 사용하여 배치 분석에서 비디오를 처리합니다. GitHub 폴더(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)에서 파일을 다운로드할 수 있습니다. 이 기능은 표 2에 나열되고 설명되어 있습니다. 참고: 이 코드는 .nd2 및 .czi 형식과 호환됩니다. MATLAB에서 활성화하려면 병렬 처리가 필요하며 바이오 포맷 패키지가 필요합니다.</li>
		<li>재귀 OSAnalysis 스크립트를 실행하여 병렬 처리를 통해 동영상을 분석합니다. 획득 한 모든 비디오를 동일한 폴더에 넣고 코드를 실행할 때 해당 폴더를 선택하십시오.</li>
		<li>필요에 따라 사후 분석 매개변수를 조정합니다.<ol>
<li>녹음 시작 시 자발적인 수축이 포착되는 경우 기준선 시간 (옵션 1)을 변경합니다. 이렇게하면 0보다 큰 초기 판독 방법이 표시되며 보상하기 위해 프레임을 이동해야합니다.</li>
			<li>수축이 등록되지 않은 경우 peakThreshold (옵션 2)를 변경합니다. 이 코드는 기본적으로 가장 높은 피크의 25%를 초과하는 수축을 감지하여 이 값을 변경할 수 있도록 합니다.</li>
			<li>minMinProminence 및 minMinWidth를 변경하여 각 피크의 시작을 감지할 때 감도를 조정합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>비디오 및 그래프 출력을 생성합니다.<ol>
<li>recursiveOSMovie를 실행하여 각각의 수축성 추적이 있는 각 조직에 대한 비디오 파일을 생성합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>10. NMJ 기능의 교란 (24 일 이상)
<ol><li>20 ng/mL BDNF 및 10 ng/mL GDNF로 보충된 NbActiv4 기초 배지에 외부 이펙터를 추가하여 치료 배지를 준비하십시오.<ol>
<li>MG 혈청 실험을 위해, NbActiv4 + BDNF + GDNF에서 20% MG 환자 혈청을 사용하십시오.</li>
		<li>BTX 실험을 위해 NbActiv4 + BDNF + GDNF에서 5 μg/mL BTX를 사용하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3.2단계를 사용하여 자극/이미지. 베이스라인을 기록합니다.</li>
	<li>조직의 배지를 치료 배지 (450 μL / 조직)로 교체하십시오.</li>
	<li>원하는 시간 동안 인큐베이션한다 (환자 혈청의 경우 48 시간, BTX의 경우 20 분).</li>
	<li>3.2단계를 사용하여 다시 자극/이미지화합니다. 치료 후 기능을 기록합니다.</li>
	<li>치료 배지를 제거하고 조직이 원하는 시간 동안 쉬도록하십시오 (혈청 제거 후 48 시간) 참고 : 조직의 피로를 피하기 위해 자극과 이미징 사이에 최소 24 시간을 허용하십시오.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

이 시스템은 광유전학과 비디오 처리를 결합하여 NMJ 기능에 대한 자동화되고 편견없는 평가를 가능하게하는 엔지니어링 된 3D 인간 조직 모델입니다. 표준화 된 프로토콜을 사용하여 우리는 생리 발달 동안 NMJ 기능의 변화를 측정하고 신경 독소 노출 및 중증 근무력증 환자 혈청과 같은 병리학의 해로운 영향을 특성화하는 능력을 입증했습니다.
이전의 연구들은 MG 환자 혈청22를 사용하여 골격 근관과 공동 배양에서 광유전학적 hPSC 유래 모토뉴런으로 MG를 모델링하는 능력을 보고하였다. 그러나 시스템은 2D로 되어 무작위 위치에 수축을 기록하여 재현성을 제한하고 모델의 양적 능력을 저하시켰습니다. 2D 시스템에 비해 우리 시스템의 가장 큰 장점 중 하나는 3D 환경을 에뮬레이트하여 MN과 SkMs간에 세포 및 형태 학적 개발을보다 정확하게 용이하게한다는 것입니다. 조직이 고유 생리학처럼 행동하는 데 필요한 생체 역학적 단서가 3D 시스템<s...

신경 근육 접합부 (NMJ)는 근육 수축을 허용하는 모토 뉴런 (MN)과 골격근 세포 (SkM) 사이의 화학적 시냅스입니다. 독소, 예컨대 신경독소 α-분가로톡신 (BTX), 또는 중증 근무력증 (MG)과 같은 신경근 질환 (NMD)은 NMJ의 변성 및 근육 조절의 감소를 야기할 수 있다1. 생체 공학 인간 조직 모델은 인간 NMJ의 기능적 및 생리적 메커니즘을 더 잘 재구성하고 동물 모델보다 더 큰 번역 잠재력을 제공합니다.
동물 모델이 NMJ의 형성과 기능에 대한 이해를 향상 시켰지만, 인간과 동물의 시냅스 사이에는 결과의 번역을 제한하고 NMJ의 생체 내 특성화를 도전하는 2,3,4에 도전하는 상당한 차이가 있습니다. 연구에 따르면 마우스와 인간 NMJ 사이에 뚜렷한 생리적 차이가 나타났습니다. 마우스는 인간 NMJs4와 비교할 때 더 큰 NMJ와 더 작은 활성 영역밀도를 가지고 있습니다. 또한 동물 모델에서 수행 된 약물 연구가 인간 임상 시험에서 발견 된 효과를 항상 반영하는 것은 아닙니다. 조작 된 인간 조직 모델은 NMJ의 건강한 발달과 신경 근육 질환의 병리학을 연구하고 약물 검사를 허용 할 수있는 기회를 제공합니다. 인간 유도만능줄기세포(hiPSCs)5는 골격근세포(6,7) 및 모토뉴런(8,9)을 포함하는 다양한 세포 유형으로 분화될 수 있다. hiPSC는 환자 세포로부터 쉽게 생성될 수 있어, 환자 특이적 조직 모델을 통해 더 나은 질병 모델링(10) 및 약물 스크리닝(11,12)을 가능하게 한다.
SkMs와 MN의 2차원(2D) 단층 공동 배양은 생리학적 NMJ의 형태, 표현형, 조직 및 기능적 거동이 부족합니다. NMJ는 분석을 위한 운동 유닛의 분리를 억제하고, 정확한 기능 측정을 제한하며, 반복적이고 체계적인 실험에 대한 사용을 방해하는 2D 배양물에서 무작위로 형성됩니다.13 . NMJs의 3차원(3D) 조직 모델은 이러한 많은 한계를 극복하여, 생리학적 NMJs 7,14,15,16,17의 형태학적 및 기능적 특성을 되풀이한다. 이 모델을 사용하여 두 가지 조직 유형을 별도로 개발 한 다음 축삭 성장을 지시하여 통합하여 2D 배양 시스템에 비해 더 체계적인 NMJ를 개발할 수 있습니다.
우리의 이전 연구는 광유전학과 조직 공학을 결합하면 NMJ 기능18,19의 정확한 비 침습적 자극 및 평가를 가능하게한다는 것을 보여주었습니다. 유전 공학을 통해 빛에 민감한 단백질은 hiPSC의 게놈에 통합 될 수 있습니다. 청색광에 반응하여 열리는 이온 채널인 채널로돕신-2(ChR2)를 뉴런과 같은 흥분성 세포의 막으로 통합하면 세포 활성화20,21,22에 대한 비접촉식 시공간 조절이 가능하다. ChR2를 운반하는 hiPSC는 청색광에 민감한 광유전학적 모토뉴런으로 분화될 수 있어, 뉴런을 자극하는 전형적인 침습성 전극의 필요성을 제거하고 전극(23)에 의한 근육 세포의 원치 않는 자극을 피한다. 이 시스템은 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 비광유전학적 골격근 세포의 수축을 자극합니다. 비디오 획득과 제어된 청색광 조명을 결합하면 NMJ 기능을 위해 공동 배양된 조직을 동시에 자극하고 기록할 수 있습니다.
MG는 니코틴성 아세틸콜린 수용체 (AChR)를 표적화하는 자가항체에 의해 유발되며, 이는 NMJ 기능 감소 및 근육 약화24를 초래한다. 그것은 제시된 증상, 전기 진단 및 혈청 학적 혈액 검사를 통해자가 항체의 검출을 기반으로 진단됩니다. 그러나 MG에 관여하는 모든 자가항체가 확인된 것은 아니며, 일부 혈청음성 환자는 MG로 진단되지만25,26개의 항체가 인정되지 않았다. 우리의 시스템은 MG 환자로부터의 혈청의 첨가 전후에 NMJ의 반복적 인 기능적 평가를 허용하여 MG 항체18에 의해 야기 된 기능적 및 생화학 적 변화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 우리의 프로토콜은 NMJ 병리를 진단 및 조사하고 잠재적 인 치료제를 테스트하는 데 사용할 수있는 기능적 인간 NMJ의 시험관 내 모델을 생산하는 방법을 보여줍니다. 우리는 두 개의 플랫폼, 미세 유체 장치 및 더 큰 오픈 웰 생물 반응기 플랫폼에서 시스템의 다양성을 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SkMDC</td><td>Cook Myosite</td><td>P01059-14M</td><td></td></tr><tr><td>Media and Supplements</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12634-020</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민 용액</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>G-5 보충제 (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17503-012</td><td></td></tr><tr><td>유전성 항생제 (G418 황산염) (50 mg/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>인슐린, 재조합 인간</td><td>Millipore Sigma</td><td>91077C-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354277</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR Plus</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>100-0276</td><td></td></tr><tr><td>MyoTonic 성장 미디어 키트</td><td>쿡 Myosite</td><td>MK-4444</td><td></td></tr><tr><td>N-2 보충제</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NbActiv4 500 mL</td><td>BrainBits LLC</td><td>Nb4-500</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A 매체</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A13710-01</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2443</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>줄기세포 기술</td><td>5872</td><td></td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30 mm 케이지 큐브 시스템</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH, CP33, ER1-P4 및 ER2-P4</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; m 가역 여과기, 대형</td><td>줄기세포 기술</td><td>27250</td><td></td></tr><tr><td>546 nm 단역 여기 필터</td><td>Semrock</td><td>FF01-546/SP-25</td><td></td></tr><tr><td>573 nm 이색성 거울</td><td>Semrock</td><td>FF573-Di01&ndash; 25x36</td><td></td></tr><tr><td>594 nm 장역 통과 방출 필터</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>594 nm 장역 여기 필터</td><td>Semrock</td><td>BLP01-594R-25</td><td></td></tr><tr><td>파란색 (470nm) 반란군 LED on a SinkPAD-II 10mm 정사각형 베이스 - 65 lm @ 700mA</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-B4</td><td></td></tr><tr><td>Carclo 29.8&deg; 젖빛 10mm 원형 빔 광학 - 통합 다리</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>10413</td><td></td></tr><tr><td>Corning 60mm 초저 부착 문화 접시</td><td>Corning</td><td>3261</td><td></td></tr><tr><td>방열판</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>LPD-19-10B</td><td></td></tr><tr><td>Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 400 &micro; m, 25 팩, 멸균</td><td>PluriSelect</td><td>43-50400-03</td><td></td></tr><tr><td>pluriStrainer 500 &micro; m, 25 팩, 멸균</td><td>PluriSelect</td><td>43-50500-03</td><td></td></tr><tr><td>Red (627nm) Rebel LED on a SinkPAD-II 10mm 정사각형 베이스 - 65 lm @ 700mA</td><td>LuxeonStarLEDs</td><td>SP-05-R5</td><td></td></tr><tr><td>링 작동식 아이리스 다이어프램</td><td>ThorLabs</td><td>SM1D12D</td><td></td></tr><tr><td>T-Cube LED 드라이버</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B, KPS101</td><td></td></tr><tr><td>Molds</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>여성 나사식 육각 스탠드오프,&nbsp; 3 1/2" 10-32, 부분적으로 나사가 달린 1/2"</td><td>McMaster</td><td>91920A046</td><td></td></tr><tr><td>저프로필&nbsp; C-클램프</td><td>McMaster</td><td>1705A12</td><td></td></tr><tr><td>Growth Factors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenosine 3&prime;,5&prime;-cyclic monophosphate</td><td>Millipore Sigma</td><td>A9501-1G</td><td></td></tr><tr><td>CHIR 99021, 10 mg</td><td>Tocris</td><td>4423/10</td><td></td></tr><tr><td>DAPT 10 mg</td><td>R& D 시스템</td><td>2634/10</td><td></td></tr><tr><td>인간 CNTF, 연구 등급, 5 &마이크로; g</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-096-336</td><td></td></tr><tr><td>인간 Vitronectin 단백질, CF</td><td>R & D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>인간 Vitronectin 단백질, CF</td><td>R & D Systems</td><td>2349-VN-100</td><td></td></tr><tr><td>IGF1 재조합 인간 단백질</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>PHG0078</td><td></td></tr><tr><td>라미닌 마우스 단백질, 천연</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 Agrin 단백질</td><td>R& D 시스템</td><td>6624-AG-050</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 GDNF 단백질, CF 50ug</td><td>R& D 시스템</td><td>212-GD-050/CF</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간 신경 영양 3&nbsp; 100 ug</td><td>Cell Sciences</td><td>CRN500D</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human Neurotrophin-4</td><td>Cell Sciences</td><td>CRN501B</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human Sonic Hedgehog/SHH (C24II) N-Terminus</td><td>R& D Systems</td><td>1845-SH-100</td><td></td></tr><tr><td>재조합 인간/쥐/쥐 BDNF 50 ug</td><td>Peprotech</td><td>450-02</td><td></td></tr><tr><td>레티노산, 50mg</td><td>Millipore</td><td>Sigma R2625-50</td><td></td></tr><tr><td>SAG 평활화 작용제</td><td>Millipore Sigma</td><td>566660</td><td></td></tr><tr><td>SB431542 10mg</td><td>줄기세포 기술</td><td>72234</td><td></td></tr><tr><td>StemMACS LDN-193189</td><td>Miltenyl Biotec</td><td>130-103-925</td><td></td></tr><tr><td>인간 플라즈마에서 추출한 비트로넥틴</td><td>Millipore Sigma</td><td>V8379-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 디하이드로클로라이드</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>Antibodies</td>&alpha<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>;-actinin mAb (Mouse IgG1)</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td></td></tr><tr><td>콜린 아세틸전이효소 (ChAT) (염소)</td><td>Millipore</td><td>AB144P</td><td></td></tr><tr><td>Desmin mAb (마우스 IgG1)</td><td>Dako</td><td>M076029-2</td><td></td></tr><tr><td>Myosin Heavy Chain (MHC) (마우스 IgG2b)</td><td>DSHB</td><td>MF20</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino Uno R3</td><td>Arduino</td><td>A000066</td><td></td></tr><tr><td>Automated stage</td><td>Applied scientific instrumentation</td><td>MS-2000 XYZ</td><td></td></tr><tr><td>팽창 플라즈마 세정</td>기 <td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001&nbsp;( 115V)</td><td></td></tr> <tr><td>Invitrogen Countess 자동화 세포 카운터</td><td>원수 과학</td><td>I-CACC</td><td></td></tr><tr><td>IX-81 도립 형광 현미경</td><td>올림푸스</td><td>IX-ILL100LH</td><td></td></tr><tr><td>시리즈 스테이지 상단 인큐베이터 시스템</td><td>Tokai Hit</td><td>STX TOKAI-HIT-STXG</td><td></td></tr><tr><td>Zyla 4.2 sCOMS 카메라 Andor</td><td>Technology</td><td>ZYLA-4.2P-CL10</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arduino 소프트웨어(IDE)</td><td>Arduino</td><td>IDE 1.8.19</td><td></td></tr><tr><td>Mastercam</td><td></td><td>Mastercam for Solidworks</td><td></td></tr><tr><td>Matlab Matlab</td><td>R2021b</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS 요소</td><td>Nikon</td><td>Basic Research</td><td></td></tr><tr><td>Solidworks 3D CAD</td><td>Solidworks</td><td>Solidworks Standard</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화

Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction

중증 근무력증 (MG)과 같은 많은 신경 근육 질환은 동물과 인간 사이의 생리적 차이로 인해 동물 모델에서 특성화하기가 어려운 신경 근육 접합부 (NMJ)의 기능 장애와 관련이 있습니다. 조직 공학은 NMJ 병리를 진단 및 조사하고 잠재적 치료제를 테스트하는 데 사용할 수있는 기능적 인간 NMJ의 시험관 내 모델을 제공 할 수있는 기회를 제공합니다. 광유전학 단백질을 유도만능줄기세포(iPSCs)에 통합함으로써, 우리는 특정 파장의 빛으로 자극될 수 있는 뉴런을 생성했다. NMJ가 건강하고 기능적이라면, 모토뉴론으로부터의 신경화학적 신호는 근육 수축을 초래한다. 광유전학과 미세 제작을 조직 공학과 통합함으로써 우리는 비디오 분석을 사용하여 NMJ 기능을 특성화하기위한 편견없는 자동화 된 방법론을 수립했습니다. NMJ 형성, 동시 비디오 녹화를 통한 광학 자극 및 조직 수축성의 비디오 분석을 위해 표준화 된 프로토콜이 개발되었습니다. 골격근 수축을 유도하기 위해 빛에 의한 광유전학적 모토뉴런의 자극은 인간 NMJ 생리학을 되풀이하고 시간에 따라 그리고 다양한 입력에 반응하여 NMJ의 반복적인 기능적 측정을 허용한다. 우리는 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결의 기능적 개선을 보여주고 NMJ 기능에 대한 환자 MG 항체 또는 신경 독소의 손상 효과를 특성화하는 이 플랫폼의 능력을 입증합니다.

신경근 접합은 광유전학적 hiPSC 유래 모토뉴런을 비광유전학적 골격근 조직과 공동배양함으로써 생성되었다. 인간 일차 골격 근모세포(SkM)를 플랫폼 내로 시딩하고, 2주 프로토콜을 사용하여 다핵 근관으로 분화시켰다. 광유전학적 모토뉴런은 별도로 분화하되, 근관 분화와 병행하여, 플랫폼 내로 시딩하였다(도 1). 조직은 MN 시딩 후 7-12 일 후에 청색광 자극에 반응하여 수축하기 시작하여 NMJ의 성공적인 발달 및 성숙을 나타냅니다. NMJ는 모토네론 시딩 후 최대 40일 동안 배양, 자극 및 영상화될 수 있지만, 최적의 시점은 16일째19일에 발생한다. 광유전학적 단백질의 분화 및 존재에 대한 형태학적 및 생화학적 검증은 보충 도 1에 나타나 있으며 이전 연구18,19에서 검증되었다.
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우리는 인간 공학 골격근 조직과 광유전학적 모토뉴런을 사용하여 신경근 접합 기능을 특성화하기 위한 재현 가능하고 자동화되고 편향되지 않은 이미징 시스템을 설명합니다. 이 시스템은 시간이 지남에 따라 신경 근육 연결성의 기능적 정량화를 허용하고 신경 독소 및 중증 근무력증 환자 혈청으로 인한 감소 된 신경 근육 기능을 감지합니다.

Many neuromuscular diseases, such as myasthenia gravis (MG), are associated with dysfunction of the neuromuscular junction (NMJ), which is difficult to ...

이 프로토콜은 신경근 병리를 조사하고 잠재적 치료제를 테스트하는 데 사용할 수 있는 기능적 3D 시험관내 인간 신경근 접합부를 엔지니어링하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 동시에 광유전학적 자극과 비디오 처리를 사용한다. 그것은 발달 중 및 중증 근무력증 환자의 신경 독소 및 혈청과 같은 외부 요인으로 인해 신경 근육 접합 기능의 변화를 정량화합니다.근육 세포 및 운동 뉴런이 생물 반응기에 시딩되는 단계는 처음에는 어려울 수 있습니다. 콜라겐 겔 혼합물을 얼음 위에 유지하면 겔이 응고되기 전에 모든 세포를 시드하는 데 사용할 수 있는 시간을 연장하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 폴리디메틸실록산 또는 PDMS의 경화제 혼합물에 10 대 1 염기를 혼합하고, 혼합물을 진공 챔버에 넣는다.모든 밸브를 닫고 진공을 켜서 기포가 남지 않을 때까지 적어도 30 분 동안 혼합물을 탈기하십시오. 혼합물을 몰드에 붓고 진공 챔버에서 1 시간 동안 금형을 탈기 한 다음 금형의 상단 절반을 올바른 방향으로 닫습니다. 육각형 강철 막대를 중앙에 놓고 양쪽에 클램프를 놓습니다.다음으로, 상단을 PDMS로 다시 채우고 금형을 섭씨 65도 오븐에서 최소 4 시간 동안 경화시킵니다. 금형이 실온으로 냉각 된 후 금형에서 플랫폼을 제거하십시오. 한편, 유리 커버가 1 % 비이온성 계면 활성제 폴리올에서 30 분 동안 미끄러 져 커버 슬립이 쌓이지 않고 모두 제대로 코팅되도록한 다음 증류수로 잘 헹구고 섭씨 65도에서 밤새 건조시킵니다.유리 커버 슬립 및 PDMS 플랫폼을 높은 곳에서 플라즈마 클리너를 사용하여 분당 6 리터의 산소로 1 ~ 2 분 동안 처리하십시오. 일단 처리되면, PDMS를 적어도 30초 동안 커버 슬립 상에 아래로 눌러서 둘을 함께 결합시킨다. 밀리리터 당 3 밀리그램의 콜라겐 1 및 가용화된 기저막 매트릭스의 4-to-1 믹스를 준비한 다음, 이 갓 제조된 콜라겐 혼합물에 근아세포를 재현탁시켰다.다음으로,이 세포 콜라겐 현탁액 15 마이크로 리터를 생물 반응기의 각 근육 챔버에 첨가하고, 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 두 기둥 전체에 걸쳐 확산시킵니다. 세포 겔 혼합물이 섭씨 37도에서 30분 동안 중합되도록 허용한 다음, 각 생물반응기 웰을 450 마이크로리터의 근긴장성 성장 배지로 채운다. motoneuron 분화의 11 일째에, 세포와 배지를 50 밀리리터 튜브로 옮기고 신경 구가 5 분 동안 바닥에 정착하도록하십시오.상청액을 흡인하고 세포를 뇌 유래 신경영양 인자 밀리리터당 20 나노그램 및 신경교세포 유래 신경영양 인자 밀리리터당 10 나노그램으로 보충된 모토뉴론 현탁액 배양 배지 15 밀리리터에 재현탁시킨다. 분화 프로토콜의 14일째에, 모토뉴런을 플랫폼에 시드한다. 가용화된 기저막 매트릭스 1 및 가용화된 콜라겐 1 당 2 밀리그램의 4-to-1 겔 혼합물을 제조한다.400 나노 미터 세포 스트레이너를 사용하여 큰 신경 구를 선택하고 준비된 젤 혼합물에 재현탁하십시오. 저장소와 신경 영역 우물에서 조심스럽게 배지를 흡인 한 다음 15 마이크로 리터의 젤 혼합물을 신경 영역 채널에 첨가하십시오. 10 마이크로 리터의 젤로 10 마이크로 리터 피펫을로드하고 하나의 신경 구를 선택하십시오.신경 구체를 신경 영역 채널에 증착하여 챔버에 있는지 확인한 다음 신경 영역이 침착되면 나머지 젤을 방출하면서 천천히 피펫을 들어 올립니다. 겔이 섭씨 37도에서 30 분 동안 중합되도록 한 다음 뇌 유래 신경 영양 인자 밀리리터 당 20 나노 그램과 아교 세포 유래 신경 영양 인자 밀리리터 당 10 나노 그램으로 보충 된 NbActiv4 450 마이크로 리터를 저장소에 첨가하십시오. 이미징의 경우 과학적 상보성 금속 산화물 반도체 카메라 소프트웨어와 함께 반전 형광 현미경을 사용하십시오.비닝을 2x2, 노출 20밀리초, 롤링 셔터 켜기, 판독 속도를 540메가헤르츠, 동적 범위를 12비트, 게인 1 및 센서 모드를 겹치도록 설정합니다. 현미경에 2x 대물을 사용하여 미세 조직을 이미지화하고 현미경 단계에 살아있는 세포 챔버를 부착하십시오. 파일 크기와 처리 시간을 최소화하기 위해 신경질화된 골격 조직이 포함된 관심 영역을 선택한 다음, 샘플과 이미징 대상 사이에 594나노미터 길이의 통과 방출 필터를 배치하여 카메라에서 청색광 펄스를 필터링합니다.다음으로, 4개의 생물반응기가 들어있는 직사각형 4-웰 플레이트를 라이브 셀 챔버에 넣은 다음, 라이브 뷰를 클릭하고 중앙을 클릭하고 원하는 ROI로 이미지를 집중시킵니다. GitHub 폴더에서 사용자 지정 매크로 코드를 다운로드하여 스테이지 위치, Arduino 보드 및 비디오 획득을 제어한 다음 출력 동영상을 일 밑줄 조직 그룹 밑줄 조직 이름 밑줄 실험 점 ND2로 설정합니다. 스테이지에서 원하는 X 및 Y 좌표를 설정한 매크로 코드를 실행하고 초당 50프레임에서 1700프레임으로 빠른 시간 경과를 얻습니다.이미징 후 매체를 교체하고 샘플을 인큐베이터로 되돌립니다. 조직 피로를 피하기 위해 이미지 수집 세션 사이에 최소 24 시간을 허용하십시오. 동영상 처리의 경우 GitHub 폴더에서 파일을 다운로드하고 사용자 지정 MATLAB 코드를 사용하여 배치 분석에서 비디오를 처리합니다.재귀 OS 분석 스크립트를 열어 획득한 모든 비디오를 동일한 폴더에 저장합니다. 사전 분석 매개 변수를 조정하고 재귀 OSAnalysis 스크립트를 실행하여 병렬 처리를 통해 동영상을 분석합니다. 필요에 따라 기준선 시간, 피크 임계값, 최소-분 두드러기 및 최소-분 너비와 같은 사후 분석 매개 변수를 조정합니다.마지막으로, 재귀 OSMovie를 실행하여 비디오 및 그래프 출력을 생성하여 각각의 수축성 추적을 가진 각 조직에 대한 비디오 파일을 생성합니다. 이 프로토콜은 서로 다른 스케일을 가진 두 개의 시스템, 약 20, 000개의 근모세포로 구성된 1밀리미터 길이의 골격근 조직을 산출하는 미세유체 장치 및 약 450개의 근모세포를 포함하는 4밀리미터 길이의 근육 조직을 생성하는 오픈 웰 생물반응기 시스템을 사용하여 테스트되었습니다. 청색광으로 모토뉴런의 제어된 자극을 허용하도록 광학 셋업이 구축되었으며, NMJ 기능은 커스텀 아두이노 코드와 짝을 이룬 커스텀 현미경 매크로 스크립트를 사용하여 상승되었다.이 코드에는 조정 가능한 조정 가능한 매개 변수가 포함되어 있으며 광 펄스와 수축성 피크의 시작 사이의 시간을 기반으로 수축이 트리거되는지 여부를 결정합니다. 이 시스템은 조직 제작 후 일주일 후에 촉발된 반응의 증가를 나타내는 조직에서 NMJ 기능의 개선을 포착하고, 이어서 추가 일주일 동안 안정한 기능을 가졌다. 알파-분가로톡신은 모든 촉발되고 자발적인 수축을 멈추게 하여 NMJ 기능을 완전히 중단시켰으며, 이는 조직의 가벼운 자극이 기능적 NMJ를 필요로 한다는 것을 입증한다.20%중증 근무력증 혈청을 48시간 동안 처리한 조직을 분석한 결과, 건강한 기증자로부터 혈청을 처리한 대조군 조직에 비해 기능이 감소한 것으로 나타났다. 혈청을 제거하고 세척한 지 48시간 후, 조작된 NMJs는 기능의 회복을 보여주었다. 배치 사이의 강성 변동성을 피하기 위해 모든 생물 반응기가 동일한 시간 동안 오븐에 있는지 확인하십시오.또한 현미경을 사용하여 운동 뉴런 시딩을 확인하십시오. 이 절차에 따라, 메타발로믹스, 프로테오믹스 및 CRISPR 스크리닝을 수행하여 추가 정보를 수집하고 병든 혈청으로 인한 기계론적 변화를 더 잘 이해할 수 있습니다.

engineering-characterization-an-optogenetic-model-human-neuromuscular

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오는 미세유체 장치를 사용하여 신경근 접합부의 형성을 보여줍니다. 신경 전구 세포와 근육 전구 세포는 장치 내의 다른 웰에 파종되고 각각 운동 뉴런과 근관으로 성숙하도록 방치됩니다. 부피와 화학적 구배의 생성은 활성 신경근 접합부의 발달로 이어집니다.

미세유체 소자(microfluidic device)를 이용한 신경근접합부 생성

이 동영상은 기능적 신경근 접합부를 평가하는 방법을 보여줍니다. 근육 조직과 운동 뉴런을 포함하는 생물반응기와 형광 현미경을 사용하여 뉴런의 빛에 민감한 채널을 자극하여 전기 신호를 생성하여 근섬유 수축을 일으킵니다.

동시 광 자극 및 비디오 녹화를 통한 기능적 신경근 접합부 평가

출처: Marinello, M., et al. 결합된 공초점 현미경과 초고해상도 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부의 특성화. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 시냅스 전 및 시냅스 후 구조를 시각화하고 분석하기 위해 공초점 및 초고해상도 현미경을 사용하여 쥐 근육 조직의 신경근 접합부의 준비, 면역염색 및 이미징을 보여줍니다.

결합된 공초점 현미경과 초고해상도 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부의 특성화

신경 근육 학 교차로 (NMJ)의 기능 평가 근육과 신경 사이 통신에 필수 정보를 제공할 수 있습니다. 여기는 포괄적으로 두 개의 서로 다른 근육-신경 준비, 즉 soleus 좌 골 인할지 다이어 프 램을 사용 하 여 NMJ 및 근육 기능을 평가 하는 프로토콜에 설명 합니다.

신경 근육 학 교차로 기능을 측정

여기서 우리는 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 시험관 내 NMJs를 생성하는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 단일 우물에서 1 개월에 성숙한 형태와 기능을 가진 NMJs를 유도할 수 있다. 결과 NMJs 잠재적으로 관련 질병을 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다., 병리학 메커니즘을 공부 하거나 치료에 대 한 약물 화합물을 검사.

인체 유발 만능 줄기 세포에서 유도 된 체외 신경 근육 정션

신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

당사는 인간 원발성 메소포스트 유래 근투와 인간 유도만능 줄기 세포 유래 모터 뉴런을 공동 배양하여 상업적으로 이용 가능한 미세유체 장치에서 인간 모터 유닛을 생성하는 방법을 설명하며, 이로 인해 기능적으로 활성 신경 근육 접합이 형성된다.

미세 유체 장치에서 기능성 신경 근육 접합을 갖춘 인간 모터 유닛 생성

이 프로토콜은 SMA 및 ColQ 관련 CMS의 마우스 모델에서 병리학 적 변화를 정량화하는 데 사용되는 컨 포칼 및 STED 현미경을 결합하여 신경근 접합부의 형태 측정 분석 방법을 설명합니다.

결합된 공초점 및 초분해능 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부 특성 분석

상기 프로토콜은 상이한 바이오마커, 즉, 뉴로필라멘트 200, 수포성 아세틸콜린 수송체, 알파-분가로톡신 및 S100을 갖는 형광 면역조직화학을 사용하여 래트 내측 위장관근에서 시냅스 전 말단, 시냅스 후 수용체, 및 시냅스 주변 슈완 세포 사이의 공간적 상관관계를 조사하는 방법을 나타낸다.

쥐 내측 위장근에서 신경근 접합부의 형태학적 특성 시각화

이 연구에서는 설치류 모델에서 신경근 접합부(NMJ) 전달의 생체 내 측정을 가능하게 하는 정교한 단일 섬유 근전도(SFEMG) 프로토콜을 시연합니다. 쥐 비복근의 NMJ 전달 변동성 및 실패를 정량화할 수 있도록 SFEMG 기술에 대한 단계별 접근 방식이 설명되어 있습니다.

설치류 모델에서 신경근 접합 전달을 평가하기 위한 자극 단일 섬유 근전도(SFEMG)

여기에서는 두개골 거근 장뇨근(LAL)의 생체 내 전기천공법(in vivo electroporation)과 탈질법(denervation)을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차를 통해 신경근 시냅스의 재생에서 근육 유래 단백질의 잠재적 역할을 연구할 수 있습니다.

In Vivo Electroporation과 Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle의 단기 신경 재생이 결합되었습니다.

학습하세요 광유전학 자극과 영상 처리를 이용한 3D 인간 신경근 접합부 공학 방법을. 이 기술은 중증근무력증 환자 혈청과 신경독소의 영향을 정량화하여 신경근 병리 연구와 치료제 테스트에 활용됩니다.

인간 신경근 접합부의 광유전학 모델의 공학 및 특성화

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