Name: 치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: 학습하세요 HBV 진입 억제제를 선별하는 방법을 배우세요. 성숙 간세포에서 NTCP 결합을 차단하여 바이러스 감염을 예방하는 약물 효능을 평가하는 기술입니다.

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이 연구 프로젝트는 Mahidol University와 태국 과학 연구 및 혁신 (TSRI)이 A. Wongkajornsilp 및 K. Sa-ngiamsuntorn에게 별도로 수여합니다. 이 작업은 경쟁력을위한 프로그램 관리 단위 (보조금 번호 C10F630093)를 통해 국가 고등 교육 과학 연구 및 혁신 정책위원회 사무국에서 재정적으로 지원했습니다. A. Wongkajornsilp는 Mahidol University의 Faculty of Medicine Siriraj Hospital의 Chalermprakiat 보조금을 받았습니다. 저자는 ITC 기술에 대한 그녀의 도움에 대해 Sawinee Seemakhan (Mahidol University 과학 학부 약물 발견 우수 센터)에게 감사드립니다.

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<li>Watashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+and+its+analogs+inhibit+hepatitis+B+virus+entry+into+cultured+hepatocytes+through+targeting+a+membrane+transporter%2C+sodium+taurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP).</a> Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).</li>
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<li>Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tools+to+evaluate+the+conformation+of+protein+products%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Tools to evaluate the conformation of protein products.</a> Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).</li>
<li>Martinez Molina, D., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+thermal+shift+assay%3A+a+novel+biophysical+assay+for+in+situ+drug+target+engagement+and+mechanistic+biomarker+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pharmacology+and+Toxicology%22%5BJournal%5D)">The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies.</a> Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).</li>
<li>Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-Glycosylation+of+the+Na%2B-taurocholate+cotransporting+polypeptide+%28NTCP%29+determines+its+trafficking+and+stability+and+is+required+for+hepatitis+B+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection.</a> PLoS One. 12 (1), 0170419(2017).</li>
<li>Tsukuda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+class+of+hepatitis+B+and+D+virus+entry+inhibitors%2C+proanthocyanidin+and+its+analogs%2C+that+directly+act+on+the+viral+large+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins.</a> Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).</li>
<li>Klumpp, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+crystal+structure+of+a+hepatitis+B+virus+replication+inhibitor+bound+to+the+viral+core+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).</li>
<li>Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+the+inhibition+of+NTCP+by+myrcludex+B%5BTitle%5D)+AND+%22JHEP+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B.</a> JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).</li>
<li>Saso, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+strategy+to+identify+hepatitis+B+virus+entry+inhibitors+by+AlphaScreen+technology+targeting+the+envelope-receptor+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).</li>
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</ol>

저자는 잠재적 인 이해 상충으로 해석 될 수있는 상업적 또는 재정적 관계가없는 상태에서 연구가 수행되었다고 선언합니다.

HBV 감염은 간세포25 상의 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPGs)에 대한 낮은 친화도 결합을 통해 시작되고, 이어서 엔도 사이토 시스26을 통한 후속 내재화와 함께 NTCP에 결합한다. NTCP는 HBV 진입에 중요한 수용체이기 때문에 HBV 진입을 표적으로 하는 것은 임상적으로 번역되어 de novo 감염, 모자 간 전염(MTCT) 및 간 이식 후 재발을 감소시킬 수 있습니다. 바이러스 유입을 차단하는 것은 만성 HBV 감염에 대한 실행 가능한 대체 치료법이 될 것입니다.
위에서 언급한 프로토콜의 몇 가지 중요한 단계가 여기에 요약되어 있습니다. 숙주 세포를 준비하는 동안 2% DMSO로 성숙 배지를 추가하기 전에 간세포가 100% 컨플루언시에 도달하는지 확인하십시오. 2 % DMSO에서 서브 컨플루언트 간세포를 배양하면 세포 사멸 및 박리가 발생합니다. 성숙 기간은 ...

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 전 세계적으로 생명을 위협하는 질병으로 간주됩니다. 만성 HBV 감염은 간경변 및 간세포 암종1의 위험이 있습니다. 현재의 항 HBV 치료는 주로 핵 (t) ide 유사체 (NA) 및 인터페론 알파 (IFN-α)2,3를 사용한 바이러스 후 진입에 중점을 둡니다. HBV 진입 억제제 인 Myrcludex B의 발견은 항 HBV 제제4에 대한 새로운 표적을 확인했습니다. 만성 HBV에서 진입 억제제와 NA의 조합은 바이러스복제 단독을 표적으로 하는 것에 비해 바이러스 부하를 유의하게 감소시켰습니다5,6. 그러나, HBV 진입 억제제의 스크리닝을위한 고전적인 간세포 모델은 낮은 바이러스 수용체 수준 (나트륨 타우로 콜레이트 공동 수송 폴리펩티드, NTCP)에 의해 제한된다. 간암 세포(즉, HepG2 및 Huh7)에서 hNTCP의 과발현은 HBV 감염성을 개선합니다 7,8. 그럼에도 불구하고, 이들 세포주는 낮은 수준의 I 및 II 상 약물 대사 효소를 발현하고 유전 적 불안정성을 나타낸다9. 전바이러스 진입, NTCP 결합 및 바이러스 진입과 같은 후보 항-HBV 화합물의 뚜렷한 메커니즘을 표적으로 하는 데 도움이 될 수 있는 간세포 모델은 효과적인 조합 요법의 식별 및 개발을 촉진할 것입니다. 커큐민의 항 HBV 활성에 대한 연구는 바이러스 진입 중단 후 새로운 메커니즘으로서 바이러스 진입 억제를 해명했습니다. 이 프로토콜은 항-HBV 진입 분자10의 스크리닝을 위한 숙주 모델을 상세히 설명한다.
이 방법의 목표는 바이러스 진입 억제, 특히 NTCP 결합 및 수송 차단을 위한 후보 항-HBV 화합물을 탐색하는 것입니다. NTCP 발현은 HBV 진입 및 감염에 중요한 요소이므로 NTCP 수준11을 최대화하기 위해 간세포 성숙 프로토콜을 최적화했습니다. 또한, 이 프로토콜은 HBV 진입에 대한 억제 효과를 HBV 부착의 억제 대 내재화의 억제로서 구별할 수 있다. 타우로 콜산 (TCA) 흡수 분석은 또한 NTCP 수송12,13을 나타 내기 위해 방사성 동위 원소 대신 ELISA 기반 방법을 사용하여 변형되었습니다. 수용체와 리간드 상호작용은 이들의 3D 구조14,15에 의해 확인되었다. NTCP 기능의 억제는 TCA 흡수 활성(16)을 측정함으로써 평가할 수 있다. 그러나, 이 기술은 후보 억제제에 대한 NTCP 결합의 직접적인 증거를 제공하지 않았다. 따라서, 결합은 다양한 기술, 예컨대 표면 플라즈몬 공명(17), ELISA, 형광-기반 열 이동 분석(FTSA)18, FRET19, 알파스크린(AlphaScreen) 및 다양한 다른 방법(20)을 사용하여 조사될 수 있다. 이들 기술 중에서, ITC는 거의 모든 반응에서 열 흡수 또는 방출을 관찰할 수 있기 때문에 결합 분석의 목표 표준이다(21). NTCP와 후보 화합물의 결합 친화도(KD)는 ITC를 사용하여 직접 평가되었습니다. 이들 친화도 값은 In Silico 예측 모델22를 사용하여 수득된 값보다 더 정확하였다.
이 프로토콜은 간세포 성숙, HBV 감염 및 HBV 진입 억제제 스크리닝 기술을 다룹니다. 간단히 말해서, 간세포 모델은 imHC 및 HepaRG 세포주를 기반으로 개발되었습니다. 배양된 세포는 2주 이내에 성숙한 간세포로 분화되었다. NTCP 수준의 상향 조절은 real-time PCR, 웨스턴 블롯 및 유세포분석11을 사용하여 검출하였다. B형 간염 비리온(HBVcc)을 생산하고 HepG2.2.15로부터 수집하였다. 분화된 imHC 또는 HepaRG (d-imHC, d-HepaRG)를 HBV 비리온으로 접종하기 2시간 전에 항-HBV 후보로 예방적으로 처리하였다. 실험의 예상 결과는 세포 HBV와 감염성을 감소시키는 약제의 확인이었습니다. 항-NTCP 활성은 TCA 흡수 분석을 사용하여 평가하였다. NTCP 활동은 NTCP를 구체적으로 바인딩한 에이전트에 의해 억제될 수 있습니다. ITC 기술은 억제제 및 그의 표적 단백질을 예측할 수 있는 상호작용적 결합의 타당성을 조사하기 위해 사용되었고, 생체분자 복합체23,24의 비공유 상호작용을 통해 수용체에 대한 리간드의 결합 친화도(KD)를 결정하였다. 예를 들어, KD≥ 1 × 103 mM은 약한 결합을 나타내고, KD≥ 1 ×10 6 μM은 중간 결합을 나타내고, KD≤ 1 × 109 nM은 강한 결합을 나타낸다. ΔG는 결합 상호 작용과 직접적인 상관 관계가 있습니다. 특히, 음성 ΔG와의 반응은 exergonic 반응이며, 이는 결합이 자발적인 과정임을 나타낸다. 음의 ΔH를 갖는 반응은 결합 과정이 수소 결합과 반 데르 발스 힘에 의존한다는 것을 나타낸다. TCA 섭취 및 ITC 데이터 모두 항 HBV 진입 제제를 선별하는 데 사용될 수 있습니다. 이러한 프로토콜의 결과는 항 HBV 스크리닝뿐만 아니라 결합 친화도 및 수송 기능을 통해 평가되는 NTCP와의 상호 작용을위한 기초를 제공 할 수 있습니다. 이 논문은 숙주 세포 준비 및 특성화, 실험 설계 및 NTCP 결합 친화도와 함께 항 -HBV 항목의 평가에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>세포주</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HepaRG 세포, 동결</td>보존된 <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>HPRGC10</td><td></td></tr><tr><td>Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell Line</td><td>Merck</td><td>SCC249</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformadehyde Phosphate Buffer Solution</td><td>FUJIFLIM Wako 화학</td><td>물질 163-20145</td><td></td></tr><tr><td>BD 펌/워시 버퍼</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>펌/워시 버퍼</td></tr><tr><td>사이클로스포린 A</td><td>abcam</td><td>59865-13-3</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td>8 mM</td></tr><tr><td>G 418 디설페이트 솔</td>트 <td>Merck</td><td>108321-42-2</td><td></td></tr><tr><td>Halt 프로테아제 억제제 칵테일&nbsp; EDTA 무함유(100x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>78425</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Merck</td><td>7365-45-9</td><td></td></tr><tr><td>illustraTM RNAspin Mini RNA 분리 키트</td><td>GE Healthcare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>illustra RNAspin Mini RNA 분리 키트</td><td>GE Healthcare</td><td>25-0500-71</td><td></td></tr><tr><td>ImProm-II 역전사 시스템</td><td>Promega</td><td>A3800</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST qPCR 키트</td>, <td>Kapa Biosystems</td><td>KK4600</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 농축기</td>, <td>Takara bio</td><td>PT4421-2</td><td>농축기</td></tr>, <tr><td>Luminata crescendo, Western HRP 기질</td>, <td>Merck</td><td>WBLUR0100</td><td></td></tr><tr><td>마스터 믹스(2개), Universal</td><td>Kapa Biosystems</td><td>KK4600</td><td></td></tr>, <tr><td>뉴클레오스핀 DNA 추출 키트</td>, <td>macherey-nagel</td><td>1806/003</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수</td><td>Merck</td><td>P3813</td><td></td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜 8000</td><td>Merck</td><td>25322-68-3</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>재조합 NTCP</td><td>Cloud-Clone</td><td>RPE421Hu02</td><td></td></tr><tr><td>RIPA 용해 버퍼(10x)</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td></td></tr><tr><td>TCA</td><td>Sigma</td><td>345909-26-4</td><td></td></tr><tr><td>TCA Elisa 키트</td><td>Mybiosource</td><td>MB2033685</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>9036-19-5</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>0.125%로 희석</td></tr><tr><td>항체</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 항-NTCP1 항체</td><td>Abcam</td><td>ab131084</td><td>1:100 희석</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 항-GAPDH 항체</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM4300</td><td>1:200,000 희석&</td></tr><tr><td>nbsp; &nbsp; HRP-conjugated goat anti-rabbit anti-rabbit 항체</td><td>Abcam</td><td>ab205718</td><td>1:10,000 희석</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; HRP 염소 항-마우스 2차 항체</td><td>Abcam</td><td>ab97023</td><td>1:10,000 희석</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; 염소 항-토끼 IgG 2차 항체, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td>1:500 희석</td></tr><tr><td>시약 구성</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&deg; 항체 희석 완충액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1배 TBST</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3% BSA</td><td>시그마</td><td>A7906-100G</td><td>작업 농도: 3%</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 나트륨 아지드</td><td>시그마</td><td>199931</td><td>작업 농도: 0.05%</td></tr><tr><td><강>간세포 성장 매체</강></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; DME/F12</td><td>Gibco</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% FBS</td><td>시그마 알드리치</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% 펜/스트렙</td><td>HyClon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Hepatic maturation medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 윌리엄스의 E 매체</td><td>시그마 알드리치</td><td>W4125-1L</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10% FBS</td><td>시그마 알드리치</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% 펜/스트렙</td><td>HyClon</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1% 글루타맥스</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 5 &마이크로; g/mL&nbsp; 인슐린</td><td>시그마 Aldrich</td><td>91077C-100MG&</td><td></td></tr><tr><td>nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 50 &마이크로; M 하이드로코티손</td><td>시그마 알드리치</td><td>H0888-1g</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 2% DMSO</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A3672-250ml</td><td></td></tr><tr><td>IF 차단 솔루션</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1x PBS</td><td>기브코</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 3% BSA</td><td>시그마</td><td>A7906-100G</td><td>작업 농도: 3%</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0.2% Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>작업 농도: 0.2%</td></tr><tr><td>RIPA Lysis Buffer Solution</td><td>Merck</td><td>20-188</td><td>최종 농도: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 프로테아제 억제제 칵테일</td><td>Thermo Scientific</td><td>78425</td><td>최종 농도: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Na3VO4</td><td></td><td></td><td>최종 농도: 1 mM</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; PMSF</td><td></td><td></td><td>최종 농도: 1 mM</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; NaF</td><td></td><td></td><td>최종 농도: 10 mM</td></tr><tr><td>Western blot reagent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td>최종 농도: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 트윈 20</td><td>Merck</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1x TBST</td><td></td><td></td><td>0.1% 트윈 20</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1x PBS</td><td>기브코</td><td>21300-058</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A53225</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 폴리아크릴아미드 겔</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0183</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 과황산 암모늄 (APS)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0700</td><td>최종 농도: 0.05%</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; TEMED</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0800</td><td>스태커 겔: 0.1%, 리졸버 겔: 0.05%</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 2x Laemmli 샘플 버퍼</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0737</td><td>최종 농도: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Precision Plus Protein Dual Color Standards</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>WB 차단 솔루션/ 2&deg; 항체 희석 완충액</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 1배 TBST</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 5% 탈지 우유 (무지방 분유)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6404</td><td>작업 농도: 5%</td></tr><tr><td>1x 러닝 버퍼 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td>최종 농도: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 글리신</td><td>시그마</td><td>G8898</td><td>14.4 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; SDS</td><td>Merck</td><td>7910</td><td>작업 농도: 0.1%</td></tr><tr><td><강력한>블롯 전달 버퍼 500 mL</강력한></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 10x Tris-buffered saline (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>170-6435</td><td>최종 농도: 1X</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 글리신</td><td>시그마</td><td>G8898</td><td>7.2 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 메탄올</td><td>Merck</td><td>106009</td><td>100 mL</td></tr><tr><td><강한>약한 스트리핑 솔루션 1 L</강한></td><td></td><td></td><td>pH를 2.2&</td></tr><tr><td>nbsp로 조정; &nbsp; &nbsp; 글리신</td><td>시그마</td><td>G8898</td><td>15 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; SDS</td><td>머크</td><td>7910</td><td>1 g</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Tween 20</td><td>Merck</td><td>9005-64-5</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL 원심분리기 튜브</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 원심분리기</td><td>Corning</td><td>430291</td><td></td></tr><tr><td>Airstream Class II</td><td>Esco</td><td>2010621</td><td>생물 안전 작업대</td></tr><tr><td>CelCulture CO2 인큐베이터</td><td>Esco</td><td>2170002</td><td>가습 조직 배양 인큐베이터</td></tr><tr><td>CFX96 Touch Real-Time PCR 검출기</td><td>Bio-Rad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td>651154</td><td></td></tr><tr><td>눈금 파이펫(10mL)</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010010</td><td></td></tr><tr><td>눈금 파이펫(5mL)</td><td>Jet Biofil</td><td>GSP010005</td><td></td></tr><tr><td>MicroCal PEAQ-ITC</td><td>Malvern</td><td></td><td>등온 적정 열량계</td></tr><tr><td>Mini PROTEAN Tetra Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1658004</td><td>전기영동 챔버</td></tr><tr><td>Mini Trans-blot 흡수성 여과지</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Omega Lum G 이미징 시스템</td><td>Aplegen</td><td>8418-10-0005</td><td></td></tr><tr><td>피펫 컨트롤러</td><td>Eppendorf</td><td>4430000.018</td><td>Easypet 3</td></tr><tr><td>PowerPac HC</td><td>Bio-Rad</td><td>1645052</td><td>전원 공급 장치</td></tr><tr><td>PVDF 멤브레인</td><td>Merck</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>T-75 세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell</td><td>Bio-Rad</td><td>1703940</td><td>Semi-dry Transfer</td></tr><tr><td>Cell 초음파 프로세서(Vibra-Cell VCX 130)</td><td>Sonics & 재료</td><td></td><td></td></tr><tr><td>: Versati 탁상용 냉장 원심 분리기</td><td>Esco</td><td>T1000R</td><td>원심 분리기, 스윙 버킷 로터</td></tr></tbody></table> 포함

치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 b 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델

A Competent Hepatocyte Model Examining Hepatitis B Virus Entry through Sodium Taurocholate Cotransporting Polypeptide as a Therapeutic Target

B형 간염 바이러스(HBV) 감염은 간세포암의 중요한 위험 요소로 간주되어 왔습니다. 현재의 치료는 바이러스 부하를 줄일 수 있을 뿐 완전한 관해를 초래하지는 않습니다. HBV 감염에 대한 효율적인 간세포 모델은 치료제 스크리닝에 중요한 실제 바이러스 수명 주기를 제공할 것입니다. 대부분의 사용 가능한 항 HBV 제제는 바이러스 진입 후 수명주기 단계를 목표로하지만 바이러스 진입 전에는 그렇지 않습니다. 이 프로토콜은 바이러스 진입 전 및 바이러스 진입 후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 치료제를 스크리닝할 수 있는 유능한 간세포 모델의 생성을 자세히 설명합니다. 여기에는 숙주 세포로서 imHC 또는 HepaRG를 기반으로 하는 나트륨 타우로콜레이트 공동 수송 폴리펩티드(NTCP) 결합, cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 조립의 표적화가 포함됩니다. 여기서, HBV 진입 억제 분석은 NTCP를 통한 HBV 결합 및 수송 기능을 억제하기 위해 커큐민을 사용하였다. 억제제는 열역학적 파라미터에 기초한 HBV 약물 스크리닝을 위한 범용 도구인 등온 적정 열량측정법(ITC)을 사용하여 NTCP와의 결합 친화도(KD)에 대해 평가되었습니다.

특히 imHC의 분화 단계에서 이핵 세포와 다각형 형태 (그림 1)를 포함한 간 성숙 특징이 관찰되었습니다 (그림 1A). NTCP 발현의 큰 증가는 d-HepaRG 및 d-imHC에서 각각 7배 및 40배로 측정되었습니다(그림 1B). HBV 진입에 대한 감수성을 부여하는 것으로 가정 된 NTCP의 고도로 글리코 실화 된 형태는 d-HepaRG보다 d-imHC에서 더 많이 검출되었다 (그림 1C). 분화된 imHC는 미분화 세포보다 65.9% 더 높은 NTCP 수준을 함유했습니다(그림 1D).
도 2A 는 예방적 치료의 요약을 나타낸다. 도 <strong cla...

자사는 숙주 타우로콜레이트 나트륨 공동 수송 폴리펩티드와의 결합 친화도(KD)를 측정하기 위해 등온 적정 열량계를 사용하여 바이러스 진입 전후 수명 주기 단계를 표적으로 하는 B형 간염 바이러스(HBV) 화합물을 스크리닝하는 프로토콜을 제시합니다. 항바이러스 효능은 바이러스 수명 주기 마커(cccDNA 형성, 전사 및 바이러스 어셈블리)의 억제를 통해 결정되었습니다.

치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델

Hepatitis B virus (HBV) infection has been considered a crucial risk factor for hepatocellular carcinoma. Current treatment can only lessen the viral load ...

이 프로토콜은 후보 항 HBV 화합물이 특히 NTCP 결합을 차단하여 바이러스 진입을 억제하는지 확인하도록 설계되었습니다. 이 기술은 HBV 진입 또는 감염의 초기 단계가 후보 화합물에 의해 중단 될 수 있는지 조사하기위한 것입니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 PSP 학생 인 Piyanoot Thongsri가 될 것입니다.나트륨 타우로콜레이트 공동수송 폴리펩티드 또는 NTCP의 측정을 시작하려면, 성숙한 간세포를 8밀 이상의 에틸렌디아민테트라아세트산 또는 EDTA와 함께 15분 동안 배양한다. 세포 펠릿을 수집하고 PBS에 3.7 % 파라 포름 알데히드 300 마이크로 리터를 15 분 동안 첨가하여 간세포를 고정합니다. 그런 다음 세포 현탁액을 1.5 밀리리터 마이크로 원심 분리 튜브에 옮겨 300G 및 섭씨 25도에서 10 분 동안 원심 분리합니다.앞에서 설명한 대로 10분 동안 원심분리기에서 1% 소 태아 혈청 또는 FBS를 함유하는 700 마이크로리터의 PBS를 사용하여 세포를 2회 세척한다. 그런 다음 실온에서 20분 동안 PBS 중 300마이크로리터의 0.05% Triton X 100으로 세포를 투과화합니다. 원심분리 후 1%FBS를 포함하는 700 마이크로리터의 PBS를 사용하여 각각 1분씩 3회 세척해 준다.세포를 섭씨 4도에서 1 대 100 비율로 NTCP에 대한 1차 항체와 함께 30분 동안 배양한 다음, 파마 세척 완충액으로 3회 세척하고, 원심분리한다. Alexa Fluor 488에 접합된 2차 항체로 세포를 섭씨 4도에서 30분 동안 염색하고 각각 1분 동안 파마 세척 완충액을 3회 세척을 반복합니다. 300G에서 원심분리한 후, 1%FBS를 함유하는 200마이크로리터의 PBS로 세포 펠릿을 재현탁시킨다.소프트웨어에서 FSC, SSC, FITC 또는 PE를 포함한 유세포 분석을 위한 측정 파라미터를 선택합니다. 자동 보정 조정을 설정하고 원고에 설명된 대로 보정 컨트롤을 포함합니다. 다음으로, 염색되지 않은 샘플을 분당 60 마이크로 리터의 중간 유체 유속으로 실행합니다. 전방 산란 및 측면 산란 임계값이 관심 있는 세포 집단을 덮을 때까지 조정합니다.이 영역의 게이트 영역을 표시하고 모든 보상 제어에 적용하십시오. 염색되지 않은 컨트롤을 사용하여 광 배율 튜브 또는 PMT 형광을 설정하고 음의 사분면에서 FITC 또는 PE의 PMT 전압을 조정합니다. 양성 염색 샘플을 실행하고 양

a-competent-hepatocyte-model-examining-hepatitis-b-virus-entry

Research

연구

JoVE Journal

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생화학

우리는 조건부를위한 두 가지 방법을...

Heterokaryon 형성의 두 가지 방법 HCV 제한 요소를 발견하기

이 비디오는 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC) 유래 CD8+ T 세포를 사용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제를 억제하는 분석을 보여줍니다. HBV 특이적 수용체로 조작된 이 T 세포는 형질전환 마우스로 전달됩니다. 그런 다음 복제 가능한 HBV 게놈 플라스미드를 간에 직접 주입하여 바이러스 DNA 흡수를 가능하게 합니다. 바이러스 항원이 하이브리드 MHC-I 분자에 의해 발현되고 제시되면 조작된 T 세포는 이러한 복합체를 인식하고 결합합니다. 이는 세포독성 분자의 방출을 유발하여 HBV에 감염된 간 세포를 파괴하고 바이러스 복제를 억제합니다.

바이러스 항원 특이적 T 세포를 이용한 B형 간염 바이러스 복제 억제

여기서 우리는 HBV의 생활주기의 초기 단계를 모니터링하는 새롭게 개발 된 B 형 간염 바이러스 (HBV) 리포터 시스템을 설명한다. 시험 관내 시스템에서 간략화 이것은 높은 처리량 전략을 사용 항 HBV 에이전트 스크리닝 도울 것이다.

B 형 간염 바이러스 리포터 시스템 개발은 복제주기의 초기 단계를 모니터링하기

이 프로토콜의 목표는 B 형 간염 바이러스와 3 차원 "간-온-어-칩" 감염 실험을 수행 하는 단계별 가이드를 제공 하는입니다.

기본 Hepatocytes 및 B 형 간염 바이러스 감염에 대 한 Kupffer 세포의 "간-온-어-칩" 문화

이 프로토콜은 돼지 hepatocyte 격리와 ex vivo 유전자 배달 모델 autologous 세포 이식 통해 대사 질환의 치료를 설명 하는 위한 것입니다. 이 특정 모델은 성공적인 치료를 선호 하는 독특한 장점, 있지만 응용 프로그램은 추가 질병 징후를 해결 하기 위해 관련 기초 이다.

돼지에서 자가 이식 Hepatocytes 전 비보 의 lentiviral 벡터 중재 된 유전자 치료

이 프로토콜 사용을 설명 합니다 단일 체인의 MHC 종류 I 인간 CD8 + T 세포 활성화의 분자 상호 작용을 조사 하기 위해 단지: 조작된 항 단일 체인을 표현 하는 세포의 생성, 인간 CD8 + T 세포 복제의 문화 그리고 T 세포 활성화 실험입니다.

공동-agonism 인간 CD8 + T 세포 활성화에 조사를 단일 체인 MHC 기술의 사용

여기서, 간세포암(HCC)의 전형적인 면역 특징을 재기하는 간암의 임상적으로 관련 있는 뮤린 모델의 개발을 설명한다.

간 염증과 섬유증의 설정에서 발생하는 간세포암의 종양 성 간세포 유도 직교 마우스 모델

여기에 제시된 것은 줄기세포 유래 바이러스 항원(Ag)-특이적 T 림프구의 입양세포 전달(ACT)을 이용하여 마우스에서 B형 간염 바이러스(HBV) 복제의 효과적인 억제를 위한 프로토콜이다. 이 절차는 HBV 감염의 잠재적인 ACT 기지를 둔 면역 요법을 위해 적응될 수 있습니다.

줄기 세포 유래 바이러스 Ag 특이적 T 림프구는 마우스에서 HBV 복제를 억제

여기서, 우리는 분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호작용을 억제하는 항-B형 간염 바이러스 성 물질을 스크리닝하는 방법을 제시한다. 이 시스템은 단백질-단백질 상호 작용의 쉬운 검출을 허용하고 그 같은 상호 작용의 억제제를 확인하기 위해 적당합니다.

분할 루시퍼라아제 분석 시스템을 사용하여 HBx-DDB1 상호 작용의 억제제 식별

여기에 설명된 이종세포를 효율적으로 감염시키기 위해 E형 간염 바이러스(HEV)의 높은 바이러스 성 티터 스톡을 생성하는 방법에 대한 효과적인 방법이 기재되어 있다. 제시된 방법을 통해, 비봉투뿐만 아니라 둘러싸인 바이러스 성 입자를 모두 수확하고 다양한 세포주를 접종하는 데 사용될 수 있다.

높은 티더 E 바이러스 주식을 생산하기위한 세포 배양 모델

이 원고는 인간 NTCP, HNF4α, RXRα 및 PPARα를 발현하는 새로운 엔지니어링 293T-NE-3NR및 전통적인 간 세포(HepG2-NE, 인간 NTCP를 표현하는 HepG2-NE)에서 B형 간염 바이러스(HBV) 감염을 위한 상세한 프로토콜을 설명합니다.

비 간염 293T-NE-3NRs 세포에 있는 B형 간염 바이러스 감염을 모델링

학습하세요 HBV 진입 억제제를 선별하는 방법을 배우세요. 성숙 간세포에서 NTCP 결합을 차단하여 바이러스 감염을 예방하는 약물 효능을 평가하는 기술입니다.

치료 표적으로 폴리펩티드를 공동 수송하는 나트륨 타우로 콜레이트를 통한 B 형 간염 바이러스 진입을 조사하는 유능한 간세포 모델

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