제1형 당뇨병, 체강 질병 및 COVID-19에 대한 고처리량 멀티플렉스 스크리닝
2022년 7월 5일
제1형 당뇨병, 체강 질병 및 코로나바이러스 질병 2019에 대한 스크리닝의 시급한 필요성에 따라 당사는 4개의 췌도 자가항체, 조직 트랜스글루타미나제 자가항체 및 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2의 수용체 결합 도메인에 대한 항체를 동시에 검출하기 위해 고처리량 6-Plex 전기화학 발광 분석을 개발했습니다.
새로운 6-Plex ECL 분석은 검증된 최초의 멀티플렉스 분석이며 현재 일반 인구 선별을 위한 임상 시험에 적용됩니다. 대규모 인구에서 제1형 당뇨병, 체강 질병 및 COVID-19를 스크리닝하는 데 적합한 6개의 자가항체 분석을 동시에 결합합니다. 현재의 표준 자가항체 분석과 비교하여, 이 기술은 다수의 자가면역 질환에 대한 다수의 자가항체를 동시에 보다 효율적으로 스크리닝할 수 있다.
이 기술의 의미는 대규모 스크리닝을보다 실현 가능하고 질병 특이 적으로 만들어 예방을위한 조기 질병 예측과 치료를위한보다 정확한 진단으로 이어질 것입니다. 시작하려면 156마이크로리터의 1%BSA가 포함된 튜브에 4마이크로리터의 비오틴화 GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 및 프로인슐린 항원 단백질을 추가하고 240마이크로리터의 해당 스트렙타비딘 접합 링커, 1, 2, 3, 8, 9 및 10과 혼합합니다. 이어서, 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.
160 마이크로리터의 정지 용액을 각 튜브에 분취하고, 혼합물을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다. 이제 각 튜브에서 400 마이크로 리터의 혼합 용액을 가져 와서 함께 결합하십시오. 4마이크로리터의 루테늄 표지 GAD65, SARS-CoV-2 RBD, IA-2, tTG, ZnT8 및 프로인슐린 항원을 혼합물에 추가합니다.
그런 다음 1.6 밀리리터의 정지 용액과 3.2 밀리리터의 PBS를 첨가하십시오. 모든 구성 요소를 철저히 혼합하십시오. 이제 항원 용액을 분석에 사용할 준비가되었습니다.
96-웰 PCR 플레이트의 경우, 웰당 7마이크로리터의 혈청을 분취하고, 플레이트를 밀봉 필름으로 덮는다. 다음으로, PCR 기계에서 혈청을 섭씨 56도에서 30분 동안 예열하고 플레이트를 100배 G에서 1분 동안 잠시 원심분리합니다. 웰당 63마이크로리터의 준비된 항원 용액을 추가하고 혈청과 혼합하고 빛을 피하기 위해 PCR 플레이트를 밀봉 호일로 덮습니다.
실온에서 2 시간 동안 450rpm의 속도로 셰이커에서 플레이트를 흔든다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 4도에서 18-24시간 동안 배양합니다. 섭씨 4도 냉장고에서 6-Plex 접시를 꺼내 접시가 실온이 되도록 합니다.
그런 다음 150-Plex 플레이트의 각 웰에 3 % 차단제 A 6 마이크로 리터를 추가합니다. 빛을 피하기 위해 호일로 판을 덮으십시오. 접시를 섭씨 4도 냉장고에 다시 넣고 밤새 배양하십시오.
배양이 끝나면 플레이트가 냉장고에서 제거되면 플레이트에서 모든 버퍼를 제거합니다. 종이 타월에 접시를 두드려 말리고 매번 우물당 150마이크로리터의 세척 완충액으로 세 번 씻습니다. 플레이트를 종이 타월 상에서 건조시키고, 분취량 30 마이크로리터의 혈청 항원을 밤새 인큐베이션 PCR 플레이트의 각 웰로부터 6-플렉스 플레이트의 2개의 웰로 인큐베이션한다.
플레이트를 호일로 덮은 다음 플레이트를 플레이트 셰이커에 놓고 실온에서 450rpm의 속도로 1 시간 동안 흔 듭니다. 6-Plex 플레이트에 존재하는 용액을 덤프하고 웰당 150 마이크로리터의 0.4 M 염화나트륨 세척 완충액으로 플레이트를 3회 세척한다. 세 번째 세척이 완료된 후 종이 타월에 대해 플레이트를 말리고 각 웰에 150마이크로리터의 판독 버퍼를 추가합니다.
6-Plex ECL 분석에서 GADA, IAA, IA-2A, ZnT8A, TGA 및 COVID-19A에 대한 6개의 자가항체의 수준은 해당 6개의 단일 ECL 분석 및 현재 표준 방사선 결합 분석과 잘 상관관계가 있었습니다. 모든 6개의 항체에 대한 각각의 샘플에 대한 인덱스 값을 상응하는 양성 및 음성 대조군에 대해 계산하였다. 컷오프 값보다 큰 인덱스 값이 관찰되어 긍정적 인 결과를 나타냅니다.
혈청 내 자가항체는 루테늄 표지 항원을 비오티닐화 항원에 침투시켜 특이적 링커와 복합체를 형성하여 멀티플렉싱 플랫폼을 구축했습니다. 이 전술은 제 1 형 당뇨병 및 수반되는 질병에 대한 일반 인구에서보다 실현 가능하고 효율적인 대규모 스크리닝을 만들어 질병의 조기 예측 및 예방으로 이어집니다.
개요
본 연구는 제1형 당뇨병, 셀리악병 및 COVID-19와 관련된 자가항체를 동시에 검출하도록 설계된 새로운 6-Plex 전기화학발광 분석법을 제시합니다. 이 분석법은 이러한 자가면역 질환에 대한 대규모 스크리닝 효율을 높이는 것을 목표로 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 자가면역
- 임상 진단
- 전기화학발광 분석법
배경
- 제1형 당뇨병과 셀리악병은 조기 발견이 필요한 자가면역 질환입니다.
- COVID-19는 자가면역 질환 선별 검사에 새로운 과제를 안겨주었습니다.
- 현재의 선별 방법은 종종 비효율적이며 시간이 많이 소요됩니다.
- 다중 분석(Multiplex assays)은 여러 항체를 동시에 테스트함으로써 선별 능력을 향상시킬 수 있습니다.
연구 목적
- 다중 자가항체를 동시에 검출하기 위한 고처리량 분석법을 개발한다.
- 임상 시험에 사용할 수 있도록 분석법을 검증한다.
- 질병의 조기 예측 및 예방을 용이하게 한다.
사용된 방법
- 비오틴화 및 루테늄 표지 단백질을 이용한 항원 용액 조제.
- 조제된 항원 용액과 혈청 시료의 반응.
- 시료 처리를 위한 96-웰 PCR 플레이트 사용.
- 멀티플렉스 접근 방식의 검증을 위한 표준 분석법과의 결과 상관관계 분석.
주요 결과
- 6-Plex ECL 분석은 기존의 단일 분석과 강한 상관관계를 나타냈습니다.
- 인덱스 값은 혈청 샘플 내 자가항체에 대해 양성 결과를 나타냈습니다.
- 본 분석법을 통해 여러 자가면역 질환을 효율적으로 스크리닝할 수 있습니다.
- 결과는 대규모 인구 스크리닝의 가능성을 뒷받침합니다.
결론
- 6-Plex ECL 분석은 자가면역 질환의 조기 진단을 위한 유망한 도구입니다.
- 이 방법은 스크리닝 과정의 효율성을 높여줍니다.
- 이는 조기 개입을 통해 환자의 예후를 개선할 수 있는 가능성을 가지고 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
검증된 6-Plex ECL 분석법은 제1형 당뇨병, 셀리악 병 및 COVID-19에 대한 자가항체의 고처리량 다중 검출을 가능하게 하여, 효율적이고 질환 특이적인 인구 집단 스크리닝의 필요성을 해결합니다. 이 플랫폼은 발견에서 진단으로 이어지는 연속체(discovery-to-diagnosis continuum)의 가장 초기 변곡점에서 예측 신뢰도를 높여, 자가면역 및 감염성 질환 연구를 위한 위험 조정 포트폴리오 의사결정을 지원합니다. 이를 기본 스크리닝 도구로 채택함으로써 중개 및 전임상 워크플로우에 기업 수준의 영향력을 입증하였습니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 단일 분석 형식으로 여러 자가면역 및 바이러스 표적을 동시에 조사할 수 있습니다.
- 질환 특이적 자가항체 프로파일을 구분하여 생물학적 리스크 감소를 개선합니다.
- 조기 질환 예측 및 예방 전략을 위한 예측 신뢰도를 지원합니다.
- 표적 검증을 위한 다중 정량적 판독값을 제공하여 포트폴리오 우선순위 결정을 용이하게 합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 후속 스크리닝 및 바이오마커 워크플로우를 위해 검증된 멀티플렉스 시스템을 준비합니다.
- 시료 간의 재현성과 정량적 비교 가능성을 보장하기 위해 분석 조건을 표준화합니다.
- 최소한의 혈청 부피 요구 사항으로 확장 가능한 고속 대량 스크리닝을 가능하게 합니다.
- 여러 질병 관련 바이오마커에 미치는 화합물 또는 중재 효과의 신뢰할 수 있는 평가를 지원합니다.
중개 및 전임상 연구
- 발견 단계부터 임상 검증까지의 중개적 연속성을 위해 질환 관련 바이오마커 전략과 일치합니다.
- 전임상 파이프라인에서 위험 조정 기반의 진행 결정에 정보를 제공하는 정량적 결과물을 제공합니다.
- 다중 자가항체 프로파일을 질환의 발병 및 진행과 상관 분석함으로써 예측적 위험 감소(de-risking) 효과를 높입니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
6-Plex ECL 분석은 초기 발견, 리드 화합물 확인 및 중개 연구의 접점에 통합되어, 가설 검증부터 전임상 검증까지 원활한 진행을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 다중 자가항체 검출을 통해 강력한 가설 검증 및 경로 규명을 지원합니다.
- 스크리닝: 고처리량 스크리닝 환경에 적합한 재현 가능하고 정량적인 결과를 제공합니다.
- 분석: 조건 간 비교 및 통계 분석을 위한 지수 값과 컷오프 기반의 결정 지점을 제공합니다.
- 중개 연구: 바이오마커 검출을 질환 관련 종점과 일치시켜 발견 단계와 임상 검증 사이를 연결합니다.
- 기업적 재사용: 향후 다중 스크리닝 프로젝트를 위한 재사용 가능하고 확장 가능한 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 초기 단계의 자가면역 및 감염성 질환 연구에서 예측 신뢰도를 높이고 기전적 모호성을 줄입니다.
- 운영적 가치: 표준화, 재현성 및 고속 대량 스크리닝 확장성을 통해 워크플로우를 효율화합니다.
- 전략적 가치: 다중 분석 가능한 실행 데이터를 제공함으로써 정보에 기반한 go/no-go 결정과 자본 효율적인 포트폴리오 관리를 가능하게 합니다.
- 포트폴리오 영향: 견고한 다중 바이오마커 근거를 바탕으로 위험 조정 우선순위 지정 및 후보 물질의 진전을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 다중 면역분석법 개발 및 전기화학발광 검출에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- ECL 판독 및 고처리량 플레이트 핸들링을 위한 전문 장비의 사용 권한이 요구됩니다.
- 분석 프로토콜과 데이터 분석 파이프라인의 팀 간 표준화가 필요합니다.
- 포트폴리오 요구 사항의 변화에 따라 다양한 시료 유형 또는 질환 모델에 맞춘 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실질적인 제한 사항으로는 기존의 단일-플렉스 및 방사성 결합 분석법을 통한 엄격한 검증 절차가 필요하다는 점이 있습니다.
바이오 제약 FAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
1:06
Create Linker‐Coupled Antigen Solution
2:36
Preparation of Antigen Labeled Serum and the 6‐Plex Plate
3:54
Serum/Antigen Incubates Transfer into the 6‐Plex Plate
4:42
Washing the 6‐Plex Plate and Reading Buffer Addition
5:11
Results: Comparison of Antibody Levels Study Between the Single and the 6‐Plex ECL Assay
5:59
Conclusion
