Name: 병아리 두개골 신경 볏 세포 배양의 준비 및 형태학적 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 배우세요 병아리 두개골 신경 볏 세포 배양 및 형태학적 분석 방법을 통해 신경嵴세포의 이동과 형태를 연구하세요. 이 기술은 발달생물학 및 신경과학 연구에 필수적인 재현 가능한 실험 환경을 제공합니다.

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병아리 두개골 신경구 배양 프로토콜 버전 개발에 참여한 Corinne A. Fairchild와 Katie L. Vermillion에게 감사드립니다.

<ol><li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+border%3A+Induction%2C+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li>
<li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+lineage+analysis%3A+From+past+to+future+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li>
<li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li>
<li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231(2020).</li>
<li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li>
<li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li>
<li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li>
<li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongator+Protein+3+%28Elp3%29+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap%2Ftead+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li>
<li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li>
<li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118(2014).</li>
<li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051(2019).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+delamination+and+migration%3A+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li>
<li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li>
<li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phalloidin+binding+site+of+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li>
<li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Communications+and+Image+Processing+%2790%3A+Fifth+in+a+Series%22%5BJournal%5D)">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li>
<li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li>
<li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li>
<li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li>
<li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li>
<li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li>
<li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424(2021).</li>
<li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+morpholinos+to+control+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Nucleic+Acid+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li>
<li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li>
<li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

여기에 설명 된 기술은 병아리 신경 주름을 분리하고 철새 두개골 NCC의 배양을 만들기 위해 도금하는 적응 가능한 방법을 제공합니다. 이러한 배양은 병아리 NCC 이동 및 형태를 쉽게 분석할 수 있는 단순화된 2D 조건을 제공하며, 이는 ovo 이미징 방법24,25,26에서 기술적으로 더 어려운 것을 보완할 수 있습니다. 이 시험관 내 방법은 비교적 간단하지만 일관된 결과는 고품질 계란과 시약에 달려 있습니다. 또한 배양의 고유 한 가변성으로 인해 재현성에는 실험적 반복 및 정량이 필요합니다.
FN에 대한 신경 주름의 접착은 배양에서 NCC 이동에 필수적입니다. 때때로, 체외 이식편이 제대로 부착되지 않을 것이고, 신경 폴드가 떠내려가거나 이동 NCC가 없거나 거의 생성되지 않을 것...

신경 볏 세포 (NCC)는 척추 동물 배아의 일시적인 세포 집단입니다. NCC는 신경판의 경계에 지정되며 등쪽 신경관1에서 이동하기 위해 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)를 겪습니다. EMT 후, NCC는 배아 전체에 광범위하게 분산되어 궁극적으로 두개 안면 골격, 심장의 유출로 및 대부분의 말초 신경계를 포함한 다양한 구조를 구별하고 기여합니다2. 세포 극성, 세포 골격 및 접착 특성의 변화는 이동 전 세포 집단에서 이동 세포 집단으로의 이러한 변화의 기초가됩니다3. NCC EMT 및 이동을 연구하면 세포 운동성의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 선천적 결함 및 암 전이를 예방하고 치료하기위한 노력을 알 수 있습니다.
생체 내 분석은 배아 맥락에서 NCC 발달 과정을 이해하는 데 필수적이지만 시험관 내 방법은 추가적인 실험 경로를 용이하게 하는 시각적 및 물리적 접근성을 제공합니다. 단순화된 2D 환경에서는 NCC 형태, 세포골격 구조 및 이동한 거리를 평가할 수 있습니다. 또한, 운동성 NCC의 이동 행동에 대한 유전 적 또는 용해성 인자 섭동의 영향을 분석 할 수 있습니다 4,5,6,7,8,9,10. 또한, 분리 된 예비 또는 이동 NCC는 단백질체, 전사체 및 후성 유전체 프로파일 링 7,11을 통해 NCC의 발달 조절을 연구하기위한 고 처리량 방법론에 수집, 풀링 및 사용될 수 있습니다. 다양한 발달 모델 유기체12,13,14로부터 두개골 NCC를 준비하는 방법을 사용할 수 있지만, 이 기사는 병아리 배아에서 두개골 NCC를 배양하는 방법을 처음 배우는 사람들을 위한 접근 방식의 메커니즘을 보여줍니다.
현재 프로토콜은 병아리 두개골 NCC 배양을 준비하기 위한 다목적 기술을 설명합니다(그림 1). NCC는 이식된 신경 주름에서 배양 기질로 쉽게 이동하기 때문에 병아리 NCC는 배아 조직에서 자연적으로 분리되고 1차 배양이 쉽게 생성됩니다. 중뇌 NCC가 두개골 신경 주름으로부터 한꺼번에 이동함에 따라 (몸통15의 연장 된 세포 별 박리와는 대조적으로), 이들 배양은 주로 이동 두개골 신경 볏 세포로 구성되며, 초기 신경 접힘 절제는 예비 NCC에 대한 수집 방법을 제공한다. 병아리 두개골 신경 주름을 해부하고 배양하는 기본 방법이 자세히 설명되어 있으며이 방법에 대한 다양한 응용 및 변형에 대한 제안이 제공됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> 그림 1: 병아리 두개골 신경접힘 배양 프로토콜의 개략도. (A,B) 두개골 신경 주름 (파란색 윤곽선)은 5 개의 체세포가있는 병아리 배아에서 절제됩니다 (A의 등쪽 보기에 표시). 회색 밴드, 심장 초승달. (C) 피브로넥틴에 도금하면 이동 신경 볏 세포가 신경 주름에서 나와 기질 상으로 분산됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>ZEN 3.0 SR 소프트웨어로 제어되는 LSM710 컨포칼 스캔 헤드가 장착된 AxioObserver&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Used alpha Plan-Apochromat 100x/1.46 Oil DIC M27 objective</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>챔버 접시 (유리 바닥, 단일 또는 분할)</td><td>MatTek; Cell Vis</td><td>P35G-1.5-14-C (MatTek) X000NOJQGX (Cellvis) X000NOK1OJ (Cellvis)</td><td>Single chamber 35 mm 또는 4 chamber 35 mm</td></tr><tr><td>cover glass</td><td>Carolina Biological Supply Company</td><td>633029, 633031, 633033, 633035, 633037</td><td>circles, 0.13&ndash; 0.17mm 두께, 12-25mm 직경으로 사용 가능&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320033</td><td>L15 미디어</td></tr><tr><td>에그 인큐베이터</td><td>Sportsman</td><td>1502</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td>용 대안;<td>생명 기술</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>CB-40008A</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Whatman</td><td></td><td>급료 3MM 착색인쇄기</td></tr><tr><td>겸자 (무딘)</td> <td>Fisher 과학; 토마스 사이언티픽</td><td>08-890 (피셔); 1141W97 (Thomas)</td><td></td></tr><tr><td>집게 (미세한)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Image J</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td> <td>Free image analysis software</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>L15 media</td><td>Invitrogen</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디어(Vectashield 또는 ProLong Gold)</td><td>Vector Laboratories; Thermofisher Scientific</td><td>H-1700(벡타쉴드); P36930 (ProLong Gold)</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>10,000 units/mL 페니실린; 10,000 mg/mL 스트렙토마이신</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>VWR (또는 유사한)</td><td></td> <td>60 mm, 100 mm</td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>다중 flurophores 사용 가능</td></tr><tr><td>핀 홀더</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td>텅스텐 바늘 용 (스프링 가위 대체)</td></tr><tr><td>가위 (해부)</td><td>Fine Science Tools</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>Spring Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td>2.5mm 절삭날(텅스텐 바늘 대체)</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Krayden</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>주사기 필터</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>Millex-GV 주사기 필터 장치, 0.22 & 마이크로; m, PVDF, 33mm, 감마 살균</td></tr><tr><td>조직 배양 접시</td><td>Sarstedt</td><td>83-3900</td><td>벌크 신경 폴드 배양을 위한 35mm 배양 접시</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>텅스텐 와이어</td><td>다양한 소스</td><td></td><td>0.01" 텅스텐 바늘용 직경(스프링 가위의 대안)</td></tr></tbody></table>

병아리 두개골 신경 볏 세포 배양의 준비 및 형태학적 분석

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

척추 동물이 발달하는 동안 신경 볏 세포 (NCC)는 광범위하게 이동하여 두개 안면 골격 및 말초 신경계와 같은 구조에 기여하는 다양한 세포 유형으로 분화합니다. 3D 배아의 맥락에서 NCC 이동을 이해하는 것이 중요하지만 2D 배양에서 이동 세포를 분리하면 시각화 및 기능적 특성화가 촉진되어 배아 연구를 보완할 수 있습니다. 본 프로토콜은 일차 NCC 배양물을 생성하기 위해 병아리 두개골 신경 주름을 단리하는 방법을 보여줍니다. 이동 NCC는 피브로넥틴으로 코팅된 기질에 도금된 신경 접힘 외식편에서 나옵니다. 그 결과 염색 및 정량적 형태학적 분석으로 평가할 수 있는 분산되고 부착된 NCC 집단이 생성됩니다. 이 단순화된 문화 접근 방식은 적응력이 뛰어나며 다른 기술과 결합할 수 있습니다. 예를 들어, NCC 이민 및 이동 행동은 타임 랩스 이미징에 의해 평가되거나 유전자 발현의 억제제 또는 실험적 조작 (예 : DNA, 모르 폴리 노 또는 CRISPR 전기 천공)을 포함하여 기능적으로 질의 될 수 있습니다. 다양성 때문에이 방법은 두개골 NCC 발달을 조사하기위한 강력한 시스템을 제공합니다.

현재 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 배양 된 알을 열고, 표면에 배아가있는 노른자를 장갑을 낀 손바닥에 부드럽게 부어 분리했습니다 (그림 2A, B). 알부민을 제거한 후(그림 2C), 여과지 프레임을 배아를 둘러싸고 있는 노른자 막에 적용하여 노른자에서 배아를 쉽게 자르고 들어 올렸으며, 이는 난황막이 절단되면 유출되기 시작합니다(그림 2D, E).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig02.jpg"> <strong cl...

이 다목적 프로토콜은 병아리 배아에서 두개골 신경 주름의 절제를 통해 이식 신경 볏 세포 (NCC)의 분리를 설명합니다. 도금 및 배양 시 이동 NCC가 신경 접힘 외식편에서 나와 단순화된 2D 환경에서 세포 형태 및 이동을 평가할 수 있습니다.

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

신경 볏 세포는 배아의 두개골 신경 주름에서 또는 배양에 배치 될 때 이동합니다. 이것은 세포 해리없이 1 차 이동 신경 볏 세포를 분리하는 편리한 방법을 제공합니다. 신경 볏 이동은 일반적으로 3차원 배아 환경 내에서 발생하지만 2차원 배양은 이동 관련 프로세스의 시각화 및 조사를 가능하게 합니다.두개신경구 배양 프로토콜이 존재하지만 이 방법에는 훈련 및 유기체별 단계가 필요합니다. 이 비디오는 병아리 두개골 신경 접힘 배양의 재현 가능한 준비를 용이하게하는 기술을 보여줍니다. 초보자는 종종 신경 주름을 해부 및 도금하고 문화 결과를 평가하는 데 어려움을 겪습니다.해부 지침을 따르고 여기에 설명된 형태 측정 분석을 적용하면 일관되고 정량적인 결과를 얻을 수 있습니다. 시작하려면 수정란을 섭씨 38도의 가습 인큐베이터 안에 똑바로 세웁니다. 인큐베이터에서 알을 꺼낸 후 70 % 에탄올을 완전히 뿌리고 건조시켜 껍질을 소독하십시오.배양물을 고정 및 염색하기 위해, 유리 커버 슬립을 사용하여 멀티웰 조직 배양 접시에 넣고, 웰의 바닥을 덮기에 충분한 피펫 피펫 용액을 사용한다. 다음으로, 뚜껑을 교체하고, 신경 주름을 해부하면서 적어도 1 시간 동안 섭씨 38 도의 가습 인큐베이터에서 피브로넥틴 용액으로 플레이트를 배양한다. 무딘 집게를 사용하여 달걀 길이의 1/4에서 1/3로 껍질에 작은 구멍을 뚫습니다.무딘 집게를 작은 구멍에 조심스럽게 삽입하여 노른자를 방해하지 않도록하십시오. 그런 다음 달걀 주위의 달걀 껍질을 자르고 달걀 껍질의 상단을 제거한 다음 분리를 위해 배아를 배치합니다. 닫힌 무딘 집게의 평평한 가장자리를 사용하여 배아를 덮고 있는 노른자 표면의 과도한 알부민을 닦아내어 배아를 준비합니다.집게를 사용하여 배아 위에 여과지 지지 프레임을 놓고 배아는 프레임 창에 놓습니다. 노른자에 부착되도록 여과지를 부드럽게 누릅니다. 해부 가위로 여과지 프레임 외부를 자릅니다.집게나 가위 끝을 사용하여 프레임의 가장자리를 잡고 배아를 노른자에서 부드럽게 들어 올립니다. 종이 프레임이 아래로 향하도록 배아를 펜 스트렙이 있는 링거로 채워진 60 또는 100밀리리터 페트리 접시에 넣습니다. RNA 또는 단백질에 민감한 다운스트림 적용을 위해 배아를 수집하는 경우 배아 접시를 얼음 위에 보관하십시오.배아를 Ringer의 펜 - 연쇄상 구균 용액이 들어있는 깨끗한 접시에 옮깁니다. 배아를 앞뒤로 부드럽게 헹구어 시야를 가리는 노른자를 제거하고 링거의 펜 스트렙 용액을 교환하거나 흐려지면 신선한 접시에 옮깁니다. 해부 현미경 아래에서 배아 등쪽과 프레임 쪽이 위로 향하도록 배치합니다.배아를 종이 프레임에 놓아 스트레칭을 유지하고 제자리에 고정하십시오. 그런 다음 집게를 사용하여 신경 주름을 노출시켜 vitelline 막을 제거합니다. 확장하는 시신경 소포에 조직 꼬리를 포함하고 마름모꼴 수축이 막 나타나기 시작한 뒷뇌에 주둥이를 포함합니다.봄 가위를 사용하여 중뇌 신경 주름을 조심스럽게 절제하십시오. 신경관과 비신경성 외배엽의 오염을 최소화하면서 신경구의 등쪽 최측면을 절제하고 P20 피펫터 또는 노른자 링거의 펜-연쇄상 구균 용액으로 헹군 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 링거의 펜-스트렙 용액이 들어 있는 깨끗한 접시에 신경 주름을 옮깁니다. 추가 주름을 해부하면서 수집 된 주름을 얼음에 보관하십시오.인큐베이터에서 배양 접시를 꺼낸 후 피펫터 또는 파스퇴르 피펫을 사용하여 커버 슬립, 접시 또는 웰에서 피브로넥틴 용액을 제거합니다. 피브로넥틴으로 코팅된 기질을 링거스 펜-스트렙 용액으로 헹군 후, 적절한 양의 완전한 배양 배지를 접시 또는 웰에 첨가한다. 플라스틱을 막고 티슈가 달라붙는 것을 방지하려면 P20 또는 P200 피펫터를 사용하고 노른자 링거의 펜 스트렙 용액으로 피펫 팁을 헹굽니다.그런 다음 분리된 신경 주름을 피브로넥틴으로 코팅된 커버 슬립의 중앙으로 옮기고 가능한 한 적은 Ringer의 펜-스트렙 용액을 옮기도록 주의하십시오. 체외이식편을 10 내지 15분 동안 가라앉힌 후, 도금된 신경 주름이 있는 배양 접시를 천천히 조심스럽게 운반하여 섭씨 38도의 가습 챔버에 넣는다. 파스퇴르 피펫으로 배양 배지를 제거하고 필터 멸균 PBS로 웰을 헹굽니다.4% 파라포름알데히드를 추가하고 실온에서 15분 동안 플랫폼 셰이커에 보관하십시오. 배양이 끝나면 파라포름알데히드를 제거하고 PBS로 웰을 3회 헹구고 5% 혈청을 포함하는 PBST를 추가합니다. 이제 30 마이크로리터의 200-나노몰 오레곤 그린 컨쥬게이트된 팔로이딘을 각 커버 슬립에 대해 매끄러운 표면에 피펫팅합니다.한 쌍의 집게를 사용하여 5% 혈청이 포함된 PBST에서 덮개 슬립을 제거하여 세포의 방향이 위쪽을 향하도록 합니다. 커버 슬립의 가장자리를 섬세한 작업 와이퍼에 짧게 대어 과도한 액체를 제거합니다. 각 커버 슬립 셀 쪽을 아래로 향하게 희석된 팔로이딘 방울에 부드럽게 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다.배양 기간 후, 염색 용액에서 커버 슬립을 들어 올려 배양 접시에 다시 넣고 세포 면이 위로 오도록 뒤집습니다. 커버 슬립을 PBST로 덮고 플랫폼 셰이커에 10분 동안 놓고 커버 슬립을 덮고 어두운 곳에 두십시오. PBST를 제거하고 커버 슬립을 두 번 반복하여 총 10분 세척을 3회 반복합니다.현미경 슬라이드에 장착 미디어 한 방울을 놓습니다. 기포가 생기지 않도록 장착 용지 위에 덮개 슬립을 비스듬히 천천히 내리고 이미징하기 전에 용지가 굳도록 하여 덮개 슬립 셀 면이 아래로 향하도록 합니다. 마지막으로 염색된 세포를 이미지화하고 TIFF 파일로 내보냅니다.신경 볏 세포는 배양 후 3-4 시간 이내에 부착 된 신경 폴드 외식편에서 나오기 시작했으며 약 20 시간 후에 이동이 완료되었습니다. 이동 신경 볏 세포는 HNK-1을 사용하여 표지되었으며 대부분의 세포는 HNK-1 양성인 것으로 나타났습니다. 이동된 신경 볏 세포는 필라멘트 액틴을 팔로이딘으로 염색하여 시각화했습니다.팔로이딘으로 염색된 세포의 이미지는 ImageJ를 사용하여 처리되어 세포가 흰색 배경의 검은색으로 나타나는 임계값 이미지를 생성했습니다. 임계 이미지를 분석하고 다양한 측정 값을 대조되는 막대 그래프 또는 바이올린 플롯으로 표시했습니다. 예를 들어, 분석 된 69 개의 세포의 평균 면적은 대략 802.11 평방 마이크로 미터였으며, 60.27에서 2, 664.53 평방 마이크로 미터 범위였다.원형도는 세포의 돌출성을 반영하며 범위는 0.101에서 0.875입니다. 낮은 값은 길쭉한 모양을 나타내고 값 1은 완벽한 원을 나타냅니다. 대부분의 세포는 바이올린 플롯에서 가장 쉽게 볼 수있는 길쭉한 모양을 나타 냈습니다.이 분야의 이동 신경 볏 세포는 평균 종횡비가 약 2.13이고 종횡비가 1이면 대칭 모양을 나타냅니다. 신중한 절제와 체외이식편 도금은 성공적인 배양에 매우 중요합니다. 신경 주름이 잘린 면이 아래로 향하도록 10-15분 동안 그대로 둔 다음 천천히 인큐베이터로 옮겨 접착을 촉진합니다.이러한 기술의 변형에는 배양 전 일시적인 유전자 조작과 배양 중 타임 랩스 이미징이 포함됩니다. 또한 이 프로토콜을 사용하면 omics 수준 분석을 위해 이동 전 및 이동 신경 볏 세포 집단을 수집할 수 있습니다.

preparation-morphological-analysis-chick-cranial-neural-crest-cell

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

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의 해부<em&gt;는 Xenopus laevis의</em&gt; 신경 크레스트<em&gt; 시험관</em&gt; 이식편 문화 또는<em&gt; 생체</em&gt; 이식

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인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

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이 프로토콜은 신경 능선 세포가 히알루로난이 풍부한 세포외 기질로의 생체 내 이동에 관여하는 분자의 기능 분석에 적합한 시험관 내 이동 실험을 설명합니다.

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우리는 마우스 배아 줄기 세포에서 두개골 신경 능선 세포를 생성하기 위해 재현 가능한 크기의 신경구를 생성하는 3차원(3D) 체외 분화 프로토콜을 제시합니다. 우리는 이 방법론이 이전 프로토콜에 비해 변동성을 줄이고 두개골 신경 능선 세포 발달을 연구하기 위한 다중 분석에 어떻게 사용할 수 있는지 보여줍니다.

Cranial Neural Crest Cells Multiplexed Assay를 위한 3차원 In Vitro Differentiation Protocol

배우세요 병아리 두개골 신경 볏 세포 배양 및 형태학적 분석 방법을 통해 신경嵴세포의 이동과 형태를 연구하세요. 이 기술은 발달생물학 및 신경과학 연구에 필수적인 재현 가능한 실험 환경을 제공합니다.

병아리 두개골 신경 볏 세포 배양의 준비 및 형태학적 분석

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