Name: ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の作製と形態解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 学ぶ ニワトリ頭蓋神経堤細胞の分離培養と形態解析法。2次元培養系で細胞遊走を可視化し、初心者でも再現性のある定量的結果が得られる技術を解説。発生生物学研究に有用です。

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コリーヌ・A・フェアチャイルドとケイティ・L・バーミリオンが、ニワトリ脳神経襞培養プロトコルの開発に参加してくださったことに感謝します。

<ol><li>Pla, P., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neural+border%3A+Induction%2C+specification+and+maturation+of+the+territory+that+generates+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">The neural border: Induction, specification and maturation of the territory that generates neural crest cells.</a> Developmental Biology. 444, 36-46 (2018).</li>
<li>Tang, W., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+lineage+analysis%3A+From+past+to+future+trajectory%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest lineage analysis: From past to future trajectory.</a> Development. 147 (20), (2021).</li>
<li>Piacentino, M. L., Li, Y., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial-to-mesenchymal+transition+and+different+migration+strategies+as+viewed+from+the+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Epithelial-to-mesenchymal transition and different migration strategies as viewed from the neural crest.</a> Current Opinion in Cell Biology. 66, 43-50 (2020).</li>
<li>McLennan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+cells+bulldoze+through+the+microenvironment+using+Aquaporin+1+to+stabilize+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Neural crest cells bulldoze through the microenvironment using Aquaporin 1 to stabilize filopodia.</a> Development. 147 (1), 185231(2020).</li>
<li>Carmona-Fontaine, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+fragment+C3a+controls+mutual+cell+attraction+during+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Complement fragment C3a controls mutual cell attraction during collective cell migration.</a> Developmental Cell. 21 (6), 1026-1037 (2011).</li>
<li>Giovannone, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slits+affect+the+timely+migration+of+neural+crest+cells+via+robo+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Slits affect the timely migration of neural crest cells via robo receptor.</a> Developmental Dynamics. 241 (8), 1274-1288 (2012).</li>
<li>Vermillion, K. L., Lidberg, K. A., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+protein+methylation+is+essential+for+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic protein methylation is essential for neural crest migration.</a> Journal of Cell Biology. 204 (1), 95-109 (2014).</li>
<li>Yang, X., Li, J., Zeng, W., Li, C., Mao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elongator+Protein+3+%28Elp3%29+stabilizes+Snail1+and+regulates+neural+crest+migration+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Elongator Protein 3 (Elp3) stabilizes Snail1 and regulates neural crest migration in Xenopus.</a> Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).</li>
<li>Gonzalez Malagon, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+synthase+kinase+3+controls+migration+of+the+neural+crest+lineage+in+mouse+and+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus.</a> Nature Communications. 9 (1), 1-15 (2018).</li>
<li>Bhattacharya, D., Azambuja, A. P., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+promotes+neural+crest+migration+via+yap%2Ftead+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming promotes neural crest migration via yap/tead signaling.</a> Developmental Cell. 53 (2), 199-211 (2020).</li>
<li>Jacques-Fricke, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+NSD3-dependent+neural+crest+gene+expression+reveals+known+and+novel+candidate+regulatory+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Profiling NSD3-dependent neural crest gene expression reveals known and novel candidate regulatory factors.</a> Developmental Biology. 475, 118-130 (2021).</li>
<li>Bronner-Fraser, M., García-Castro, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+4+manipulations+of+neural+crest+cells+or+their+migratory+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 4 manipulations of neural crest cells or their migratory pathways.</a> Methods in Cell Biology. 87, 75-96 (2008).</li>
<li>Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+xenopus+laevis+neural+crest+for+in+vitro+explant+culture+or+in+vivo+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of xenopus laevis neural crest for in vitro explant culture or in vivo transplantation.</a> Journal of Visualized Experiments. (85), e51118(2014).</li>
<li>Malagon, S. G. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection%2C+culture+and+analysis+of+primary+cranial+neural+crest+cells+from+mouse+for+the+study+of+neural+crest+cell+delamination+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection, culture and analysis of primary cranial neural crest cells from mouse for the study of neural crest cell delamination and migration.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60051(2019).</li>
<li>Theveneau, E., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+crest+delamination+and+migration%3A+From+epithelium-to-mesenchyme+transition+to+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Neural crest delamination and migration: From epithelium-to-mesenchyme transition to collective cell migration.</a> Developmental Biology. 366 (1), 34-54 (2012).</li>
<li>Conrad, G. W., Bee, J. A., Roche, S. M., Teillet, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+microscalpels+by+electrolysis+of+tungsten+wire+in+a+meniscus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Fabrication of microscalpels by electrolysis of tungsten wire in a meniscus.</a> Journal of Neuroscience Methods. 50 (1), 123-127 (1993).</li>
<li>Hamburger, V., Hamilton, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+series+of+normal+stages+in+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Morphology%22%5BJournal%5D)">A series of normal stages in the development of the chick embryo.</a> Journal of Morphology. 88 (1), 49-92 (1951).</li>
<li>Gammill, L. S., Jacques-Fricke, B., Roffers-Agarwal, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryological+and+genetic+manipulation+of+chick+development%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryological and genetic manipulation of chick development.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, 75-97 (2019).</li>
<li>Vandekerckhove, J., Deboben, A., Nassal, M., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phalloidin+binding+site+of+F-actin%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The phalloidin binding site of F-actin.</a> The EMBO Journal. 4 (11), 2815-2818 (1985).</li>
<li>Bronner-Fraser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+early+stages+of+trunk+neural+crest+migration+in+avian+embryos+using+monoclonal+antibody+HNK-1%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the early stages of trunk neural crest migration in avian embryos using monoclonal antibody HNK-1.</a> Developmental Biology. 115 (1), 44-55 (1986).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Soille, P., Vincent, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+watersheds+in+digital+pictures+via+flooding+simulations%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+Communications+and+Image+Processing+%2790%3A+Fifth+in+a+Series%22%5BJournal%5D)">Determining watersheds in digital pictures via flooding simulations.</a> Visual Communications and Image Processing '90: Fifth in a Series. (1360), 240-250 (1990).</li>
<li>Haupt, A., Minc, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cells+sense+their+own+shape+-+mechanisms+to+probe+cell+geometry+and+their+implications+in+cellular+organization+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">How cells sense their own shape - mechanisms to probe cell geometry and their implications in cellular organization and function.</a> Journal of Cell Science. 131 (6), (2018).</li>
<li>Ezin, M., Fraser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+11+time-lapse+imaging+of+the+early+avian+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 11 time-lapse imaging of the early avian embryo.</a> Methods in Cell Biology. 87, 211-236 (2008).</li>
<li>Kulesa, P. M., Bailey, C. M., Cooper, C., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+ovo+live+imaging+of+avian+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">In ovo live imaging of avian embryos.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 5 (6), (2010).</li>
<li>McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+the+neural+crest+cell+epithelial-to-mesenchymal+transition+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Live imaging of the neural crest cell epithelial-to-mesenchymal transition in the chick embryo.</a> Methods in Molecular Biology. 2179, 107-114 (2021).</li>
<li>Gustafson, C. M., Roffers-Agarwal, J., Gammill, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chick+cranial+neural+crest+cells+release+extracellular+vesicles+that+are+critical+for+their+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Chick cranial neural crest cells release extracellular vesicles that are critical for their migration.</a> Journal of Cell Science. , (2022).</li>
<li>Williams, R., Sauka-Spengler, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+ovo+electroporation+of+early+chicken+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ex ovo electroporation of early chicken embryos.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100424(2021).</li>
<li>Moulton, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+morpholinos+to+control+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Nucleic+Acid+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Using morpholinos to control gene expression.</a> Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry. 68 (1), 4-30 (2017).</li>
<li>Gandhi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-plasmid+approach+for+genome+editing+coupled+with+long-term+lineage+analysis+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A single-plasmid approach for genome editing coupled with long-term lineage analysis in chick embryos.</a> Development. 148 (7), (2021).</li>
<li>Williams, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+the+Global+Neural+Crest+Gene+Regulatory+Network+In+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of the Global Neural Crest Gene Regulatory Network In Vivo.</a> Developmental Cell. 51 (2), 255-267 (2019).</li>
</ol>

著者には利益相反はありません。

ここで説明する技術は、ニワトリの神経襞を分離し、それらをメッキして移動性頭蓋NCCの培養物を作成する適応可能な方法を提供します。これらの培養物は、ニワトリNCCの移動および形態の容易な分析のための単純化された2D条件を提供し、卵子イメージング法におけるより技術的に困難なものを補完することができる24、25、26。このin vitro法は比較的単純ですが、一貫した結果は高品質の卵と試薬に依存します。さらに、培養物に固有の変動性のために、再現性には実験の繰り返しと定量が必要です。
FNへの神経襞の接着は、培養におけるNCCの移動に不可欠です。時折、外植片が適切に接着せず、神経襞が浮遊するか、移動性NCCをまったくまたはほとんど生成しません。これは、脳神経襞が切断された側を下にして着地しない場合に発生する可能性があります。インキュベーション前に培養容器内の外植片の向き...

神経堤細胞(NCC)は、脊椎動物の胚の一過性細胞集団です。NCCは神経板の境界で特定され、背側神経管1から移行するために上皮間葉転換(EMT)を受けます。EMT後、NCCは胚全体に広範囲に分散し、最終的には頭蓋顔面骨格、心臓の流出路、末梢神経系の大部分など、さまざまな構造を分化させて寄与します2。細胞極性、細胞骨格、および接着特性の変化は、遊走性細胞集団から遊走性細胞集団へのこのシフトの根底にあります3。NCC EMTと遊走を研究することで、細胞の運動性の基本的なメカニズムについての洞察が得られ、先天性欠損症と癌転移を予防および治療するための取り組みに情報を提供します。
in vivo分析は、胚の文脈でNCC発生プロセスを理解するために不可欠ですが、in vitroメソッドは、追加の実験手段を容易にする視覚的および物理的なアクセシビリティを提供します。単純化された2D環境では、NCC形態、細胞骨格構造、および移動距離を評価できます。さらに、運動性NCCの移動行動に対する遺伝的または可溶性因子の摂動の影響を分析することができます4、5、6、7、8、9、10。さらに、単離された遊走性または移動性NCCを収集、プールし、プロテオミクス、トランスクリプトミクス、およびエピゲノムプロファイリングを通じてNCCの発生調節を研究するためのハイスループット方法論に使用することができます7,11。さまざまな発生モデル生物から頭蓋NCCを調製する方法が利用可能である12,13,14が利用可能ですが、この記事では、ニワトリ胚から頭蓋NCCを培養することを最初に学んだ人のためのアプローチの仕組みを示します。
現在のプロトコルは、ニワトリ頭蓋NCC培養物を調製するための汎用性の高い技術を記載しています(図1)。NCCは外植された神経襞から培養基質に容易に移動するため、ニワトリNCCは胚組織から自然に分離し、初代培養物が容易に生成されます。中脳NCCが脳神経襞から一斉に移動すると(体幹15の細胞ごとの層間剥離とは対照的に)、これらの培養物は主に遊走性脳神経堤細胞で構成され、最初の神経襞切除は遊走性NCCの収集方法を提供します。ニワトリ脳神経襞を解剖して培養するための基本的な方法を詳述し、この方法のさまざまな用途とバリエーションの提案を提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig01v2.jpg"> 図1:ニワトリ脳神経襞培養プロトコルの概略図。 (A,B)脳神経襞(青色で輪郭が描かれている)は、5つの体節を持つニワトリ胚から切除されます(Aの背側図で示されています)。灰色の帯、心臓の三日月。(C)フィブロネクチンにプレーティングすると、遊走性神経堤細胞が神経襞から出現し、基質上に分散する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63799/63799fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>ZEN 3.0 SRソフトウェアによって制御されるLSM710共焦点スキャンヘッドを搭載したAxioObserver&nbsp;</td><td>ツァイスは</td><td></td><td>アルファプランアポクロマート100x / 1.46オイルDIC M27対物</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>チャンバーディッシュ(ガラス底、シングルまたは分割)</td><td>MatTekを使用しました。セルビス</td><td>P35G-1.5-14-C(MatTek)X000NOJQGX(セルビス) X000NOK1OJ(セルビス)</td><td>シングルチャンバー35 mmまたは4チャンバー35 mm</td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>カロライナバイオロジカルサプライカンパニー</td><td>633029、633031、633033、633035、633037</td><td>円、0.13&ndash;厚さ0.17 mm、直径12-25 mmで利用可能&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>11320033</td><td>L15 培地</td></tr>用<tr><td>代替品 卵インキュベーター</td><td>スポーツマン</td><td>1502</td><td></td></tr><tr><td>FBS&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>CB-40008A</td><td></td></tr><tr><td>フィルターペーパー</td><td>Whatman</td><td></td><td>グレード 3MM クロマトグラフィー</td></tr><tr><td>鉗子 (鈍い)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック;トーマス・サイエンティフィック</td><td>08-890 (フィッシャー);1141W97 (Thomas)</td><td></td></tr><tr><td>鉗子 (細)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Dumont #5</td></tr><tr><td>Image J</td><td>https://fiji.sc/</td><td></td> <td>フリー画像解析ソフト</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>L15 media</td><td>Invitrogen</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>封入剤 (Vectashield または ProLong Gold)</td><td>Vector Laboratories;サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H-1700(ベクタシールド);P36930 (ProLong Gold)</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Life Technologies</td><td>15140-148</td><td>10,000 Units/mL ペニシリン; 10,000 mg/mL ストレプトマイシン</td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>VWR (または同等品)</td><td></td> <td>60 mm、100 mm</td></tr><tr><td>ファロイディン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td>複数のフルロフォアが利用可能</td></tr><tr><td>ピンホルダー</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>26016-12</td><td>タングステン針用(春ハサミの代替品)</td></tr><tr><td>はさみ(解剖)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14061-10</td><td></td></tr><tr><td>スプリングハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>15000-08</td><td>2.5 mm刃先(タングステン針の代替品)</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Krayden</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>フィルターSigma-Aldrich</td><td>SLGVM33RS</td><td>Millex-GVシリンジフィルターユニット、0.22 & マイクロ;m、PVDF、33mm、ガンマ線滅菌</td></tr><tr><td>組織培養皿</td><td>Sarstedt</td><td>83-3900</td><td>バルク神経折り畳み培養用35mm培養皿</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>タングステンワイヤー</td><td>タングステン針の直径0.01インチ(スプリングハサミの代替品)</td>の<td>様々なソース</td><td></td></tr></tbody></table>

ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の作製と形態解析

Preparation and Morphological Analysis of Chick Cranial Neural Crest Cell Cultures

脊椎動物の発生中、神経堤細胞(NCC)は広範囲に移動し、頭蓋顔面骨格や末梢神経系などの構造に寄与するさまざまな細胞型に分化します。NCCの移動を3D胚の文脈で理解することは重要ですが、2D培養で遊走細胞を単離することで、可視化と機能特性評価が容易になり、胚研究を補完します。本プロトコルは、初代NCC培養物を生成するためにニワトリ脳神経襞を単離する方法を示す。遊走性NCCは、フィブロネクチンでコーティングされた基質に播種された神経襞の外植片から出現します。これにより、分散した付着性NCC集団が得られ、染色および定量的形態学的分析によって評価できます。この単純化された文化アプローチは適応性が高く、他の手法と組み合わせることができます。例えば、NCCの遊走および移動行動は、タイムラプスイメージングによって評価するか、または遺伝子発現の阻害剤または実験的操作(例えば、DNA、モルホリノ、またはCRISPRエレクトロポレーション)を含むことによって機能的に照会することができる。その汎用性のために、この方法は頭蓋NCC発達を調査するための強力なシステムを提供します。

本プロトコルの概要を 図1に示す。孵化した卵を開き、表面に胚を置いた卵黄を手袋をはめた手のひらにそっと注ぐことによって単離しました(図2A、B)。アルブミンを取り除いた後(図2C)、胚を囲む卵黄膜にろ紙フレームを適用して、卵黄膜が切断されるとこぼれ始める卵黄から胚を切断して持ち上げやすくしました(図2D、E)。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63799/63799fig02.jpg"> 図2:4〜7個の体節ヒニワトリ胚の分離。<...

この汎用性の高いプロトコルは、ニワトリ胚からの脳神経襞の切除による遊走性神経堤細胞(NCC)の単離について説明しています。プレーティングとインキュベーションを行うと、遊走性NCCが神経襞の外植片から出現し、単純化された2D環境での細胞形態と遊走の評価を可能にします。

During vertebrate development, neural crest cells (NCCs) migrate extensively and differentiate into various cell types that contribute to structures like ...

神経堤細胞は、胚の脳神経襞から、または培養中に配置されると遊走する。これは、細胞解離することなく初代遊走性神経堤細胞を単離するための便利な方法を提供する。神経堤の移動は通常、3次元の胚環境内で発生しますが、2次元の培養により、移動に関連するプロセスの視覚化と調査が可能になります。脳神経襞培養プロトコルは存在しますが、この方法ではトレーニングと生物固有の手順が必要です。このビデオは、ニワトリ脳神経襞培養の再現性のある調製を容易にする技術を示しています。初心者は、神経襞の解剖とメッキ、および培養結果の評価に苦労することがよくあります。解剖ガイドラインに従い、ここで説明する形態測定解析を適用することで、一貫性のある定量的な結果を得ることができます。はじめに、受精卵を38°Cの加湿インキュベーター内の直立位置に置きます。インキュベーターから卵を取り除いた後、70%エタノールを徹底的にスプレーしてそれらを乾燥させることによって殻を消毒します。培養物の固定と染色には、マルチウェル組織培養皿に入れたガラスカバースリップを使用し、ウェルの底を覆うのに十分なフィブロネクチン溶液をピペットで入れます。次に、蓋を元に戻し、プレートをフィブロネクチン溶液とともに、38°Cの加湿インキュベーター内で少なくとも1時間インキュベートしながら神経襞を解剖します。鈍い鉗子を使用して、卵の長さの1/4〜1/3で殻に小さな穴を開けます。鈍い鉗子を小さな穴に慎重に挿入し、卵黄を乱さないようにします。次に、卵の周りの卵殻を切り取り、卵殻の上部を取り除き、胚を分離のために配置します。閉じた鈍い鉗子の平らな端をそっと使用して、胚を覆う卵黄の表面の余分なアルブミンを拭き取って、胚を準備します。鉗子を使用して、胚をフレームのウィンドウに入れた状態で、胚の上にろ紙サポートフレームを置きます。ろ紙をそっと押し下げて卵黄に付着させます。ろ紙フレームの外側を解剖ハサミで切ります。鉗子またははさみの先端を使用してフレームの端をつかみ、胚を卵黄からそっと持ち上げます。紙枠を下にして胚を、ペンストレプトでリンガーで満たされた60または100ミリリットルのペトリ皿に入れます。RNAまたはタンパク質感受性の下流アプリケーションのために胚を収集する場合は、胚の皿を氷の上に置いてください。リンゲルのペン連鎖球菌溶液を含むきれいな皿に胚を移します。胚をゆっくりと前後に振って、視界を覆い隠す卵黄を取り除き、リンガーのペンストレプト液を交換するか、濁った場合は新鮮な皿に移します。解剖顕微鏡下で胚の背側とフレーム側を上にして配置します。胚を紙枠の上に残して、胚を引き伸ばして所定の位置に保持します。次に、鉗子を使用して神経襞を露出させながら、卵子膜を取り除きます。拡大する視神経小胞への組織尾側と、菱形の狭窄が現れ始めたばかりの後脳への吻側を含めます。スプリングハサミを使用して、中脳神経ひだを慎重に切除します。神経管と非神経外胚葉の汚染を最小限に抑えて神経襞の最背側を切除し、P20ピペッターまたは卵黄リンゲルのペンストレップ溶液ですすいだ滅菌ガラスパスツールピペットを使用して、神経襞をリンゲルのペンストレプト液を含むきれいな皿に移します。追加の折り目を解剖しながら、集めた折り目を氷の上に保管します。培養皿をインキュベーターから取り出した後、ピペッターまたはパスツールピペットを使用して、カバースリップ、皿、またはウェルからフィブロネクチン溶液を除去します。フィブロネクチンコーティングされた基質をリンゲルのペンストレプト溶液ですすいだ後、適切な量の完全培養培地を皿またはウェルに加えます。プラスチックをブロックし、組織が付着するのを防ぐには、P20またはP200ピペッターを使用し、卵黄リンガーのペンストレプト溶液でピペットチップをすすぎます。次に、孤立した神経襞をフィブロネクチンでコーティングされたカバースリップの中心に向かって移し、リンゲルのペン連鎖球菌溶液をできるだけ少なくするように注意します。外植体を10〜15分間落ち着かせた後、神経襞をメッキした培養皿をゆっくりと慎重に運び、摂氏38度の加湿チャンバーに入れます。パスツールピペットで培地を取り出し、フィルター滅菌PBSでウェルをすすぎます。4%パラホルムアルデヒドを加え、室温で15分間プラットフォームシェーカーに保ちます。インキュベーションの最後に、パラホルムアルデヒドを除去し、ウェルをPBSで3回すすぎ、5%血清を含むPBSTを加えます。次に、30マイクロリットルの200ナノモルのオレゴングリーンコンジュゲートファロイジンを、各カバースリップの滑らかな表面にピペットで貼り付けます。一対の鉗子を使用して、5%血清を含むPBSTからカバースリップを取り外し、細胞の向きが上を向くようにします。カバースリップの端を繊細なタスクワイパーに短時間触れて、余分な液体を吸い取ります。各カバースリップセル側を下にして希釈ファロイジンの滴の上に静かに置き、室温で30分間インキュベートします。培養期間が経過したら、カバースリップを染色液から持ち上げて培養皿に戻し、細胞側が上になるように裏返します。カバースリップをPBSTで覆い、プラットフォームシェーカーに10分間置き、カバースリップを覆い、暗闇の中で保ちます。PBSTを取り外し、カバースリップの洗浄を2回繰り返して、合計3回の10分間の洗浄を行います。封入剤を顕微鏡スライドに1滴入れます。カバースリップセルを下にして、カバースリップをゆっくりと斜めに下ろしてマウントメディアに取り付け、気泡が発生しないようにし、メディアをセットしてからイメージングします。最後に、染色された細胞を画像化し、TIFFファイルとしてエクスポートします。神経堤細胞は、インキュベーション後3〜4時間以内に接着性神経襞外植片から出現し始め、約20時間後に遊走が完了しました。遊走性神経堤細胞をHNK-1を用いて標識したところ、ほとんどの細胞がHNK-1陽性であるように見えた。遊走した神経堤細胞を、糸状アクチンをファロイジンで染色することによって可視化した。ファロイジン染色された細胞の画像をImageJを用いて処理し、細胞が白背景に黒く見える閾値画像を生成した。閾値画像を解析し、様々な測定値を対照的な棒グラフまたはバイオリンプロットで表示した。例えば、分析された69個の細胞の平均面積は約802.11平方マイクロメートルであり、60.27から2、664.53平方マイクロメートルの範囲であった。真円度はセルの突出性を反映し、0.101から0.875の範囲です。低い値は細長い形状を示し、値 1 は完全な円を示します。ほとんどの細胞は細長い形を呈しており、これはバイオリンプロットで最も簡単に見られます。この分野の遊走性神経堤細胞の平均アスペクト比は約2.13であり、アスペクト比が1は対称的な形状を示す。慎重な切除と外植片のメッキは、培養を成功させるために重要です。神経襞をカット面を下にして10〜15分間落ち着かせてから、ゆっくりとインキュベーターに移して接着を促します。これらの技術のバリエーションには、培養前の一過性の遺伝子操作やインキュベーション中のタイムラプスイメージングなどがあります。さらに、このプロトコルは、オミクスレベルの分析のために遊走性および遊走性の神経堤細胞集団の収集を可能にします。

preparation-morphological-analysis-chick-cranial-neural-crest-cell

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

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このプロトコルは、神経堤細胞のヒアルロナンに富む細胞外マトリックスへのin vivo移動に関与する分子の機能解析に適したin...

インビトロ ヒアルロン酸に富む細胞外マトリックスが神経堤細胞遊走に及ぼす影響の検討

マウス胚性幹細胞から脳神経堤細胞を作製するための再現性のあるサイズのニューロスフェアを生成するための三次元(3D) in vitro...

多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル

学ぶ ニワトリ頭蓋神経堤細胞の分離培養と形態解析法。2次元培養系で細胞遊走を可視化し、初心者でも再現性のある定量的結果が得られる技術を解説。発生生物学研究に有用です。

ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の作製と形態解析

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