Name: 엽록소 형광 분석에 의한 광호흡 돌연변이체의 광합성 효율 평가 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T12:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: 배우세요 저CO₂ 처리와 엽록소 형광 분석을 이용한 광호흡 돌연변이체 고속 선별 방법을. 아라비도프시스 묘를 대상으로 광합성 양자수율을 측정하여 환경 스트레스 반응 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 루이지애나 이사회 (AWD-AM210544)의 자금 지원을 받았습니다.

1. 종자 준비 및 살균
알림: 종자 준비는 종자 흡수와 종자 살균으로 구성됩니다. 이러한 모든 단계는 멸균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행되어야한다는 점에 유의해야합니다. 필요한 모든 재료, 시약 및 성장 배지는 오토클레이브되어야 합니다( 재료 표 참조).
<ol><li>종자 흡수 및 층화 참고: 사용된 시드 라인은 plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) 및 와일드형(WT, Col-0)입니다.<ol><li>씨앗을 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 분주합니다. 층류 후드의 멸균 된 물에 씨앗을 흡수하고 어둠 속에서 4 ° C에서 2 일 동안 층화합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>종자 살균<ol><li>멸균 조건에서 50%(v/v) 표백제 용액 10mL를 준비하고 트윈 20 약 20μL를 추가합니다. 종자 살균을 위해 흡수 된 종자에서 물을 제거하고 표백제 용액 1mL를 미세 원심 분리기 튜브에 넣고 실온에서 5 분 동안 배양합니다.</li>
		<li>피펫으로 표백제를 제거하십시오.</li>
		<li>씨앗을 멸균수 1mL로 헹구어 재현탁합니다. 씨앗이 바닥에 가라 앉으면 물을 제거하십시오. 1.6단계와 1.7단계를 7번 반복합니다.</li>
		<li>종자를 멸균 된 0.1 % 아가 로스 용액에 재현 탁시킨다.</li>
	</ol></li>
	<li>종자 도금<ol><li>증류수 500mL에 분말 5.43g을 첨가하여 비타민과 1.0g/L의 2-(N-모르포니오)에탄술폰산(MS)이 함유된 1L 부피의 Murashige & Skoog 기초 배지를 만듭니다. 수산화 칼륨 (KOH)을 사용하여 pH를 5.6에서 5.8 사이로 조정하십시오. 증류수를 사용하여 1L까지 채 웁니다.<ol><li>액체 용액을 500mL로 나누고 각 반쪽을 자석 교반 막대가 들어 있는 1L 플라스크에 넣습니다. 한천 분말 5g을 추가하여 각 플라스크에 대해 1% 한천 w/v 용액을 얻습니다.</li>
			<li>121°C 및 15psi에서 30분 동안 오토클레이브; 그런 다음 천천히 저으면서 실온에 두십시오. 냉각되면 MS 한천 25mL를 정사각형 페트리 접시에 붓습니다. 굳어지도록 허용하십시오. 참고: 이 Murashige & Skoog 기초 배지 플레이트에는 비타민이 함유된 1% MS 배지와 테스트 돌연변이체 배양을 위한 1% 한천이 포함되어 있습니다.</li>
		</ol></li>
		<li>면도날로 200μL 피펫 팁을 자릅니다. 200μL 마이크로피펫을 사용하여 정사각형 MS 플레이트(그림 1)의 각 테스트 돌연변이체 또는 유전자형(1cm2 정사각형)에 대해 지정된 정사각형 그리드의 중앙에 하나의 시드를 놓습니다. 참고: 1cm x 1cm 정사각형 그리드는 묘목 사이의 균일한 거리를 유지하고 겹치는 것을 방지하는 데 도움이 되며, 이는 나중에 형광 이미징 및 분석에 중요합니다.</li>
		<li>씨앗이 도금되면 뚜껑 주위에 수술 용 테이프로 감싸서 밀봉하고 아래 설명 된 조건으로 성장 챔버에 놓습니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. 식물 성장 및 낮은CO2 처리
<ol><li>120 μmol·m-2 s-1의 8시간 빛 주기와 18 °C에서 16시간의 어둠 속에서 20°C에서 7-9일 동안 식물을 재배합니다. 6 일째에 식물을 확인하여 이미징하기에 충분히 큰지 확인하십시오. 도금 후 8 일째에 식물을 낮은CO2에 노출시킵니다.</li>
	<li>낮은 CO2 처리<ol><li>7-9 일 후, 주변 성장 챔버 조건에서 8 개의 플레이트 중 4 개를 20 ° C의 광호흡 조건, 200 μmol · m-2 s-1의 연속 광 수준 및 12 시간 동안 낮은 CO 2에 놓습니다.</li>
		<li>용기의 바닥에 100g의 소다 석회를 놓은 밀폐 된 투명 용기를 사용하여 낮은 CO2 조건을 구성하십시오. 용기를 대조군과 동일한 성장 챔버 내에 놓습니다. 제어 플랜트를 120 시간 동안 주변 CO 2에서2 μmol · m-1 s-1미만으로 유지하십시오.</li>
	</ol></li>
</ol>3. 형광 이미징 시스템 구성
<ol><li>형광 이미징 시스템에서 고정된 거리에 카메라 아래 중앙에 테스트 플레이트(섹션 1 및 섹션 2에 따라 준비됨)를 놓습니다.</li>
	<li>계측기 소프트웨어 내에서 라이브 창 으로 이동하고 깜박임 상자를 선택하여 비화학선 측정 플래시를 켭니다.</li>
	<li>완전하고 선명한 이미지가 표시될 때까지 확대/축소 및 초점 도구를 클릭합니다. 이를 위해 무대 나 선반을 사용하여 식물과 카메라 사이의 거리를 조정하십시오. 전체 실험 동안 확대/축소, 초점 및 카메라와의 거리를 일정하게 유지합니다.</li>
	<li>El. 셔터 값을 0으로 설정하고 감도를 조정하여 200-500 디지털 단위 범위의 형광 신호를 얻습니다. 참고: 셔터 값(0-1)이 낮을수록 측정 플래시가 무광체가 되고 값(2)이 높을수록 이미지 해상도가 향상됩니다.</li>
	<li>카메라 설정을 조정하는 데 사용된 것과 동일한 위치에 조도계를 놓습니다.</li>
	<li>라이브 창에서 슈퍼 상자를 선택하여 800ms 동안 지속되는 포화 펄스를 시작합니다. 매번 새 펄스가 있는지 확인란을 선택하는 것을 잊지 마십시오.</li>
	<li>슬라이더를 사용하여 조도계가 6,000-8,000 μmol·m−2s−1을 읽을 때까지 슈퍼 펄스의 상대 전력 백분율을 조정합니다.</li>
</ol>4. 양자 수율 프로그램 설계
<ol><li>이미징 시스템을 위한 표준 운영 도구를 가져옵니다. 기본값 포함 라이트.inc 포함 참고: 이 실험에서 참조용으로 사용된 프로그램 구문은 FluorCam 이미징 시스템용입니다.</li>
	<li>구성된 조명 설정에 따라 다음 전역 변수를 정의합니다. 셔터 = 0 민감도 = 40 슈퍼 = 65</li>
	<li>데이터 로깅을 위한 시간 단계를 포함합니다. TS = 20ms</li>
	<li>어두운 적응 상태에서 형광을 샘플링하여 Fo 측정값을 수집합니다. F0지속 시간 = 2초; F0기간 = 200ms; 참고: F0duration 은 어둠에 적응된 형광이 기록되는 시간 범위를 정의합니다. F0period 는 다크 적응 형광 측정이 반복되는 시간 간격을 정의합니다.</li>
	<li>Fo 측정값을 데이터 테이블에 기록합니다. <0,F0기간.. F0duration>=>mfmsub <0s>->checkpoint,"startFo" <F0기간 - F0기간>=>체크포인트,"엔드포"; 여기서 < , > 는 시간에 의해 인덱싱된 형광 값의 세트를 나타내고; =>는 측정값을 시스템 파일에 저장합니다. MFMSUB 는 실험에 대한 전체 데이터 세트를 나타냅니다. 체크포인트 는 startFo와 같은 특정 측정값의 데이터에 대한 하위 집합을 만듭니다.</li>
	<li>Fm 측정값을 수집하여 포화 펄스 후에 형광을 샘플링하여 저장한다. 펄스 지속 시간 = 960ms; ## a1=F0기간 + 40ms a2 = a1 + 480ms; <a1>=>SatPulse(PulseDuration); <a1 + 80ms, a1 + 160ms.a1 + 펄스 지속 시간>=>mfmsub <a1 + 펄스 지속 시간 + 80ms>=>mfmsub; <a2>=>체크포인트,"시작Fm" <a1 + 펄스 지속 시간 - 80ms>=>체크포인트,"endFm" <a2 + 80ms>=>체크포인트,"타임비주얼"; 여기서 a1 및 a2 는 포화 펄스와 샘플링 시간을 조정하는 변수입니다. a1 은 Fm 측정의 시작 시간을 나타내고; A2 는 펄스의 중간 시점 시간을 나타냅니다.</li>
</ol>5. 처리된 샘플의 양자 수율 측정
<ol><li>치료 직후, 어두운 적응을 위해 15 분 동안 알루미늄 호일로 판을 덮으십시오. 호일을 제거하여 펄스 진폭 수정 형광계로 광계 II의 양자 수율을 측정했습니다. 그런 다음 묘목 플레이트를 카메라 바로 아래에 놓고 GitHub 리포지토리에 있는 퀀텀 수율 프로토콜을 실행합니다.</li>
	<li>GitHub(https://github.com/South-lab/fluorescent-screen)에서 quantum_yield 프로토콜을 다운로드하거나 섹션 4에서 유사하게 설계된 프로그램을 사용합니다. 형광계의 소프트웨어를 사용하여 폴더 아이콘을 클릭하고 파일 위치로 이동하여 프로그램 파일을 엽니 다.</li>
	<li>빨간색 번개 아이콘을 클릭하여 양자 수율 프로그램을 실행합니다.</li>
	<li>프로토콜이 완료되면 사전 분석 창으로 이동합니다. 선택 도구를 사용하여 플레이트 이미지에서 각 묘목의 모든 픽셀을 강조 표시하여 플레이트를 개별 묘목으로 분할합니다. 배경 제외를 클릭하여 강조 표시된 배경 픽셀을 제거하고 묘목 영역만 남깁니다.</li>
	<li>분석을 클릭하여 플레이트 이미지의 각 묘목에 대한 형광 데이터를 생성합니다. 형광 값 범위를 수동으로 조정하여 모든 플레이트에서 일관된 최소값과 최대값을 표시합니다.</li>
	<li>클릭 수치-평균 탭에서 실험 | 수출 | 숫자. 모든 데이터 및 열별을 선택하고 확인을 클릭하여 각 묘목에 대한 QY 측정값이 포함된 텍스트 파일을 생성합니다.</li>
</ol>6. 데이터 파일 열기
<ol><li>분석을 위해 스프레드시트에서 텍스트 파일을 엽니다. 영역 번호, 픽셀 크기, Fm, Ft, Fq 및 QY를 나타내는 제목 중에서 핵심 유전자형(WT 또는 테스트 돌연변이체) 및 QYmax에 대한 영역 번호를 식별합니다. 유의성을 확인하기 위해 야생형에 대해 쌍별 t-검정을 수행합니다. 데이터는 p-값이 0.05 미만일 때 유의하게 다른 것으로 해석됩니다.</li>
</ol>

<ol><li>Peterhansel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Photorespiration.</a> Arabidopsis Book. 8, 0130(2010).</li>
<li>Bordych, C., Eisenhut, M., Pick, T. R., Kuelahoglu, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-expression+analysis+as+tool+for+the+discovery+of+transport+proteins+in+photorespiration%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Co-expression analysis as tool for the discovery of transport proteins in photorespiration.</a> Plant Biology. 15 (4), 686-693 (2013).</li>
<li>Eisenhut, M., Pick, T. R., Bordych, C., Weber, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+closing+the+remaining+gaps+in+photorespiration--the+essential+but+unexplored+role+of+transport+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Towards closing the remaining gaps in photorespiration--the essential but unexplored role of transport proteins.</a> Plant Biology. 15 (4), 676-685 (2013).</li>
<li>Walker, B. J., VanLoocke, A., Bernacchi, C. J., Ort, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+costs+of+photorespiration+to+food+production+now+and+in+the+future%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">The costs of photorespiration to food production now and in the future.</a> Annual Review of Plant Biology. 67 (1), 107-129 (2016).</li>
<li>South, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acid+sodium+symporter+BASS6+can+transport+glycolate+and+is+involved+in+photorespiratory+metabolism+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Bile acid sodium symporter BASS6 can transport glycolate and is involved in photorespiratory metabolism in Arabidopsis thaliana.</a> Plant Cell. 29 (4), 808-823 (2017).</li>
<li>Pick, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGG1%2C+a+plastidic+glycolate+glycerate+transporter%2C+is+required+for+photorespiration+and+defines+a+unique+class+of+metabolite+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">PLGG1, a plastidic glycolate glycerate transporter, is required for photorespiration and defines a unique class of metabolite transporters.</a> Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America. 110 (8), 3185-3190 (2013).</li>
<li>Kuhnert, F., Schlüter, U., Linka, N., Eisenhut, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+proteins+enabling+plant+photorespiratory+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Plants%22%5BJournal%5D)">Transport proteins enabling plant photorespiratory metabolism.</a> Plants. 10 (5), 880(2021).</li>
<li>Badger, M. R., Fallahi, H., Kaines, S., Takahashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorophyll+fluorescence+screening+of+Arabidopsis+thaliana+for+CO2+sensitive+photorespiration+and+photoinhibition+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Funct+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Chlorophyll fluorescence screening of Arabidopsis thaliana for CO2 sensitive photorespiration and photoinhibition mutants.</a> Funct Plant Biology. 36 (11), 867-873 (2009).</li>
<li>Ogawa, T., Sonoike, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+mutants+using+chlorophyll+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Screening of mutants using chlorophyll fluorescence.</a> Journal of Plant Research. 134 (4), 653-664 (2021).</li>
<li>Kleffmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+chloroplast+proteome+reveals+pathway+abundance+and+novel+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana chloroplast proteome reveals pathway abundance and novel protein functions.</a> Current Biology. 14 (5), 354-362 (2004).</li>
<li>Hempel, J. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Molecular+characterization+of+the+plastid-localized+ABC+protein+TAP1+in+Arabidopsis+thaliana%22">Molecular characterization of the plastid-localized ABC protein TAP1 in Arabidopsis thaliana</a>. , University of Stavanger. Ph.D. thesis (2018).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 재정적 이해 관계나 이해 상충이 없습니다.

이 백서에 설명된 실험 방법에는 몇 가지 장점과 한계가 있습니다. 한 가지 장점은이 방법이 많은 식물 묘목을 스크리닝 할 수 있다는 것입니다., 도금 및 성장 과정에서 식물 매체 플레이트의 오염을 방지하기 위해 몇 가지 예방 조치를 취해야합니다. 따라서 애기장대 판을 수술 용 테이프로 밀봉하는 것이 중요합니다. 이 실험의 또 다른 장점은 이전에 발표 된 작업8에 비해 12 시간의 광호흡 스트레스 기간이 짧다는 것입니다. 치료 시간의 감소는 WT와 선택된 돌연변이체 사이의 Fv/Fm의 차이를 더 잘 구별하기 위한 것이었다. 치료 시간은 돌연변이 균주에서의 표현형의 중증도 및 실험 셋업에서의CO2 의 수준에 따라 변화될 필요가 있을 수 있다. 그러나 한 가지 제한 사항은 이 방법을 사용하려면 형광계가 측정하고 Fv/Fm 값을 계산할 수 있을 만큼 충분히 큰 잎 영역이 필요하다는 것입니다. 테스트된 묘목의 초기 성장 시간을 조정하면 형광계 이미저가 이미징 중에 잎이 겹치지...

농부의 밭에서 흔히 볼 수있는 비 생물 적 스트레스 조건은 광합성 효율을 감소시켜 작물 수확량에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. 열파, 기후 변화, 가뭄 및 토양 염분과 같은 해로운 환경 조건은 CO2 가용성을 변경하고 높은 빛 스트레스에 대한 식물의 반응을 감소시키는 비 생물 적 스트레스를 유발할 수 있습니다. 가장 큰 두 개의 육상 탄소 플럭스는 식물 성장과 작물 수확량에 필수적인 광합성과 광호흡입니다. 이러한 과정에 관여하는 많은 중요한 단백질과 효소는 실험실 조건에서 특성화되었으며 유전 수준1에서 확인되었습니다. 광합성과 광호흡을 이해하는 데 많은 진전이 있었지만 식물 세포 기관 간의 수송을 포함한 많은 단계가 특성화되지 않은 상태로 남아 있습니다 2,3.
광합성 후 식물에서 두 번째로 큰 탄소 플럭스 인 광호흡은 효소 Rubisco가 이산화탄소 대신 산소를 리불 로스 1,5 비스 포스페이트 (RuBP)에 고정시켜 억제 화합물 2- 포스 포 글리콜 레이트 (2PG)1. 2PG의 억제 효과를 최소화하고 이전에 고정 된 탄소를 재활용하기 위해 C3 식물은 광호흡의 다중 세포 기관 과정을 진화 시켰습니다. 광호흡은 2PG의 두 분자를 3-포스포글리세레이트(3PGA)의 한 분자로 변환하여 C3 탄소 고정 주기1에 다시 들어갈 수 있습니다. 따라서 광호흡은 75PG 생성에서 이전에 고정 된 탄소의 2 % 만 변환하고 그 과정에서 ATP를 소비합니다. 결과적으로, 광호흡 과정은 물 가용성 및 성장기 온도에 따라 광합성 과정에서 상당한 10%-50% 드래그입니다4.
광호흡에 관여하는 효소는 수십 년 동안 연구 초점의 영역이었지만 과정 5,6,7에 최소 25개의 수송 단계가 관련되어 있음에도 불구하고 유전적 수준에서 소수의 수송 단백질만 특성화되었습니다. 광호흡 과정에서 생성 된 탄소의 이동에 직접 관여하는 두 가지 수송 단백질은 색소체 글리콜 레이트 / 글리세 레이트 수송 체 PLGG1과 담즙산 나트륨 symporter BASS6이며, 둘 다 엽록체 5,6에서 글리콜 레이트의 수출에 관여합니다.
주변 [CO2]하에서, 루비스코는 산소 분자를 시간의 약 20%의 RuBP에 고정시킨다1. 식물이 낮은 [CO2]에 노출되면 광호흡 속도가 증가하여 낮은 [CO2]가 높은 광호흡 스트레스 하에서 중요할 수 있는 돌연변이를 테스트하기에 이상적인 환경이 됩니다. 24시간 동안 낮은CO2 하에서 추가적인 추정 엽록체 수송 단백질 T-DNA 라인을 테스트하고 엽록소 형광의 변화를 측정하여 광호흡 돌연변이 표현형5를 입증한 bass6-1 식물 라인을 식별했습니다. 추가 특성화는 BASS6가 엽록체의 내막에있는 글리콜 레이트 수송 체임을 입증했습니다.
이 논문은 엽록체 막 내에 위치한 추정 수송 단백질 목록에서 나온 BASS6를 광호흡 수송체로 식별하기 위해 처음에 사용 된 것과 유사한 프로토콜을 자세히 설명합니다.8 이 프로토콜은 열과 같은 다양한 비 생물 적 스트레스 하에서 광합성 효율을 유지하는 데 중요한 유전자를 식별하는 방법으로 Arabidopsis T-DNA 돌연변이 체 또는 EMS 생성 돌연변이 식물을 특성화하는 고 처리량 실험에 사용될 수 있습니다. 높은 가벼운 스트레스, 가뭄 및 CO2 가용성. 엽록소 형광을 이용한 식물 돌연변이체 스크리닝은 1차 대사에 중요한 유전자를 신속하게 식별하기 위해 과거에 사용되어왔습니다9. Arabidopsis 게놈의 30 %가 알려지지 않았거나 잘 특성화되지 않은 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하고 있기 때문에 광합성 효율의 스트레스 유도 분석은 돌연변이 식물10에서 통제 된 조건에서 관찰되지 않은 분자 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 이 방법의 목표는 낮은CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡 경로의 돌연변이체를 확인하는 것이다. 우리는 낮은CO2에 노출 된 후 광호흡을 방해하는 돌연변이를 확인하는 방법을 제시합니다. 이 방법의 장점은 비교적 짧은 시간에 수행 할 수있는 묘목에 대한 고 처리량 스크리닝이라는 것입니다. 비디오 프로토콜 섹션은 종자 준비 및 살균, 식물 성장 및 낮은CO2 처리, 형광 이미징 시스템의 구성, 처리된 샘플의 양자 수율 측정, 대표 결과 및 결론에 대한 세부 정보를 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>종자 살균용</td> <td>1.5mL 미세 원심분리기 튜브</td><td>VWR</td><td>10810-070</td> 용기</tr><tr><td>아가로스</td><td>VWR</td><td>9012-36-6</td><td>분말 도금의 용이성을 위해 종자를 현탁하는 데 사용되는 화학 물질</td></tr><tr><td><abcb26>)종자(abcb26/em)</td><td>ABRC, TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문</td><td>SALK_085232</td><td>실험 그룹으로</td></tr> <tr><td>사용되는 애기장대 종자Arabidopsis thaliana 씨앗 (plgg1-1)</td><td>ABRC, TAIR www.arabidopsis.org 를 통해 주문됨</td><td></td><td>SALK_053469C 부모 애기장대 씨앗&nbsp;</td></tr><tr><td>Arabidopsis thaliana seeds (WT)</td><td>ABRC, TAIR www.arabidopsis.org</td><td>Col-0</td><td>애기장대 야생형 종자를 통해 주문, 대조군으로 사용</td></tr><tr><td>&nbsp; 표백제&nbsp;</td><td>Clorox</td><td>일반 표백제&nbsp;</td><td>종자를 살균하는 데 사용되는 화학 물질</td></tr><tr><td>Carbolime absorbent</td><td>Medline products</td><td>S232-104-001</td><td>CO2 absorbent</td></tr><tr><td>Closed FluorCam</td><td>Photon Systems Instruments</td><td>FC 800-C</td><td>Fluorescence Imager</td></tr><tr><td>FluoroCam FC 800-C</td><td>Photon Systems Instruments</td><td>Closed FluorCam FC 800-C/1010-S</td><td>Fluorescence Imager</td></tr><tr><td>FluoroCam7</td><td>Photon Systems Instruments</td><td>Closed FluorCam FC 800-C/1010- S</td><td>형광 이미지 분석 소프트웨어</td></tr><tr><td>Gelzan (식물 한천)</td><td>Phytotech labs</td><td>71010-52-1</td><td>화학 물질은 MS 매체를 플레이트로 고형화하는 데 사용됩니다&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 플라스크 1 L</td><td>Fisherbrand</td><td>FB5011000</td> 식물 Murashige & 식물을 재배하는 데 사용되는 MS 미디어 성장 챔버 caron 7317-50-2 성장 챔버를 <td>만들고 오토 클레이브하기위한 용기</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>;<tr><td> Skoog Basal Medium with 비타민 & 1.0 g/L MES(MS)</td><td>파이토텍 랩스</td><td>M5531&nbsp;</td><td>애기장대 묘목을 위한 성장 배지&nbsp;</td></tr><tr><td>수산화칼륨 (KOH)</td><td>Phytotech labs</td><td>1310-58-3</td>은 pH 조정 스파이더 라이트<td>를 위한 1M 솔루션으로 제조</td></tr><tr><td></td> 광 분석에 사용되는 <td>Mean Well Enterprises</td><td>XLG-100-H-AB</td><td>라이트를 의미합니다&nbsp;</td></tr><tr><td>그리드가 있는 사각 페트리 접시, 멸균</td><td>Simport Scientific</td><td>D21016</td>은 <td>아라비도시스 묘목용 MS 미디어를 보관하는 데 사용되며,</td></tr><tr><td>수술 테이프</td>는 <td>3M</td><td>1530-1</td><td>테이프로 플레이트를 밀봉하는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>20</td><td>biorad</td><td>&nbsp; 9005-64-5</td><td>종자 살균을 돕는 데 사용되는 계면 활성제</td></tr></tbody></table>

엽록소 형광 분석에 의한 광호흡 돌연변이체의 광합성 효율 평가

Evaluation of Photosynthetic Efficiency in Photorespiratory Mutants by Chlorophyll Fluorescence Analysis

광합성과 광호흡은 식물의 1차 대사에서 가장 큰 탄소 플럭스를 나타내며 식물 생존에 필요합니다. 광합성과 광호흡에 중요한 많은 효소와 유전자는 수십 년 동안 잘 연구되어 왔지만 이러한 생화학 적 경로의 일부 측면과 여러 세포 하 과정과의 혼선은 아직 완전히 이해되지 않았습니다. 식물 대사에 중요한 유전자와 단백질을 확인한 많은 작업은 자연 및 농업 환경에서 광합성과 광호흡이 어떻게 기능하는지 가장 잘 나타내지 않을 수있는 고도로 통제 된 환경에서 수행되었습니다. 비생물적 스트레스가 광합성 효율을 손상시킨다는 점을 고려할 때, 비생물적 스트레스와 광합성에 미치는 영향을 모두 모니터링할 수 있는 고처리량 스크린의 개발이 필요합니다.
따라서, 우리는 엽록소 형광 분석 및 낮은CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡에서 역할을 하는 특성화되지 않은 유전자를 식별할 수 있는 비생물적 스트레스로 인한 광합성 효율의 변화를 스크리닝하는 비교적 빠른 방법을 개발했습니다. 이 논문은 애기장대 탈리아나에서 전달된 DNA(T-DNA) 녹아웃 돌연변이체의 광합성 효율 변화를 연구하는 방법을 설명합니다. 동일한 방법을 에틸 메탄술포네이트(EMS) 유도 돌연변이체 스크리닝 또는 억제기 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 이 방법을 활용하면 식물 1 차 대사 및 비 생물 적 스트레스 반응에 대한 추가 연구를위한 유전자 후보를 식별 할 수 있습니다. 이 방법의 데이터는 증가 된 스트레스 환경에 노출 될 때까지 인식되지 않을 수있는 유전자 기능에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다.

결과는 WT 및 시험 돌연변이체의 주변 및 낮은CO2 스크리닝으로부터의 원시 및 형광 이미지의 플레이트 이미지를 보여준다. 각 묘목은 면적 번호로 표시되어 있으며 해당 형광 판독값은 QY로 제공됩니다. 데이터는 텍스트 파일로 내보내지고 분석을 위해 스프레드시트에서 열 수 있습니다(보충 표 S1 참조). 돌연변이 라인 plgg1-1 및 abcb26은 광호흡 스트레스와 관련된 유전자의 양성 및 음성 동정을 입증하기 위해 선택되었습니다. PLGG1은 RuBP6의 산소화 후 경로의 첫 번째 수송 체를 코딩하는 반면, ABCB26은 광호흡11에 관여하는 것으로 알려지지 않은 항원 수송 체를 코딩하는 것으로 생각됩니다. WT 및 돌연변이체의 어두운 적응 Fv/Fm QY 효율은 상자 및 수염 플롯으로 시각화됩니다. WT와 검정 돌연변이체 간의 통계적 차이를 검정하기 위해, p...

우리는 엽록소 형광을 사용하여 낮은CO2 로 처리 한 후 식물에서 광합성 효율의 변화를 측정하는 접근법을 설명합니다.

Photosynthesis and photorespiration represent the largest carbon fluxes in plant primary metabolism and are necessary for plant survival. Many of the ...

이 방법의 목표는 낮은 CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡 경로에서 돌연변이를 식별하는 것입니다. 우리는 낮은 CO2에 노출 된 후 광호흡을 방해하는 돌연변이를 식별하는 방법을 제시합니다. 이 방법의 장점은 비교적 짧은 시간에 수행 할 수있는 묘목에 대한 높은 처리량 스크리닝이라는 것입니다.다음 섹션에서는 종자 준비 및 살균, 식물 성장 및 낮은 CO2 처리, 형광 이미징 시스템 구성, 처리된 샘플의 양자 수율 측정, 대표 결과 및 결론에 대한 세부 정보를 제공합니다. 종자 준비 및 살균. 종자 준비는 종자 흡수와 종자 살균으로 구성됩니다.이러한 모든 단계는 멸균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행된다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 필요한 모든 물질, 시약 및 성장 배지가 오토클레이브됩니다. 사용되는 시드 라인은 plgg1-1, abcb26 및 WT 또는 와일드 타입입니다.층류 후드의 멸균 된 물에 씨앗을 흡수 한 다음 어둠 속에서 섭씨 4도에서 이틀 동안 층화합니다. 멸균 조건 하에서, 10 밀리리터의 50 % 부피 표백제 용액을 준비하고 약 20 마이크로 리터의 트윈 20을 첨가한다. 흡수 된 씨앗에서 물을 제거한 다음 표백제 용액 1 밀리리터를 미세 원심 분리기 튜브에 넣고 실온에서 5 분 동안 배양합니다.피펫으로 표백제를 제거하십시오. 씨앗을 멸균 된 물 1 밀리리터로 헹구어 다시 현탁하십시오. 씨앗이 바닥에 가라 앉으면 물을 제거하십시오.멸균 된 0.1 % 아가 로스 용액에 씨앗을 재현 탁하십시오. 종자 도금의 경우, 비타민이 함유된 1%MS 배지와 시험 돌연변이체 재배를 위한 1%한천이 있는 기초 배지 플레이트. 면도날로 200 마이크로 리터 피펫 팁을 자릅니다.피펫을 사용하여 각 테스트 돌연변이 또는 유전자형에 대해 지정된 사각형 그리드의 중앙에 하나의 시드를 놓습니다. 여기에서는 1 센티미터 그리드가있는 사각형 플레이트가 사용됩니다. 이것은 각 묘목 사이의 균일 한 거리를 유지하고 겹치는 것을 방지하는 데 도움이되며, 이는 나중에 형광 이미징 및 분석에서 중요합니다.씨앗이 플레이팅되면 뚜껑 주위에 수술 테이프를 감아 밀봉 한 다음 성장 챔버에 넣습니다. 식물 성장 및 낮은 CO2 처리. 초당 평방 미터당 120 마이크로 몰의 8 시간 빛주기와 섭씨 18도에서 16 시간의 어둠 속에서 섭씨 20도에서 7-9 일 동안 식물을 재배합니다.여섯째 날에 식물을 확인하여 이미징하기에 충분히 큰지 확인하십시오. 도금 후 8 일째에 식물을 낮은 CO2에 노출시킵니다. 처리 식물을 12 시간 동안 초당 평방 미터당 200 마이크로 몰의 광도로 성장 챔버 내의 밀폐 된 상자에 넣습니다.낮은 CO2 조건은 용기 바닥에 소다 석회 100g을 놓은 밀폐 투명 용기를 사용하여 구성되었습니다. 용기를 대조군과 동일한 성장 챔버 내에 두었다. 제어 플랜트는 120시간 동안 주변 CO2에서 초당 평방 미터당 12마이크로몰 미만으로 유지됩니다.형광 이미징 시스템을 구성합니다. 형광 이미징 시스템에서 고정된 거리에 카메라 아래 중앙에 테스트 플레이트를 놓습니다. 계측기 소프트웨어 내에서 라이브 창으로 이동하고 깜박임 확인란을 선택하여 비화학선 측정 플래시를 켭니다.완전하고 선명한 이미지가 보일 때까지 확대/축소 및 초점 도구를 클릭합니다. EL 셔터 값을 0으로 설정하고 감도를 조정하여 200에서 500 디지털 단위 범위의 형광 신호를 얻습니다. 카메라 설정을 조정하는 데 사용된 것과 동일한 위치에 조도계를 놓습니다.라이브 창에서 Super 상자를 선택하여 800밀리초 동안 지속되는 포화 펄스를 시작합니다. 슬라이더를 사용하여 광계가 초당 평방 미터당 6, 000에서 8, 000 마이크로 몰을 읽을 때까지 슈퍼 펄스의 상대 전력 비율을 조정하십시오. 처리된 샘플의 양자 수율을 측정합니다.치료 직후, 어두운 적응을 위해 15 분 동안 알루미늄 호일로 판을 덮으십시오. 호일을 제거하여 펄스 진폭 수정 형광계로 광계 2의 양자 수율을 측정하였다. 그런 다음 묘목 플레이트를 카메라 바로 아래에 놓고 GitHub 리포지토리에 있는 양자 수율 프로토콜을 실행합니다.GitHub에서 퀀텀 수율 프로토콜을 다운로드합니다. 형광계 소프트웨어를 사용하여 폴더 아이콘을 클릭하고 파일 위치로 이동하여 프로그램 파일을 엽니 다. 빨간색 번개 아이콘을 클릭하여 퀀텀 수율 프로토콜을 실행합니다.프로토콜이 완료되면 사전 분석 창으로 이동합니다. 플레이트 이미지에서 각 묘목에 대한 모든 픽셀을 강조 표시하여 플레이트를 개별 묘목으로 분할합니다. 배경 제외를 클릭하여 강조 표시된 배경 픽셀을 제거하고 묘목 영역만 남깁니다.분석을 클릭하여 플레이트 이미지의 각 묘목에 대한 형광 데이터를 생성합니다. 형광 값 범위를 수동으로 조정하여 모든 플레이트에서 일관된 최소값과 최대값을 표시합니다. 실험 탭에서 내보내기를 클릭하고 숫자를 클릭합니다.숫자 평균을 클릭하여 각 묘목에 대한 양자 수율이 포함된 텍스트 파일을 생성합니다. 분석을 위해 텍스트 파일과 스프레드시트를 엽니다. 스프레드시트에는 영역 번호, 픽셀 크기, Fm, Ft, Fq 및 QY가 포함됩니다. 먼저, 야생형이든 시험 돌연변이이든 해당 유전자형에 대한 영역 번호를 식별해야 합니다.다음은 야생형 및 테스트 돌연변이체의 주변 및 낮은 CO2 스크리닝에서 얻은 원시 및 형광 이미지의 플레이트 사진입니다. 각 플레이트는 해당 형광 판독값이 양자 수율 또는 QY로 영역 번호로 표시됩니다. 데이터는 텍스트 파일로 내보내지고 분석을 위해 스프레드시트에서 열 수 있습니다. 야생형과 돌연변이체의 어두운 적응 Fv/Fm 양자 수율 효율은 상자 및 수염 플롯으로 시각화됩니다.야생형과 시험 돌연변이체의 통계적 차이를 검정하기 위해, 0.05 미만의 P 값으로 쌍별 T-검정을 사용하였다. 여기에서는 양자 수율이 감소된 광호흡 돌연변이 Fv/Fm 라인을 테스트 돌연변이체로 사용하여 스크리닝 방법의 효율성을 확인합니다. 우리의 결과는 테스트 돌연변이가 야생형에 비해 양자 수율 효율이 현저히 낮다는 것을 보여줍니다.이는 당사의 스크리닝 방법이 낮은 CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡 돌연변이를 식별할 수 있음을 나타냅니다. 결론. 이 프로토콜을 사용하는 동안 기억해야 할 중요한 사항은 Arabidopsis 묘목이 형광을 측정할 만큼 충분히 크지만 이미징 중에 식물이 겹칠 정도로 크지 않은지 확인하는 것입니다. 잎 크기와 잎 각도를 균일하게 유지하기 위해 묘목을 첫 번째 진정한 잎으로 이미지화하는 것이 바람직합니다.이 프로토콜은 묘목에 대한 높은 처리량 스크리닝으로 사용할 수 있습니다. 각 판의 이미징은 비교적 빠르며 하루에 1, 000 개가 넘는 묘목을 스크리닝 할 수 있습니다. 엽록소 형광 분석을 통해 광호흡 효율을 유지하는 데 중요한 낮은 CO2 스크리닝을 사용하여 광호흡 돌연변이를 식별할 수 있었습니다.이 프로토콜은 Arabidopsis에 국한되지 않으며 비 생물 적 스트레스 반응 실험에 잠재적으로 사용됩니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜은 in vitro에서 광 수확 복합체의 재구성에 대해 자세히 설명합니다. 이러한 일체형 막 단백질은 엽록소와 카로티노이드를 조정하고 고등 식물과 녹조류에서 빛을 수확하는 역할을 합니다.

식물과 녹조류의 빛 수확 단지의 체외의 재구성에

여기, 우리는 식물 성장 행동과 특히 고기를 공부 하 고 재현 가능한 방식에 대 한 프로토콜을 제시. 우리는 변수와 같은 시간 안정적인 조명 조건에서 제공 하는 방법을 보여줍니다. 적절 한 분석은 충분 한 샘플 번호 및 유효한 통계 평가에 따라 달라 집니다.

다른 빛 자질에 애기 thaliana 성장 행동의 분석

우리는 PAM및 에서 신호의 검출을 위한 스펙트럼 방사선계를 사용하여 엽록소의 형광 및 잎 반사의 동시 측정을 관련시키는 더 높은 식물에 있는 광합성 반응을 공부하는 새로운 기술적인 접근을 기술합니다 애기장대에서 같은 잎 지역.

잎 반사 및 엽록소 형광 분석의 동시 측정을 통해 광합성 거동 평가

빠른 반복률 형광계 (FRRf)는 광계 II 광생리학 및 일차 생산성을 측정하는 유익한 방법입니다. 여기서 우리는 큐벳 타입 FRRf를 사용하여 기질 동물 플랑크톤에 대한 후생대 조류, Colacium sp.의 PSII 광생리학을 측정하는 프로토콜을 설명한다.

Cuvette-type Fast Repetition Rate Fluorometer에 의한 Colacium sp.의 부착 단계의 광생리학 측정

이 프로토콜은 펄스 진폭 변조된 엽록소 형광 측정법에 의한 비광화학적 담금질의 완화를 측정하기 위한 고처리량 방법을 도입한다. 이 방법은 현장에서 자란 글리신 맥스 에 적용되며 유전 적 다양성 또는 번식 집단을 스크리닝하기 위해 다른 종에 적응할 수 있습니다.

펄스 진폭 변조된 엽록소 형광계를 이용한 작물에서의 비광화학적 담금질의 고처리량 분석

대부분의 수영 광독립영양 유기체는 광유도 행동 변화 (광행동)를 보여줍니다. 본 프로토콜은 모델 유기체 클라미도모나스 라인하르티이에서 상기 광거동을 관찰한다.

클라미도모나스 라인하르티이에서의 광행동 관찰

본 프로토콜은 스펙트럼 분석을 기반으로 홍조류의 phycobiliprotein 변화의 단계별 자가형광 이미징 및 평가를 설명합니다. 이것은 실험실 조건에서 희소한 물질만 사용할 수 있고 세포가 천천히 성장하거나 전혀 성장하지 않는 극한 서식지에 대한 세포 적응을 평가하기 위한 라벨이 없는 비파괴 방법입니다.

홍조류 생리학을 평가하기 위한 자가형광 이미징

여기에서는 애기장대 묘목 탈에티올화의 초기 단계에서 엽록소 생합성 모니터링을 위해 설계된 고급 도구에 대해 설명합니다. 이 새로운 방법론은 높은 공간 및 시간 분해능에서 비침습적 실시간 엽록소 형광 이미징을 제공합니다.

애기장대 탈에티올화의 초기 단계 동안 엽록소 생합성 역학 측정을 위한 비침습적 분석

이 원고는 광계 II 양자 효율, 스펙트럼 반사율, 식물 구조의 자율 현장 측정을 위한 비파괴적이고 고처리량의 접근법을 설명하여, 농업학 및 육종 현장 시험에서 대규모 캐노피 광합성 표현형 분석을 가능하게 합니다.

자율 로봇을 이용한 작물 식물의 광합성 효율을 현장에서 고처리량으로 스크리닝합니다

고주파 전기 자극 압수와 같은 활동을 사용하는 것은에서 유도된 수...

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배우세요 저CO₂ 처리와 엽록소 형광 분석을 이용한 광호흡 돌연변이체 고속 선별 방법을. 아라비도프시스 묘를 대상으로 광합성 양자수율을 측정하여 환경 스트레스 반응 연구에 활용할 수 있습니다.

엽록소 형광 분석에 의한 광호흡 돌연변이체의 광합성 효율 평가

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