Name: 성상 세포 영토 부피 분석 및 두꺼운 자유 부유 조직 절편의 타일링 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: 학습하세요 성상 세포 영토 부피 분석 및 두꺼운 자유 부유 조직 절편 타일링 방법을 통해 마우스 뇌 조직에서 성상 세포 형태를 정밀하게 측정하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

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현미경 검사는 UNC 신경 과학 현미경 코어 (RRID : SCR_019060)에서 수행되었으며, NIH-NINDS 신경 과학 센터 지원 보조금 P30 NS045892 및 NIH-NICHD 지적 발달 장애 연구 센터 지원 보조금 U54 HD079124의 기금으로 부분적으로 지원되었습니다. 그림 1은 BioRender.com 로 작성되었습니다. 그림 4의 이미지와 데이터는 출판사의 허가를 받아 이전 간행물(9 )에서 재인쇄된다.

<ol><li>Stogsdill, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytic+neuroligins+control+astrocyte+morphogenesis+and+synaptogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Astrocytic neuroligins control astrocyte morphogenesis and synaptogenesis.</a> Nature. 551 (7679), 192-197 (2017).</li>
<li>Akdemir, E. S., Huang, A. Y., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocytogenesis%3A+where%2C+when%2C+and+how%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Astrocytogenesis: where, when, and how.</a> F1000Research. 9, F1000 Faculty Rev-233 (2020).</li>
<li>Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protoplasmic+astrocytes+in+CA1+stratum+radiatum+occupy+separate+anatomical+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).</li>
<li>Houades, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shapes+of+astrocyte+networks+in+the+juvenile+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron+Glia+Biology%22%5BJournal%5D)">Shapes of astrocyte networks in the juvenile brain.</a> Neuron Glia Biology. 2 (1), 3-14 (2006).</li>
<li>Zuchero, J. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glia+in+mammalian+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Glia in mammalian development and disease.</a> Development. 142 (22), 3805-3809 (2015).</li>
<li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+transgenic+mouse+lines+for+selectively+targeting+astrocytes+and+studying+calcium+signals+in+astrocyte+processes+in+situ+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo.</a> Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).</li>
<li>Testen, A., Kim, R., Reissner, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+three-dimensional+imaging+of+individual+astrocytes+using+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-resolution three-dimensional imaging of individual astrocytes using confocal microscopy.</a> Current Protocols in Neuroscience. 91 (1), 92(2020).</li>
<li>Takano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemico-genetic+discovery+of+astrocytic+control+of+inhibition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemico-genetic discovery of astrocytic control of inhibition in vivo.</a> Nature. 588 (7837), 296-302 (2020).</li>
<li>Baldwin, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HepaCAM+controls+astrocyte+self-organization+and+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">HepaCAM controls astrocyte self-organization and coupling.</a> Neuron. 109 (15), 2427-2442 (2021).</li>
<li>Amberg, N., Hippenmeyer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+mosaic+dissection+of+candidate+genes+in+mice+using+mosaic+analysis+with+double+markers%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Genetic mosaic dissection of candidate genes in mice using mosaic analysis with double markers.</a> STAR Protocols. 2 (4), 100939(2021).</li>
<li>Dumas, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+electroporation+of+multiaddressable+genome-integrating+color+%28MAGIC%29+markers+to+individualize+cortical+mouse+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">In utero electroporation of multiaddressable genome-integrating color (MAGIC) markers to individualize cortical mouse astrocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (159), e61110(2020).</li>
<li>Garcia-Marques, J., Nunez-Llaves, R., Lopez-Mascaraque, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2-glia+from+pallial+progenitors+produce+the+largest+clonal+clusters+of+the+brain%3A+time+frame+of+clonal+generation+in+cortex+and+olfactory+bulb%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">NG2-glia from pallial progenitors produce the largest clonal clusters of the brain: time frame of clonal generation in cortex and olfactory bulb.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 34 (6), 2305-2313 (2014).</li>
<li>Clavreul, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+astrocytes+develop+in+a+plastic+manner+at+both+clonal+and+cellular+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels.</a> Nature Communication. 10 (1), 4884(2019).</li>
<li>O'Donnell, J., Ding, F., Nedergaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+functional+states+of+astrocytes+during+sleep+and+wakefulness%3A+Is+norepinephrine+the+master+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Sleep+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Distinct functional states of astrocytes during sleep and wakefulness: Is norepinephrine the master regulator.</a> Current Sleep Medicine Reports. 1 (1), 1-8 (2015).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 마우스 피질에서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 타일링을 분석하기 위한 확립된 방법을 설명하며, 관류로 시작하여 이미지 분석으로 끝나는 모든 주요 단계를 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 성상세포의 희소 또는 모자이크 집단에서 형광 단백질을 발현하는 마우스의 뇌를 필요로 한다. 이 요구 사항 외에, 임의의 연령의 마우스가 이 프로토콜에 사용될 수 있으며, 관류 설정에 대한 약간의 조정과 매립 금형에 추가된 동결 매체의 부피만 있을 뿐이다. 뇌 조직 섹션 7,11에서 성상세포 분지화 복잡성 및 부피의 분석을 위해 다른 방법들이 발표되었지만, 이 프로토콜은 몇 가지 독특한 장점을 갖는다. 첫째, 이 프로토콜은 성상세포 영역 부피를 획득하는데 사용될 수 있는 커스텀 코드를 기술한다. 성상세포 영토 부피는 분지화 복잡성에 관계없이 성상세포가 차지하는 전체 공간을 측정한다는 점에서 성상세포 세포 부피와 구별되는 측정치이...

성상세포는 뇌에서 많은 중요한 기능을 수행하는 정교하게 분지된 세포이다1. 마우스 피질에서, 방사상 신경교세포 줄기 세포는 후기 배아 및 초기 산후 단계2 동안 성상세포를 발생시킨다. 출생 후 처음 세 주 동안, 성상세포는 크기와 복잡성이 증가하여 시냅스와 직접 상호 작용하는 수천 개의 미세한 가지를 개발합니다1. 동시에, 성상세포는 이웃하는 성상세포와 상호작용하여 갭 접합 채널(4)을 통한 통신을 유지하면서 뇌(3)를 타일링하기 위해 이산적이고 겹치지 않는 영역을 구축한다. 성상세포 형태학 및 조직은 모욕 또는 상해5 후 많은 질병 상태에서 붕괴되며, 이는 적절한 뇌 기능을 위한 이러한 과정의 중요성을 나타낸다. 정상적인 발달, 노화 및 질병 동안 성상 세포 형태 학적 특성을 분석하면 성상 세포 생물학 및 생리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 또한, 유전자 조작에 따른 성상세포 형태학의 분석은 성상세포 형태학적 복잡성의 확립 및 유지를 지배하는 세포 및 분자 메커니즘을 식별하기 위한 귀중한 도구이다.
마우스 뇌에서 성상세포 형태학의 분석은 성상세포 분지화 복잡성과 성상세포 타일링 둘 다에 의해 복잡하다. 중간 필라멘트 신경교세포 세동 산성 단백질 (GFAP)을 성상세포 특이적 마커로서 사용한 항체 염색은 주요 분지만을 포획하고, 성상세포 형태학적 복잡성을 크게 과소평가한다1. 글루타메이트 수송체 1 (GLT-1; slc1a2), 글루타민 신테타제 또는 S100β와 같은 다른 세포 특이적 마커는 성상세포 분지6을 표지하는 더 나은 일을 수행하지만, 새로운 문제를 야기한다. 성상 세포 영역은 크게 겹치지 않지만 주변 가장자리에는 약간의 겹침이 존재합니다. 분지화의 복잡성 때문에, 이웃 성상세포가 같은 색으로 라벨링될 때, 한 성상세포가 끝나고 다른 성상세포가 시작되는 곳을 구별하는 것은 불가능하다. 내인성 형광 단백질로 성상세포의 희소 또는 모자이크 표지는 두 가지 문제를 모두 해결합니다: 형광 마커는 세포를 채워 모든 가지를 포착하고 이웃과 구별될 수 있는 개별 성상세포의 이미징을 가능하게 합니다. 바이러스 주입, 플라스미드 전기천공, 또는 트랜스제닉 마우스 라인을 포함하는 유전자 조작의 유무에 관계없이 성상세포의 희소 형광 표지를 달성하기 위해 몇 가지 상이한 전략이 사용되어 왔다. 이러한 전략의 실행에 대한 자세한 내용은 이전에 발표된 연구 및 프로토콜 1,7,8,9,10,11,12,13에 설명되어 있다.
이 기사에서는 희소 한 성상 세포 집단에서 형광 표지로 마우스 뇌에서 성상 세포 영역 부피를 측정하는 방법을 설명합니다 (그림 1). 마우스 피질에서 성상세포의 평균 직경은 대략 60 μm이기 때문에, 100 μm 두께의 절편은 개별 성상세포 전체를 포획하는 효율을 향상시키기 위해 사용된다. 면역 염색은 필요하지 않지만 공초점 이미징 및 분석을 위해 내인성 형광 신호를 향상시키는 것이 좋습니다. 면역 염색은 또한 미세 성상 세포 가지의 더 나은 검출을 가능하게하고 이미지 획득 동안 내인성 단백질의 광표백을 감소시킬 수 있습니다. 두꺼운 절편으로의 항체 침투를 개선하고, 영상화를 통한 절편화로부터 조직 부피를 보존하기 위해, 자유-부유 조직 절편이 사용된다. 성상세포 영역 부피의 분석은 상업적으로 이용가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 수행된다. 추가적으로, 이 프로토콜은 모자이크 표지를 갖는 조직 절편에서 성상세포 타일링을 분석하는 방법을 기술하며, 여기서 이웃 성상세포는 상이한 형광 표지를 발현한다. 이 프로토콜은 최근 여러 연구에서 성공적으로 사용되어 왔으며 1,8,9 정상적인 뇌 발달 중 성상 세포 성장뿐만 아니라 유전자 조작이 성상 세포 발달에 미치는 영향을 특성화합니다.

<table><tbody><tr><td>#5 겸자</td><td>Roboz</td><td>RS-5045</td><td></td></tr><tr><td>1mL TB 주사기</td><td>Becton Dickinson(BD)</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>10x TBS(트리스 완충 식염수)</td><td></td><td></td><td>30g Tris, 80g NaCl, 2g KCl, HCl에서 pH 7.4, dH2O에서 1L, 실온(RT)에서 보관12</td></tr><tr><td>웰 플레이트</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-106MP</td><td></td></tr><tr><td>1x TBS</td><td></td><td></td><td>100mL 10x TBS + 900mL dH2O; RT</td></tr><tr><td>1x TBS + 헤파린</td><td></td><td></td><td>28.2 mg 헤파린 + 250 mL 1x TBS에 저장; 4 &deg에 저장; C</td></tr><tr><td>24웰 플레이트</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-107MP</td><td></td></tr><tr><td>30% 자당 TBS</td><td></td><td></td><td>15g 자당, 1x TBS - 50mL;4°C에 보관; </td></tr><tr>TBS <td></td><td></td> 40g PFA<td>의 C 4 % PFA (파라 포름 알데히드)</td><td>40g PFA, 4-6 NaOH 펠릿, 100 mL 10x TBS, dH2O에서 1 L;4 °C에 저장; C</td></tr><tr><td>Avertin</td><td></td><td></td><td>0.3125g 트리 브로 모에 탄올, 0.625 mL 메틸 부탄올, dH2O to 25 mL; 4 °C에서 보관; C; </td></tr><tr>TBST에 있는<td>막기 그리고 항체 완충기</td><td></td><td></td> 10% 염소 혈청을 만들기 후에 2 주를 버리십시오<td>; 4 &deg에 저장하십시오; C</td></tr><tr><td>CD1 마우스</td><td>Charles River</td><td>022</td><td></td></tr><tr><td>뇌용 수집 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-20</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 수집 소프트웨어</td><td>Olympus</td><td>FV31S-SW</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Olympus</td><td>FV3000RS</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific</td><td>CryoStar NX50</td><td></td></tr><tr><td>저온 유지 장치 블레이드</td><td>Thermo Scientific</td><td>3052835</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Embedding mold</td><td>Polysciences</td><td>18646A-1</td><td></td></tr><tr><td>냉동 매체</td><td></td><td></td><td>2:1 30% 자당:OCT; RT</td></tr><tr><td>GFP 항체</td><td>Aves Labs</td><td>GFP1010</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol에 보관</td><td>Thermo Scientific</td><td>158920010</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 닭 488</td>, <td>Invitrogen</td><td>A-11039</td><td></td></tr><tr><td>염소 안티 토끼 594</td>, <td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>염소 혈청</td><td>Gibco</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>염산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258148</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td>버전 9.8.0</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>금속 도시락 깡통</td> 물<td>병자리</td><td>N/A</td><td>아마존에서, "DIY 대형 재미 상자"</td></tr><tr><td>메틸부탄올</td><td>시그마-알드리치</td><td>152463</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 해부 가위</td><td>Roboz</td><td>RS-5921</td><td></td></tr><tr><td>장착 매체</td><td></td><td></td><td>20mM 트리스 pH 8.0, 90% 글리세롤, 0.5% N-프로필 갈레이트; 4 &deg에 저장; C; 최대 2개월 동안 사용</td></tr><tr><td>가능 매니큐어</td><td>VWR</td><td>100491-940</td><td></td></tr><tr><td>N-프로필 갈레이트</td><td>시그마-알드리치</td><td>02370-100G</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>오일</td><td>Olympus</td><td>IMMOIL-F30CC</td><td>현미경/대물</td></tr><tr><td>전용 운영 가위 6"</td><td>Roboz</td><td>RS-6820</td><td></td></tr><tr><td>궤도 플랫폼 쉐이커</td><td>Fisher Scientific</td><td>88861043</td><td>필요한 최소 속도: 25 rpm</td></tr><tr><td>페인트브러시</td><td>Bogrinuo</td><td>N/A</td><td>아마존에서, "디테일 페인트 브러시 - 미니어처 브러시 "</td></tr><tr><td>파라 포름 알데히드</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 (5.75 ")</td> <td>VWR</td><td>14672-608</td><td></td></tr><tr><td>파스퇴르 피펫 (9 ")</td> <td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>RFP 항체</td><td>Rockland</td><td>600-401-379</td><td></td></tr><tr><td>절제 매체</td><td></td><td></td><td>1:1 글리세롤:1x TBS; RT Slides에 보관</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>소듐 chrloide</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>TBST (TBS + Triton X-100)</td><td></td><td></td><td>0.2% Triton in 1x TBS; RT</td></tr><tr><td>Transfer Pipet</td><td>VWR</td><td>414004-002</td><td></td></tr><tr><td>Tri-bromoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T48402</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Thermo Scientific</td><td>424570025</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 ( 고품질)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-489-120</td><td></td></tr><tr><td>XTSpotsConvexHull</td><td>해당 없음</td><td>N/A</td><td>맞춤형 XTension은 보조 자료로 제공합니다</td></tr></tbody></table>.

성상 세포 영토 부피 분석 및 두꺼운 자유 부유 조직 절편의 타일링

Analysis of Astrocyte Territory Volume and Tiling in Thick Free-Floating Tissue Sections

성상세포는 뇌 내의 거의 모든 유형의 세포 및 구조와 상호 작용할 수있게 해주는 놀라운 수준의 형태 학적 복잡성을 가지고 있습니다. 이러한 상호 작용을 통해 성상 세포는 시냅스 형성, 신경 전달 및 이온 항상성을 포함한 많은 중요한 뇌 기능을 적극적으로 조절합니다. 설치류 뇌에서 성상 세포는 출생 후 처음 세 주 동안 크기와 복잡성이 증가하고 뇌를 타일링하기 위해 뚜렷하고 겹치지 않는 영역을 확립합니다. 이 프로토콜은 마우스 뇌에서 자유 부유 조직 절편을 사용하여 성상 세포 영역 부피 및 성상 세포 타일링을 분석하기위한 확립 된 방법을 제공합니다. 먼저, 이 프로토콜은 자유 부유 조직 절편의 조직 수집, 냉동 절제술 및 면역염색을 위한 단계를 기술한다. 둘째,이 프로토콜은 상업적으로 이용 가능한 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 성상 세포 영토 부피 및 영토 중첩 부피의 이미지 획득 및 분석을 설명합니다. 마지막으로,이 원고는 이러한 방법의 장점, 중요한 고려 사항, 일반적인 함정 및 한계에 대해 논의합니다. 이 프로토콜은 성상세포의 희소 또는 모자이크 형광 표지를 가진 뇌 조직을 필요로 하며, 일반적인 실험실 장비, 공초점 현미경 및 상업적으로 이용가능한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 사용하도록 설계되었다.

그림 1에서는 이 프로토콜의 주요 단계 및 워크플로에 대한 개략적인 개요를 보여 줍니다. 그림 2는 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 표면을 생성하고, 표면에 가까운 반점을 생성하고, 볼록한 선체를 생성하는 주요 단계의 스크린샷을 보여줍니다. 그림 3은 성상세포 영역 중첩/타일링을 결정하기 위해 이 기술의 적용을 보여줍니다. 도 4에서, 이전에 출판된 원고(9 )로부터의 대표적인 결과는 이 프로토콜의 적용을 입증한다. 도 4A 및 도 4B에서, 성상세포-풍부 세포 부착 분자 간CAM의 녹다운은 성상세포 영역 부피를 상당히 감소시킨다. 도 <strong class="xfi...

이 프로토콜은 마우스 뇌의 자유 부유 조직 절편을 절편화, 염색 및 이미징하는 방법을 설명하고, 이어서 성상세포 영역 부피 및 성상세포 영역 중첩 또는 타일링의 분석에 대한 상세한 설명을 설명한다.

Astrocytes possess an astounding degree of morphological complexity that enables them to interact with nearly every type of cell and structure within the ...

성상세포가 어떻게 복잡한 형태를 개발하고 확립하는지 이해하는 것은 뇌가 어떻게 발달하고 기능하는지 이해하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 뇌 조직에서 성상 세포 형태학의 주요 측면을 분석하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 사용자 정의 코드를 사용하여 두꺼운 조직 섹션에서 성상 세포 영역 부피를 측정합니다.이 전략은 또한 이웃 성상세포들 사이의 영토 중첩의 양을 측정하기 위해 적용될 수 있다. 이 프로토콜을 성상 세포의 유전 적 조작과 결합함으로써 연구자들은 성상 세포 발달 및 성상 세포 - 성상 세포 상호 작용에서 특정 단백질 및 경로의 역할을 직접 조사 할 수 있습니다 시작하기 위해 50 밀리리터 튜브에 10 % Triton X 1 밀리리터를 추가하고 TBS로 튜브를 50 밀리리터로 채우는 TBST의 신선한 용액을 준비하십시오. 염소 혈청과 TBST를 결합하여 각 뇌에 대해 2 밀리리터의 차단 및 항체 용액을 준비하십시오. 15밀리리터 튜브.그런 다음 24웰 플레이트에 라벨을 붙여서 서로 다른 컬럼의 서로 다른 용액의 서로 다른 행에 서로 다른 샘플을 배치한 다음 세척 1, 세척 2, 세척 3으로 표시된 처음 세 열에 TBST를 1밀리리터 추가하고 네 번째 컬럼에 블로킹 용액 1밀리리터를 추가합니다. 분젠 버너를 이용하여 작은 후크에 5.75인치 파스퇴르 피펫의 끝을 녹여 유리 픽을 준비한 다음, 12웰 플레이트로부터 조직 절편을 픽을 이용하여 24웰 플레이트의 세척 1열로 옮긴 다음, 1, 2로 각각 10분간 절편을 세척하고, 3개의 웰을 유리 픽을 사용하여 한 웰에서 다음 웰로 절편을 옮기고, 이어서 블로킹 용액에서 한 시간 동안 절편을 인큐베이션하였다. 항체를 항체 용액에 첨가하여 일차 항체 용액의 q 밀리리터를 준비한 다음, 섭씨 4도에서 4, 000배 g보다 크거나 같은 곳에서 5분 동안 간단히 와류하고 원심분리한다.다음에, 일차 항체의 절편을 진탕하면서 섭씨 4도에서 2 내지 3박 동안 인큐베이션한다. 1차 항체 인큐베이션 후, 세척 웰로부터 1일-1 TBST를 흡인한 다음, 각 세척 웰에 1 밀리리터의 새로운 TBST를 첨가하고, 절편을 첫 번째 세척 웰로 옮긴다. 다음에, 절편을 실온에서 3시간 동안 이차 항체로 인큐베이션한다.2차 항체 인큐베이션 후, 세척 웰로부터 2 TBST를 흡인한 다음, 각 세척 웰에 1 밀리리터의 새로운 TBST를 첨가하고, 절편을 첫 번째 세척 웰로 이동시킨다. 최종 세척 중에 장착 매체를 섭씨 4도에서 꺼내 실온으로 따뜻하게 한 다음 TBS와 탈 이온수의 2 대 1 혼합물을 준비하고 페트리 접시에 첨가하십시오. 다음으로, 표면에 TBS와 탈이온수의 2-to-1 혼합물 800 마이크로리터를 첨가하여 현미경 슬라이드를 제조하였다.세척 3 웰에서 페트리 접시로 섹션을 옮긴 다음 미세한 페인트 브러시를 사용하여 섹션을 페트리 접시에서 슬라이드의 액체로 한 번에 하나씩 옮깁니다. 그런 다음 페인트 브러시를 사용하여 슬라이드에서 평평하도록 섹션을 조심스럽게 정렬하십시오. 조심스럽게 P-1000 피펫으로 슬라이드에서 과도한 액체를 제거한 다음 진공 흡인하십시오.슬라이드에서 여분의 액체가 모두 제거되면 전사 피펫을 사용하여 각 섹션에 장착 매체 1 방울을 즉시 추가하고 슬라이드 위에 덮개 슬립을 부드럽게 놓습니다. 장착 매체를 몇 분 동안 퍼뜨린 다음 진공 흡인으로 커버 슬립 아래에서 나오는 과도한 장착 매체를 제거하십시오. 그런 다음 커버 슬립의 네 가장자리를 모두 투명한 매니큐어로 밀봉하십시오.슬라이드를 실온에서 30 분 동안 건조시킨 다음 섭씨 4도에서 평평하게 보관하십시오. 10x 목표를 사용하여 이미징을 위해 개별 세포를 찾고 실험과 관련된 특정 뇌 영역 또는 하위 영역을 기록한 다음 초점 노브를 사용하여 전체 성상 세포가 섹션 내에 포함되어 있는지 여부를 결정합니다. 그 후, 더 높은 배율 오일 목표로 전환하고 세포에 초점을 맞 춥니 다.아이피스를 들여다보면서 포커스 노브를 사용하여 셀의 위쪽에서 아래쪽으로 이동한 다음 세포를 육안으로 검사하여 전체 셀이 섹션 내에 포함되어 있는지 확인합니다. 공초점 현미경과 관련된 수집 소프트웨어를 사용하여 수집 매개 변수를 조정하여 적절한 신호 대 잡음비 및 세부 수준을 얻은 다음 60x 또는 63x 목표를 사용하는 경우 40x 목표에 대해 2x 줌을 사용하고 줌을 사용하지 않습니다. Z-스택의 위쪽 및 아래쪽 경계를 0.5마이크로미터의 스텝 크기로 설정하여 전체 성상세포가 세포의 형광 표지 없이 첫 번째 및 마지막 이미지로 캡처되도록 합니다.분석을 시작하기 전에 XT 폴더의 rtmatlab 하위 폴더에 파일을 붙여 넣어 볼록한 선체 확장 파일인 XtspotsConvexHull을 설치합니다. Imaris 파일 변환기를 사용하여 이미지를 IMS 형식으로 변환하십시오. 그런 다음 이미지 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 3D 뷰 버튼을 선택하여 3D 모드에서 이미지를 보고 셀이 포함 기준을 충족하는지 확인합니다.서피스를 생성하려면 파란색 새 서피스 추가 아이콘을 클릭한 다음 서피스 생성 도구 크기 아래의 상자에 치수를 입력하거나 노란색 상자의 모서리를 드래그하여 셀 주위에 관심 영역을 만듭니다. 그런 다음 노란색 막대를 드래그하거나 상자에 값을 입력하여 회색 표면이 셀 경계를 넘지 않고 가능한 한 많은 셀 신호를 채우도록 하여 임계값 절대 강도를 조정합니다. 그런 다음 녹색 화살표를 클릭하여 서피스 생성을 마칩니다.새로 생성된 서피스를 주의 깊게 검사하고 셀에 속하지 않는 서피스 조각을 선택한 다음 연필 편집 도구를 클릭한 다음 삭제 옵션을 클릭하여 삭제합니다. 나머지 서피스 조각을 통합하려면 깔때기 필터 아이콘을 클릭하여 모두 선택한 다음 연필 편집 아이콘을 클릭하고 통합 옵션을 선택합니다. 주황색 새 스팟 추가 아이콘을 클릭하고 드롭다운 목록에서 올바른 소스 채널을 선택한 다음 상자에 0.400마이크로미터의 예상 XY 직경 값을 입력합니다.그런 다음 녹색 화살표를 클릭하여 점 만들기를 마친 다음 점을 다시 선택하십시오. 필터 아이콘을 클릭하고 서피스 서피스 X까지의 최단 거리를 선택합니다. 여기서 서피스 X는 드롭다운 목록에서 분석 중인 서피스이며, 임계값 하한과 상위 임계값 전원 버튼이 모두 녹색인지 확인합니다. 그런 다음 아래쪽 임계값 상자에 영하 1.0마이크로미터의 최소 거리와 위쪽 임계값 상자에 0.1마이크로미터의 최대 거리를 입력한 다음 새 스팟에 섹션 복제 단추를 클릭하여 새로 생성된 스폿이 소프트웨어 창의 왼쪽 위 패널에서 선택되도록 합니다.그런 다음 기어 도구 아이콘을 클릭 한 다음 볼록한 헐 플러그인을 한 번만 클릭하고 MATLAB 창이 나타날 때까지 기다렸다가 사라지면 3D 뷰에서 단단한 선체가 생깁니다. 왼쪽 위 패널에서 스팟 X 선택의 볼록한 선체, 스팟 X 셀렉션이 새로 생성된 스팟인 최단 거리가 선택되었는지 확인한 다음 선체를 클릭하여 선택합니다. 그런 다음 그래프 통계 아이콘을 클릭하십시오.선택 탭의 위쪽 드롭다운 목록에서 특정 값이 선택되었는지 확인한 다음 아래쪽 드롭다운 목록에서 볼륨을 선택한 다음 선체의 볼륨을 기록하고 파일을 저장하여 다음 이미지로 진행합니다. 성상세포 영역 부피는 막 표적화된 적색 형광 단백질을 발현하는 성상세포에서 측정되었다. 성상세포 풍부 세포 부착 분자인 hepaCAM의 녹다운은 성상세포 영역 부피를 상당히 감소시킨다.이중 마커를 사용한 모자이크 분석은 야생형 성상세포가 적색 형광 단백질을 발현하고 간암 녹아웃 성상세포가 녹색 형광 단백질을 발현하는 마우스를 생성하는데 사용되었다. 이웃하는 적색 및 녹색 형광 단백질 성상세포 쌍 사이의 영역 중첩의 백분율을 계산하였다. 간암 및 녹색 성상세포의 유전자 변형을 가진 마우스는 야생형 전용 성상세포 쌍에 비해 적색 야생형 이웃과 영토 중첩 부피의 상당히 증가된 비율을 보였다.이 결과는 간암이 정상적인 성상세포 영역 부피 및 성상세포 타일링에 필요하다는 것을 입증한다. 세포가 포함 기준을 충족하는지 확인하는 것이 중요합니다. 불완전한 셀은 더 작은 영토 부피를 가지며 전반적인 결과와 결론에 영향을 줄 수 있습니다.

analysis-astrocyte-territory-volume-tiling-thick-free-floating-tissue

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 동영상은 1차 및 2차 항체를 사용하여 형광 표지된 성상세포로 고정된 마우스 뇌 조직 절편을 면역 염색하고 컨포칼 현미경을 통해 염색된 성상세포의 이미지를 캡처하는 절차를 보여줍니다.

마우스 뇌 조직 절편에서 형광 표지된 성상세포의 면역염색

출처: Moye, S. L., et.al.  Lucifer Yellow Iontophoresis를 사용한 성상세포 형태 시각화. J. Vis. Exp. (2019).  이 비디오는 고정된 뇌 절편에서 성상세포 형태를 연구하기 위해 형광 염료 이온 영동을 사용하는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 저전압 전류 하에서 음이온성, 친수성 염료를 세포질로 전달하기 위해 전극으로 성상세포체(astrocyte soma)를 뚫는 방법을 자세히 설명하여 염료가 체세포(soma)와 가지를 확산시키고 표지할 수 있도록 합니다. 그런 다음 컨포칼 현미경을 사용하여 표지된 성상세포를 시각화하여 형태학적 통찰력을 제공합니다.

Visualizing Astrocyte Morphology Using Fluorescent Dye Iontophoresis in a Fixed Mouse Brain Slice

출처: Bagheri, M., et. al. 성상세포의 3차원 공초점 형태학적 분석을 위한 프로토콜. J. Vis. 경험. (2015).이 비디오는 공초점 현미경을 사용하여 마우스 뇌 절편에서 형광 표지된 성상세포의 이미징을 보여줍니다. 뇌 절편은 적절한 대물 렌즈 아래에 위치하고 적절한 형광단과 필터가 선택됩니다. 노출을 자동으로 최적화한 후 고해상도 2D 이미지를 보장하기 위해 스캐닝 매개변수가 정의됩니다. Z-스택 매개변수가 구성되고 3D 이미지가 수집됩니다.

공초점 현미경을 이용한 면역표지 성상세포의 3차원 이미징

CNS의 성상세포는 유해한 자극에 반응하여 기능적, 구조적 특성을 변화시킵니다. 이 보고서는 질병 상태 또는 치료 개입 후 3차원 성상세포 형태를 평가하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

성상의 3 차원 공 촛점 형태 학적 분석을위한 프로토콜

여기 astrocytic 네트워크의 조직 평가 프로토콜 선물이. 설명된 방법 셀 수, 크기, 지역, 및 핵 내의 위치 등이 네트워크의 기술적인 조치를 제공 하는 바이어스를 최소화 합니다. 이방성 vectorial 분석 평가 이다.

크기, 모양, 및 결합 된 이다의 네트워크의 방향 분석

설명된 파이프라인은 기가바이트보다 큰 전자 현미경 데이터 세트를 세분화하여 전체 세포 형태를 추출하도록 설계되었습니다. 셀을 3D로 재구성하면 개별 요구를 중심으로 설계된 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 3D로 직접 정성적 및 정량적 분석을 수행할 수 있으며 가상 현실을 사용하여 뷰 오클루전을 극복할 수도 있습니다.

신경교 세포와 신경 세포의 3D 재건 및 가상 현실 분석을위한 방법

성상 세포는 형태학적으로 복잡한 세포이며, 여러 과정과 덤불 영토에 의해 예시됩니다. 그들의 정교한 형태를 분석하기 위하여는, 우리는 가볍게 고정한 조직에서 세포내 Lucifer 황색 이온 포레시스를 능력을 발휘하기 위하여 믿을 수 있는 프로토콜을 제시합니다.

루시퍼 황색 이온토포레시스를 사용하여 성상세포 형태 시각화

여기에서 우리는 세포기관의 세포내 수송 및 뮤린 성상 세포에 있는 혈장 막 단백질의 인신 매매를 구상하는 시험관 내 살아있는 화상 진찰 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 또한 화물 운송 일정 및 역학을 결정하는 이미지 분석 방법론을 제시합니다.

성상 세포에서 세포기관 및 기타 화물의 세포내 운송 시각화 및 분석

성상 세포는 대뇌 피질을 균일하게 타일로 만들어 세포 수준에서 복잡한 형태에 대한 분석을 어렵게 만듭니다. 여기에 제공된 프로토콜은 자궁 전기포레이션을 기반으로 하는 다색 라벨을 사용하여 피질 성상신구를 선별하고 사용자 친화적인 이미지 분석 파이프라인을 사용하여 볼륨 및 형태를 분석합니다.

피질 마우스 성상세포를 개별화하기 위해 다각형 게놈 통합 색상(MAGIC) 마커의 자궁 전기포게에서

CLARITY 방법을 사용하여 바이러스 벡터 형질도입과 뇌 제거를 결합하면 많은 수의 뉴런과 성상세포를 동시에 조사할 수 있습니다.

맑은 뇌에서 성상세포와 뉴런 사이의 공간적 상호작용 조사

학습하세요 성상 세포 영토 부피 분석 및 두꺼운 자유 부유 조직 절편 타일링 방법을 통해 마우스 뇌 조직에서 성상 세포 형태를 정밀하게 측정하는 기술을 익히세요. 이 프로토콜은 신경과학 연구에 필수적인 도구입니다.

성상 세포 영토 부피 분석 및 두꺼운 자유 부유 조직 절편의 타일링

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