포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

PIB-MS는 내인성 인산단백질 포스파타제를 풍부하게 하는 데 사용되는 새로운 기술이며 세포와 조직의 단백질과 상호작용하고 있습니다. 이는 질량 분광법 기반 프로테오믹스를 사용하여 이들 단백질의 확인 및 정량화를 포함한다. 이 기술은 단백질 활성 또는 국소화를 변경할 수 있는 인성 단백질 포스파타제의 태그된 버전의 외인성 발현을 필요로 하지 않는다.

또한, 비특이적일 수 있거나 특정 이소형을 구별할 수 없는 항체는 사용하지 않는다. PPPM을 조사하기 위한 이 방법은 세포에서 임상 샘플에 이르기까지 모든 것에 사용하기 위해 스케일링될 수 있다. 시작하기 위해, 실온에서 2분 동안 277회 g에서 원심분리하여 세포 펠릿을 수집한다.

배지를 제거하고 세포를 다섯 밀리리터의 PBS로 세척한다. 텍스트 프로토콜에 설명 된대로 용해 버퍼를 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 샘플에 냉각 용해 버퍼 한 밀리리터를 추가 한 다음 음향화로 샘플을 균질화하고 펄스 사이의 얼음 위에 세포를 보관하십시오.

용해물을 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 초음파 처리된 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 21, 130배 g에서 원심분리한다. 용해물의 분취량을 사용하여 비친코닌산 검정을 사용하여 총 단백질 농도를 정량한다.

이 단계는 각 샘플에서 동일한 단백질 농도를 보장하는 데 필수적입니다. 포스포단백질 포스파타제 억제제 대조군의 경우, 각 샘플에 대해 동일한 단백질 농도의 두 분취량을 준비한다. 용해 완충액은 각 튜브가 동일한 단백질 농도를 갖도록 샘플을 희석하는 데 사용할 수 있습니다.

하나의 분취량에 유리 마이크로시스틴-LR의 한 마이크로몰을 첨가하고 동일한 부피의 DMSO를 다른 분취량에 첨가한다. 샘플을 볼텍스하고 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 포스파타제 억제제 비드의 제조는 샘플 준비 섹션에 기재된 인큐베이션 단계 동안 또는 미리 수행되어야 한다.

1 밀리그램의 단백질에 10 마이크로 리터의 고체 포스파타제 억제제 비드 또는 PIB 수지를 사용하고 1.5 밀리리터 튜브에 첨가하십시오. 볼텍싱에 의해 0.5 밀리리터의 용해 완충액으로 PIBs 세 배를 세척한 다음, 실온에서 30초 동안 376회 g에서 원심분리하였다. 세척된 PIB에 적절한 양의 용해 완충액을 첨가하여 50% 부피%의 PIB 완충 용액을 만든다.

피펫팅하여 피펫 팁과 슬러리를 부드럽게 소용돌이치며 혼합하여 PIB를 재현탁시킨다. 슬러리 20 마이크로리터를 0.5 밀리리터의 용해 완충액이 들어있는 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다. 튜브를 30초 동안 376배 g로 돌립니다.

각 튜브에는 동일한 볼륨의 PIB가 포함되어 있습니다. 각 튜브에 고체 수지와 최대 50 마이크로리터의 용해 완충액만을 남기면서 상층액을 버리십시오. 용해물을 PIB를 함유하는 적절하게 표지된 튜브로 옮긴다.

용해물을 섭씨 4도에서 한 시간 동안 PIB와 함께 인큐베이션하고 8rpm에서 회전시킨다. 용해물과 함께 인큐베이션한 후, PIBs를 섭씨 4도에서 30초 동안 376배 g에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 0.5 밀리리터의 용해 완충액을 첨가하고 튜브를 반전시켜 비드를 세척하고 원심분리에 의해 비드를 수집하고 상층액을 제거하십시오.

총 세 번의 세척에 대해 이 단계를 반복합니다. 최종 세척 후, PIB를 피펫팅하지 않고 용해 완충액을 가능한 한 많이 제거한다. 2%SDS를 포함하는 용출 완충액을 준비하고 PIB 부피의 네 배에서 다섯 배까지 용출 완충액을 첨가한다.

섭씨 65도에서 한 시간 동안 배양하여 비드로부터 포스포단백질 포스파타제를 용출시킨다. 튜브를 실온에서 30초 동안 376회 g로 원심분리한다. 용출액을 별도의 튜브로 수집하고 질량 분광법 분석 또는 웨스턴 블롯팅을 진행하십시오.

PIB를 재생성시키기 위해, 실온에서 한 시간 동안 8 rpm에서 회전하면서 2%SDS 용액에서 인큐베이션한다. 비드를 세척당 30분 동안 회전하면서 25 밀리몰 Tris-HCl pH 7.5에서 3 내지 5회 세척한다. PIB를 아지드 나트륨을 사용하여 25밀리몰 트리스 HCL pH 7.5에 보관하십시오.

질량 분광법 분석의 경우, 데이터 필터링 및 분석 방법은 다양하며 연구자 또는 핵심 시설에 의해 수행 될 수 있습니다. 종별 프로테옴 데이터베이스에 대해 원시 데이터를 검색한 후 검색 결과를 필터링하여 Microsoft Excel 워크시트로 내보냅니다. 데이터를 세 배로 분석합니다.

라벨이 없는 정량화의 경우 MS1 피크 면적 측정을 사용하여 데이터를 정량화합니다. PPP 서브유닛과 그들의 상호작용자 드 노보를 확인하기 위해, 마이크로시스틴-LR-억제된 샘플과 DMSO 처리된 샘플의 생물학적 삼중항을 비교한다. 세 개의 DMSO 대조군-처리된 샘플 중 적어도 두 개 중 하나 초과의 총 펩티드 카운트를 갖는 단백질만이 존재하도록 데이터를 필터링한다.

수지에 비특이적으로 결합하는 단백질을 걸러내기 위해, 마이크로시스틴-LR 처리 조건에서의 총 펩티드 카운트가 임의의 PPP 촉매 서브유닛에 대한 것보다 높은 단백질을 제거한다. 케라틴, 콜라겐, 리보솜 단백질 및 이종 핵 리보뉴클레오 단백질과 같은 일반적인 오염 물질을 분석에서 제외합니다. CSV 파일은 페르세우스로 데이터를 가져오는 데 필수적입니다.

로드 섹션에서 일반 매트릭스 업로드를 클릭하여 필터링된 데이터를 페르세우스로 가져옵니다. 기본 변환으로 이동하여 데이터를 선택하고 변환 함수를 x의 로그 베이스 2로 지정하여 데이터를 변환합니다. Imputation으로 이동하고, 정규 분포에서 누락된 값 바꾸기, 데이터를 선택하고, 계산을 위한 너비와 다운시프트를 지정하여 정규 분포에서 누락된 값을 함축합니다.

정규화, 분위수 정규화로 이동하여 분위수 정규화를 수행합니다. 주석 행, 범주형 주석 행으로 이동하여 데이터에 주석을 추가합니다. 테스트, 두 샘플 테스트로 이동하여 그룹, 수행할 테스트 및 절단에 사용되는 여러 가설 테스트 수정 방법으로 이동하여 스튜던트 T 테스트를 수행합니다.

이 함수는 또한 로그 2 비율을 계산합니다. 포스포단백질 포스포테이트 및 이들의 상호작용자는 PIB 풀다운 실험을 사용하여 HeLa 세포에서 확인되었고, 이어서 DMSO 처리 및 마이크로시스틴-LR 처리된 샘플에서 단백질 풍부도의 라벨 없는 정량화가 뒤따랐다. 질량 분광법 분석의 화산 플롯은 적색으로 표시된 특정 PIB 결합제, 파란색의 촉매 서브 유닛 및 새로운 후보 PPP 서브 유닛 또는 상호 작용하는 단백질을 흰색으로 확인했습니다.

비특이적 결합제는 회색으로 나타났다. DMSO 처리된 HeLa 세포 용해물로부터의 log2 영역의 산점도는 풍부도가 고도로 상관관계가 있음을 보여주었고, 이는 데이터의 재현성을 나타낸다. 모든 형광체 단백질 포스파타제 서브유닛과 상호작용 단백질의 네트워크 분석은 이들 단백질이 PIB 풀다운에서 특이적인 상호작용자임을 보여주었다.

글로벌 프로테오믹스 분석을 수행할 수 있었고, 그 결과를 PIB 분석과 비교하여 PPPome 조성물이 PPP 풍부도에 의해 구동되는지 또는 번역 후 메커니즘에 의해 조절되는지를 결정할 수 있었다. PIB-MS는 간상 대 유사분열 샘플 또는 암 세포주 간의 차이와 같은 다양한 조건 하에서 PPP 발현 패턴의 차이를 확인할 수 있게 해주는 광범위하게 적용 가능한 도구입니다.