Name: 포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 17 s
Description: 배우세요 PIB-MS 기법을 이용하여 세포와 조직에서 내인성 포스포단백질 포스파타제와 상호작용 단백질을 농축하고 질량분석으로 정량하는 방법을. 이 기술은 항체나 외인성 태그 없이도 단백질 상호작용을 연구할 수 있습니다.

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A.N.K.는 NIH R33 CA225458 및 R35 GM119455의 지원을 인정합니다. 우리는 케텐바흐와 거버 연구소의 도움이 되는 토론에 감사드립니다.

<ol><li>Nilsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatases+in+the+regulation+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatases in the regulation of mitosis.</a> Journal of Cell Biology. 218 (2), 395-409 (2019).</li>
<li>Brautigan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Ser%2FThr+phosphatases--the+ugly+ducklings+of+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein Ser/Thr phosphatases--the ugly ducklings of cell signalling.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 324-345 (2013).</li>
<li>Brautigan, D. L., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+serine%2Fthreonine+phosphatases%3A+keys+to+unlocking+regulators+and+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein serine/threonine phosphatases: keys to unlocking regulators and substrates.</a> Annual Review of Biochemistry. 87, 921-964 (2018).</li>
<li>Janssens, V., Goris, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A%3A+A+highly+regulated+family+of+serine%2Fthreonine+phosphatases+implicated+in+cell+growth+and+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A: A highly regulated family of serine/threonine phosphatases implicated in cell growth and signalling.</a> Biochemical Journal. 353, 417-439 (2001).</li>
<li>Virshup, D. M., Shenolikar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+promiscuity+to+precision%3A+protein+phosphatases+get+a+makeover%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">From promiscuity to precision: protein phosphatases get a makeover.</a> Molecular Cell. 33 (5), 537-545 (2009).</li>
<li>Bollen, M., Peti, W., Ragusa, M. J., Beullens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+extended+PP1+toolkit%3A+designed+to+create+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The extended PP1 toolkit: designed to create specificity.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35 (8), 450-458 (2010).</li>
<li>Qian, J., Winkler, C., Bollen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4D-networking+by+mitotic+phosphatases%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">4D-networking by mitotic phosphatases.</a> Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 697-703 (2013).</li>
<li>Heroes, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PP1+binding+code%3A+a+molecular-lego+strategy+that+governs+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">The PP1 binding code: a molecular-lego strategy that governs specificity.</a> The FEBS Journal. 280 (2), 584-595 (2013).</li>
<li>Eichhorn, P. J., Creyghton, M. P., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+regulatory+subunits+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A regulatory subunits and cancer.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1795 (1), 1-15 (2009).</li>
<li>Bantscheff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+chemical+proteomics+reveals+mechanisms+of+action+of+clinical+ABL+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative chemical proteomics reveals mechanisms of action of clinical ABL kinase inhibitors.</a> Nature Biotechnology. 25 (9), 1035-1044 (2007).</li>
<li>Klaeger, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+proteomics+reveals+ferrochelatase+as+a+common+off-target+of+kinase+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Chemical proteomics reveals ferrochelatase as a common off-target of kinase inhibitors.</a> ACS Chemical Biology. 11 (5), 1245-1254 (2016).</li>
<li>Duncan, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+reprogramming+of+the+kinome+in+response+to+targeted+MEK+inhibition+in+triple-negative+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic reprogramming of the kinome in response to targeted MEK inhibition in triple-negative breast cancer.</a> Cell. 149 (2), 307-321 (2012).</li>
<li>Cooper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+multiplexed+kinase+inhibitor+beads+to+study+kinome+adaptations+in+drug-resistant+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Application of multiplexed kinase inhibitor beads to study kinome adaptations in drug-resistant leukemia.</a> PLoS ONE. 8 (6), 66755(2013).</li>
<li>Lyons, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+chemical+proteomic+strategy+for+profiling+phosphoprotein+phosphatases+from+yeast+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A quantitative chemical proteomic strategy for profiling phosphoprotein phosphatases from yeast to humans.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 17 (12), 2448-2461 (2018).</li>
<li>Nasa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+kinase+and+phosphatase+profiling+reveal+that+CDK1+phosphorylates+PP2Ac+to+promote+mitotic+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Signaling%22%5BJournal%5D)">Quantitative kinase and phosphatase profiling reveal that CDK1 phosphorylates PP2Ac to promote mitotic entry.</a> Science Signaling. 13 (648), (2020).</li>
<li>Swingle, M., Ni, L., Honkanen, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+ser%2Fthr+protein+phosphatases%3A+specificity%2C+use+and+common+forms+of+abuse%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of ser/thr protein phosphatases: specificity, use and common forms of abuse.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 23-38 (2007).</li>
<li>Moorhead, G. B. G., Haystead, T. A. J., MacKintosh, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+use+of+the+protein+phosphatase+affinity+matrices+microcystin-sepharose+and+microcystin-biotin-sepharose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and use of the protein phosphatase affinity matrices microcystin-sepharose and microcystin-biotin-sepharose.</a> Methods in Molecular Biology. 365, 39-45 (2007).</li>
<li>Brauer, B. L., Wiredu, K., Mitchell, S., Moorhead, G. B., Gerber, S. A., Kettenbach, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Affinity-based+profiling+of+endogenous+phosphoprotein+phosphatases+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Affinity-based profiling of endogenous phosphoprotein phosphatases by mass spectrometry.</a> Nature Protocols. 16 (10), 4919-4943 (2021).</li>
<li>Hughes, C. S., Moggridge, S., Müller, T., Sorensen, P. H., Morin, G. B., Krijgsveld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-pot%2C+solid-phase-enhanced+sample+preparation+for+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.</a> Nature Protocols. 14 (1), 68-85 (2019).</li>
<li>Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+micro-purification%2C+enrichment%2C+pre-fractionation+and+storage+of+peptides+for+proteomics+using+StageTips%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips.</a> Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).</li>
<li>Zecha, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMT+labeling+for+the+masses%3A+A+robust+and+cost-efficient%2C+in-solution+labeling+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">TMT labeling for the masses: A robust and cost-efficient, in-solution labeling approach.</a> Molecular and Cellular Proteomics. 18 (7), 1468-1478 (2019).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature Methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Eng, J. K., Jahan, T. A., Hoopmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comet%3A+an+open-source+MS%2FMS+sequence+database+search+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Comet: an open-source MS/MS sequence database search tool.</a> Proteomics. 13 (1), 22-24 (2013).</li>
<li>Tyanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Perseus+computational+platform+for+comprehensive+analysis+of+%28prote%29omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data.</a> Nature Methods. 13 (9), 731-740 (2016).</li>
<li>Yu, S. H., Ferretti, D., Schessner, J. P., Rudolph, J. D., Borner, G. H. H., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+Perseus+software+for+omics+data+analysis+With+custom+plugins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Expanding the Perseus software for omics data analysis With custom plugins.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 71 (1), 1-29 (2020).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없으며 이해 상충이 없습니다.

PIB-MS는 단일 분석에서 다양한 샘플 소스로부터 PPPome을 정량적으로 프로파일링하는 데 사용되는 화학적 프로테오믹스 접근법입니다. 키나제 억제제 비드를 사용하여 키노메를 연구하고 암 및 기타 질병 상태10,11,12,13에서 어떻게 변화하는지 연구하기 위해 많은 연구가 수행되었습니다. 그러나 PPPome에 대한 연구는 뒤쳐져 있습니다. 우리는이 접근법이이 격차를 메우고 세포 탈인산화의 조절에 빛을 비출 수있을 것으로 기대합니다. 여기서 우리는 PIB를 사용하여 PP1, PP2A, PP4, PP5 및 PP6의 촉매 및 비촉매 성분을 풍부하게 할 수 있음을 보여줍니다. 우리는 또한 다양한 세포주, 조직 유형 및 유기체에서 새로운 후보 PPP 인터랙터를 확인할 수 있습니다.
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단백질 인산화는 DNA 손상에 대한 반응, 성장 인자 신호전달, 및 유사분열 1,2,3을 통한 통과를 포함하나 이에 한정되지 않는 대부분의 세포 과정을 조절한다. 포유동물 세포에서, 단백질의 대부분은 특정 시점에서 하나 이상의 세린, 트레오닌 또는 티로신 잔기에서 인산화되며, 포스포세린 및 포스포트레오닌은 모든 인산화 부위 2,3의 약 98%를 포함한다. 키나아제는 세포 신호전달에서 광범위하게 연구되어 왔지만, 동적 세포 과정의 조절에서 PPP의 역할은 여전히 대두되고 있다.
인산화 역학은 키나아제와 포스파타제 사이의 동적 상호 작용에 의해 제어됩니다. 포유류 세포에는 세린 / 트레오닌 인산화를 촉매하는 400 개 이상의 단백질 키나아제가 있습니다. 이 부위의 90 % 이상이 포스포 단백질 포스파타제 (PPPs)에 의해 탈인산화되며, PP1, PP2A, PP2B, PP4-7, PPT 및 PPZ 2,3으로 구성된 효소의 작은 군입니다. PP1 및 PP2A는 세포 2,3,4 내에서 포스포세린 및 포스포트레오닌 탈인산화의 대부분을 담당한다. 키나아제와 포스파타제 사이의 수의 현저한 차이와 시험관 내에서 PPP 촉매 서브유닛의 특이성의 결여는 키나아제가 인산화 2,3의 주요 결정인자라는 믿음을 가져왔다. 그러나, 다수의 연구는 포스파타제가 다량체 홀 로효소 5,6,7,8,9의 형성을 통해 기질 특이성을 확립하는 것으로 나타났다. 예를 들어, PP1은 촉매 서브유닛으로 구성되고, 주어진 시간에, 150개 이상의 조절서브유닛 중 하나 6,7,8로 구성되는 이종이량체이다. 반대로, PP2A는 스캐폴딩 (A), 조절 (B), 및 촉매 (C) 서브유닛 2,3,9로 형성되는 헤테로삼량체이다. PP2A 조절 서브유닛(B55, B56, PR72 및 스트리아틴)의 네 개의 별개의 패밀리가 있으며, 각각은 다중 유전자, 스플라이스 변이체 및 국소화 패턴 2,3,9를 갖는다. PPP의 다량체 성질은 키나제 및 PPP 촉매 서브유닛의 수의 갭을 메운다. 그러나 PPP 신호 분석을 연구하기위한 분석적 과제가 발생합니다. PPP 신호 전달을 종합적으로 분석하려면 세포 또는 조직 내의 다양한 홀로효소를 조사하는 것이 중요합니다. 키나제 억제제 비드, 멀티플렉스 억제제 비드 또는 키노비드라고 불리는 키나제 억제제 비드의 사용을 통해 인간 키노메를 연구하는 데 큰 진보가 이루어졌으며, 키나제 억제제가 비드에 고정화되고 질량 분광법이 농축된 키나아제와 그 상호작용자10,11,12,13을 확인하기 위해 사용되는 화학적 프로테오믹 전략이다.
우리는 PPP 생물학을 연구하기 위해 비슷한 접근법을 수립했습니다. 이 기술은 포스파타제 억제제 비드(PIBs)14,15로 불리는 마이크로시스틴-LR(MCLR)이라고 불리는 고정화된 비선택적 PPP 억제제와 함께 비드를 사용하여 PPP 촉매 서브유닛의 친화성 포획을 포함한다. 단백질 활성 또는 국소화를 변경할 수 있는 외인성 PPP 서브유닛의 내인성 태깅 또는 발현을 필요로 하는 다른 방법과는 달리, PIB-MS는 내인성 PPP 촉매 서브유닛, 이들의 관련 조절 및 스캐폴딩 서브유닛, 및 주어진 시점 또는 특정 치료 조건 하에서 세포 및 조직으로부터 상호작용하는 단백질(PPPome이라고 함)의 농축을 허용한다. MCLR은 나노몰 농도에서 PP1, PP2A, PP4-6, PPT 및 PPZ를 억제하여 PIB를 PPPome16의 농축에 매우 효과적으로 만듭니다. 이 방법은 세포로부터 임상 샘플까지 임의의 출발 물질에 사용하기 위해 스케일링될 수 있다. 여기에서는 내인성 PPPome 및 그 변형 상태를 효율적으로 포착, 식별 및 정량화하기 위해 PIB 및 질량 분광법 (PIB-MS)의 사용을 자세히 설명합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2.jpg"> 그림 1: PIB-MS 프로토콜의 시각적 요약. PIB-MS 실험에서, 샘플은 세포에서 종양에 이르기까지 다양한 형태로 수득될 수 있다. 샘플은 PPP 농축 전에 수집, 용해 및 균질화된다. PPPs를 풍부하게하기 위해, 용해물은 MCLR과 같은 PPP 억제제가 있거나 없는 PIBs와 함께 인큐베이션된다. 그런 다음 PIB를 세척하고 PPP는 변성 조건에서 용출됩니다. 샘플은 SP3 단백질 농축, 트립틱 소화 및 탈염을 통한 세제 제거에 의한 질량 분광법 분석을 위해 준비됩니다. 이어서, 샘플은 질량 분광법 분석 전에 선택적으로 TMT 표지될 수 있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63805/63805fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
PIB-MS는 세포 또는 조직의 용해 및 명확화, PIBs를 사용한 용해물의 인큐베이션, 용출, 및 웨스턴 블롯팅 또는 질량 분광법 기반 접근법을 통한 용출액의 분석을 포함한다(도 1). 유리 MCLR의 첨가는 특정 PIB 결합제를 비특이적 인터랙터와 구별하기 위한 대조군으로서 사용될 수 있다. 대부분의 응용 분야에서 라벨이 없는 접근법을 사용하여 용출액에서 단백질을 직접 확인할 수 있습니다. 정량화의 정밀도 향상 또는 저풍부 종의 식별이 필요한 경우, 탠덤 질량 태그(TMT) 라벨링을 사용한 추가 처리를 사용하여 적용 범위를 늘리고 입력을 줄일 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴(ACN)</td><td>Honeywell</td><td>AH015-4</td><td>주의: ACN은 가연성이며 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 흄 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>무수 아세토니트릴</td><td>시그마-알드리치</td><td>271004-100ML</td><td>주의: ACN은 가연성이며 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>실험대용 원심분리기</td>, <td>Eppendorf</td><td>모델 번호 5424</td><td></td></tr>, <tr><td>베타-글리세로인산, 다이소듐 염, 5수화물</td><td>Acros Organics</td><td>410991000</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>, Eppendorf</td><td>모델 번호 5810 R, 15 amp version</td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Dounce tissue 그라인더</td><td>Fisherbrand Pellet Pestles</td><td>12-141-363</td><td></td></tr><tr><td>Empore 고체상 추출 디스크, C18</td><td>CDS Analytical</td><td>76333-132</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tubes, 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td>CRITICAL: 다른 tube는 폴리머를 시료로 침출시켜 분석을 오염시킬 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Eppendorf tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td>CRITICAL: 다른 튜브가 폴리머를 시료에 침출시켜 분석을 오염시킬 수 있습니다.</td></tr><tr><td>추출 플레이트 매니폴드</td><td>Waters</td><td>WAT097944</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 튜브, 50 mL</td><td>VWR</td><td>21008</td><td></td></tr><tr><td>일반 무딘 끝 바늘 및 플런저</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>일반 자기 분리 랙</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>염화수소(HCl)</td><td>VWR 화학 물질 BDH</td><td>BDH3028</td><td>주의 : HCl은 부식성입니다. 장갑을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>하이드록실아민 용액 50% (wt/vol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>467804</td><td></td></tr><tr><td>인큐베이터, 65 &deg; C</td><td>VWR</td><td>모델 번호 1380FM</td><td></td></tr><tr><td>Koptec 순수 에탄올, 200 Proof</td><td>Decon Labs</td><td>V1001</td><td></td></tr><tr><td>HPLC (MeOH) 용 메탄올</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>34860-4L-R</td><td>주의: MeOH는 가연성 및 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>Microcystin LR (MCLR)</td><td>Cayman Chemical</td><td>10007188</td><td>주의: MCLR은 독성이 있습니다. 취급 시 장갑을 착용하고 피부 접촉을 피하십시오.</td></tr><tr><td>PBS, 1&times; 칼슘과 마그네슘 없음, pH 7.4 > 0.1</td><td>코닝</td><td>&nbsp; 21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>pH 테스트 스트립(예: MilliporeSigma MColorpHast pH 테스트 스트립 및 지표 종이</td><td>Fisher Scientific</td><td>M1095310001</td><td></td></tr><tr><td>PIB PIB</td><td></td><td></td><td>생성을 위한 프로토콜은 Moorhead et al., 2007을 참조하십시오.</td></tr><tr><td>Pierce BCA 단백질 분석 키트</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>피펫 팁, 10 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>22491504</td><td>CRITICAL: 다른 팁으로 인해 폴리머가 샘플에 침출되어 분석이 오염될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>피펫 팁, 1000 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>22491555</td><td>위험: 다른 팁으로 인해 폴리머가 샘플에 침출되어 분석이 오염될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>피펫 팁, 200 &mu; L</td><td>Eppendorf</td><td>22491539</td><td>위험: 다른 팁으로 인해 폴리머가 샘플에 침출되어 분석이 오염될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>플라스틱 주사기, 10 mL</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일 III</td><td>Research Products International</td><td>P50700-1</td><td></td></tr><tr><td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량분석기, Oribtrap Fusion, Orbitrap Fusion Lumos, 또는 Orbitrap Eclipse Tribrid 질량분석기&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>냉장 벤치탑 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>모델 번호 5424 R</td><td></td></tr><tr><td>Rotator (Labquake Shaker Rotisserie)</td><td>Thermo Scientific</td><td>13-687-12Q</td><td>8 rpm 회전</td></tr><tr><td>시료 채취 플레이트, 96- 웰, 1 mL</td><td>Waters</td><td>WAT058957</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1311-1</td><td></td></tr><tr><td>염기서열분석 등급 수정된 트립신</td><td>Promega</td><td>V511C</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>EMD 화학물질</td><td>SX0299-1</td><td>주의: 아지드화나트륨은 폭발성과 독성이 있습니다. 장갑을 착용하고, 화학 흄 후드에서 작업하며, 금속과의 접촉을 피하십시오.</td></tr><tr><td>염화나트륨 (NaCl)</td><td>Fisher Chemical</td><td>S27110</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator (Branson digital sonifier)</td><td></td><td>모델 번호. SFX 250</td><td></td></tr><tr><td>SPE C18 탈염 플레이트</td><td>Waters</td><td>186001828BA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedBeads 자기 카르복실레이트 수정 입자 (SP3 비드)</td><td>Cytiva</td><td>6.51521E+13</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>모델 번호. 5350</td><td></td></tr><tr><td>TMT10plex Isobaric Label Reagent Set plus TMT11-131C Label Reagent, 3 &times; 0.8 mg per tag</td><td>ThermoFisher</td><td>A37725</td><td></td></tr><tr><td>트리플루오로아세트산(TFA)</td><td>Honeywell</td><td>T6508-25ML</td><td>주의: TFA는 부식성이 있으며 접촉 시 피부를 자극합니다. 장갑과 보안경을 착용하고 화학 연기 후드에서 작업하십시오.</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Research Products International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>진공 원심 분리기 및 증기 트랩</td><td>Thermo Scientific</td><td>모델 번호 SpeedVac SPD120 및 RVT5105</td><td></td></tr><tr><td>Vortexer(Vortex-Genie 2)</td><td>과학 산업</td><td></td><td></td></tr><tr><td>물 LC-MS</td><td>Honeywell</td><td>LC365-4</td><td></td></tr></tbody></table>

포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

A Mass Spectrometry-Based Approach to Identify Phosphoprotein Phosphatases and their Interactors

대부분의 세포 과정은 동적 단백질 인산화에 의해 조절된다. 단백질의 삼분의 일 이상이 인산화되고, 포스포단백질 포스파타제(PPPs)는 모든 세포 세린/트레오닌 탈인산화의 90% 이상을 배위한다. 단백질 인산화의 탈조절은 암 및 신경변성을 비롯한 다양한 질병의 병태생리학에 연루되어 왔다. 그들의 광범위한 활동에도 불구하고, PPP를 통제하는 분자 메커니즘과 PPP에 의해 제어되는 메커니즘은 저조한 특성화되어 있습니다. 여기에서, 포스파타제 억제제 비드 및 질량 분광분석법 (PIB-MS)이라고 불리는 프로테오믹 접근법은 임의의 세포주 또는 조직을 사용하여 12 시간만큼 적은 시간에 PPPs, 이의 번역 후 변형, 및 이들의 상호작용자를 확인하고 정량화하기 위해 기술된다. PIB-MS는 내인성 PPP 및 이들의 관련 단백질(PPPome이라고 함)을 포획하고 풍부하게하기 위해 세파로스 비드에 고정화된 비선택적 PPP 억제제인 마이크로시스틴-LR(MCLR)을 이용한다. 이 방법은 PPPs의 태그된 버전의 외인성 발현 또는 특정 항체의 사용을 필요로 하지 않는다. PIB-MS는 진화적으로 보존된 PPP를 연구하고 탈인산화 신호전달에 대한 현재의 이해를 넓힐 수 있는 혁신적인 방법을 제공합니다.

<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63805/63805fig02.jpg"> 도 2: 특정 PIBs 결합제의 확인 . (A) PIB-MS를 통해 다양한 조직 유형 또는 세포를 분석할 수 있다. 생물학적 삼중항 내의 HeLa 세포를 DMSO 또는 PPP 억제제 MCLR로 처리하고, PIB와 함께 인큐베이션하고, LC-MS/MS. (B) DMSO 및 MCLR 처리된 HeLa 세포 용해물에서 PIB-MS 분석의 화산 플롯을 통해 분석하였으며, 특정 PIB 결합제는 적색으로 표시되었다. PPP 촉매 서브유닛은 표지되고 파란색으로 표시된다. 새로운 후보 PPP 서브유닛 또는 상호작용 단백질은 검정으로 표시된...

여기에서, 우리는 세포 및 조직으로부터 내인성 포스포단백질 포스파타제와 이들의 상호작용하는 단백질의 농축과 질량 분광법 기반 프로테오믹스에 의한 이들의 확인 및 정량화를 위한 프로토콜을 제시한다.

Most cellular processes are regulated by dynamic protein phosphorylation. More than three-quarters of proteins are phosphorylated, and phosphoprotein ...

PIB-MS는 내인성 인산단백질 포스파타제를 풍부하게 하는 데 사용되는 새로운 기술이며 세포와 조직의 단백질과 상호작용하고 있습니다. 이는 질량 분광법 기반 프로테오믹스를 사용하여 이들 단백질의 확인 및 정량화를 포함한다. 이 기술은 단백질 활성 또는 국소화를 변경할 수 있는 인성 단백질 포스파타제의 태그된 버전의 외인성 발현을 필요로 하지 않는다.또한, 비특이적일 수 있거나 특정 이소형을 구별할 수 없는 항체는 사용하지 않는다. PPPM을 조사하기 위한 이 방법은 세포에서 임상 샘플에 이르기까지 모든 것에 사용하기 위해 스케일링될 수 있다. 시작하기 위해, 실온에서 2분 동안 277회 g에서 원심분리하여 세포 펠릿을 수집한다.배지를 제거하고 세포를 다섯 밀리리터의 PBS로 세척한다. 텍스트 프로토콜에 설명 된대로 용해 버퍼를 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 샘플에 냉각 용해 버퍼 한 밀리리터를 추가 한 다음 음향화로 샘플을 균질화하고 펄스 사이의 얼음 위에 세포를 보관하십시오.용해물을 신선한 1.5 밀리리터 튜브로 옮깁니다. 초음파 처리된 샘플을 섭씨 4도에서 15분 동안 21, 130배 g에서 원심분리한다. 용해물의 분취량을 사용하여 비친코닌산 검정을 사용하여 총 단백질 농도를 정량한다.이 단계는 각 샘플에서 동일한 단백질 농도를 보장하는 데 필수적입니다. 포스포단백질 포스파타제 억제제 대조군의 경우, 각 샘플에 대해 동일한 단백질 농도의 두 분취량을 준비한다. 용해 완충액은 각 튜브가 동일한 단백질 농도를 갖도록 샘플을 희석하는 데 사용할 수 있습니다.하나의 분취량에 유리 마이크로시스틴-LR의 한 마이크로몰을 첨가하고 동일한 부피의 DMSO를 다른 분취량에 첨가한다. 샘플을 볼텍스하고 15분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다. 포스파타제 억제제 비드의 제조는 샘플 준비 섹션에 기재된 인큐베이션 단계 동안 또는 미리 수행되어야 한다.1 밀리그램의 단백질에 10 마이크로 리터의 고체 포스파타제 억제제 비드 또는 PIB 수지를 사용하고 1.5 밀리리터 튜브에 첨가하십시오. 볼텍싱에 의해 0.5 밀리리터의 용해 완충액으로 PIBs 세 배를 세척한 다음, 실온에서 30초 동안 376회 g에서 원심분리하였다. 세척된 PIB에 적절한 양의 용해 완충액을 첨가하여 50% 부피%의 PIB 완충 용액을 만든다.피펫팅하여 피펫 팁과 슬러리를 부드럽게 소용돌이치며 혼합하여 PIB를 재현탁시킨다. 슬러리 20 마이크로리터를 0.5 밀리리터의 용해 완충액이 들어있는 1.5 밀리리터 튜브로 옮긴다. 튜브를 30초 동안 376배 g로 돌립니다.각 튜브에는 동일한 볼륨의 PIB가 포함되어 있습니다. 각 튜브에 고체 수지와 최대 50 마이크로리터의 용해 완충액만을 남기면서 상층액을 버리십시오. 용해물을 PIB를 함유하는 적절하게 표지된 튜브로 옮긴다.용해물을 섭씨 4도에서 한 시간 동안 PIB와 함께 인큐베이션하고 8rpm에서 회전시킨다. 용해물과 함께 인큐베이션한 후, PIBs를 섭씨 4도에서 30초 동안 376배 g에서 원심분리하고 상층액을 제거하였다. 0.5 밀리리터의 용해 완충액을 첨가하고 튜브를 반전시켜 비드를 세척하고 원심분리에 의해 비드를 수집하고 상층액을 제거하십시오.총 세 번의 세척에 대해 이 단계를 반복합니다. 최종 세척 후, PIB를 피펫팅하지 않고 용해 완충액을 가능한 한 많이 제거한다. 2%SDS를 포함하는 용출 완충액을 준비하고 PIB 부피의 네 배에서 다섯 배까지 용출 완충액을 첨가한다.섭씨 65도에서 한 시간 동안 배양하여 비드로부터 포스포단백질 포스파타제를 용출시킨다. 튜브를 실온에서 30초 동안 376회 g로 원심분리한다. 용출액을 별도의 튜브로 수집하고 질량 분광법 분석 또는 웨스턴 블롯팅을 진행하십시오.PIB를 재생성시키기 위해, 실온에서 한 시간 동안 8 rpm에서 회전하면서 2%SDS 용액에서 인큐베이션한다. 비드를 세척당 30분 동안 회전하면서 25 밀리몰 Tris-HCl pH 7.5에서 3 내지 5회 세척한다. PIB를 아지드 나트륨을 사용하여 25밀리몰 트리스 HCL pH 7.5에 보관하십시오.질량 분광법 분석의 경우, 데이터 필터링 및 분석 방법은 다양하며 연구자 또는 핵심 시설에 의해 수행 될 수 있습니다. 종별 프로테옴 데이터베이스에 대해 원시 데이터를 검색한 후 검색 결과를 필터링하여 Microsoft Excel 워크시트로 내보냅니다. 데이터를 세 배로 분석합니다.라벨이 없는 정량화의 경우 MS1 피크 면적 측정을 사용하여 데이터를 정량화합니다. PPP 서브유닛과 그들의 상호작용자 드 노보를 확인하기 위해, 마이크로시스틴-LR-억제된 샘플과 DMSO 처리된 샘플의 생물학적 삼중항을 비교한다. 세 개의 DMSO 대조군-처리된 샘플 중 적어도 두 개 중 하나 초과의 총 펩티드 카운트를 갖는 단백질만이 존재하도록 데이터를 필터링한다.수지에 비특이적으로 결합하는 단백질을 걸러내기 위해, 마이크로시스틴-LR 처리 조건에서의 총 펩티드 카운트가 임의의 PPP 촉매 서브유닛에 대한 것보다 높은 단백질을 제거한다. 케라틴, 콜라겐, 리보솜 단백질 및 이종 핵 리보뉴클레오 단백질과 같은 일반적인 오염 물질을 분석에서 제외합니다. CSV 파일은 페르세우스로 데이터를 가져오는 데 필수적입니다.로드 섹션에서 일반 매트릭스 업로드를 클릭하여 필터링된 데이터를 페르세우스로 가져옵니다. 기본 변환으로 이동하여 데이터를 선택하고 변환 함수를 x의 로그 베이스 2로 지정하여 데이터를 변환합니다. Imputation으로 이동하고, 정규 분포에서 누락된 값 바꾸기, 데이터를 선택하고, 계산을 위한 너비와 다운시프트를 지정하여 정규 분포에서 누락된 값을 함축합니다.정규화, 분위수 정규화로 이동하여 분위수 정규화를 수행합니다. 주석 행, 범주형 주석 행으로 이동하여 데이터에 주석을 추가합니다. 테스트, 두 샘플 테스트로 이동하여 그룹, 수행할 테스트 및 절단에 사용되는 여러 가설 테스트 수정 방법으로 이동하여 스튜던트 T 테스트를 수행합니다.이 함수는 또한 로그 2 비율을 계산합니다. 포스포단백질 포스포테이트 및 이들의 상호작용자는 PIB 풀다운 실험을 사용하여 HeLa 세포에서 확인되었고, 이어서 DMSO 처리 및 마이크로시스틴-LR 처리된 샘플에서 단백질 풍부도의 라벨 없는 정량화가 뒤따랐다. 질량 분광법 분석의 화산 플롯은 적색으로 표시된 특정 PIB 결합제, 파란색의 촉매 서브 유닛 및 새로운 후보 PPP 서브 유닛 또는 상호 작용하는 단백질을 흰색으로 확인했습니다.비특이적 결합제는 회색으로 나타났다. DMSO 처리된 HeLa 세포 용해물로부터의 log2 영역의 산점도는 풍부도가 고도로 상관관계가 있음을 보여주었고, 이는 데이터의 재현성을 나타낸다. 모든 형광체 단백질 포스파타제 서브유닛과 상호작용 단백질의 네트워크 분석은 이들 단백질이 PIB 풀다운에서 특이적인 상호작용자임을 보여주었다.글로벌 프로테오믹스 분석을 수행할 수 있었고, 그 결과를 PIB 분석과 비교하여 PPPome 조성물이 PPP 풍부도에 의해 구동되는지 또는 번역 후 메커니즘에 의해 조절되는지를 결정할 수 있었다. PIB-MS는 간상 대 유사분열 샘플 또는 암 세포주 간의 차이와 같은 다양한 조건 하에서 PPP 발현 패턴의 차이를 확인할 수 있게 해주는 광범위하게 적용 가능한 도구입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

인단백질 인산분해효소(Phosphoprotein Phosphatases)와 그 인터랙터를 식별하기 위한 질량 분석 기반 접근법

cryolysis, 요소의 solubilziation, HILIC 분류 및 phosphorylated 펩티드의 아이맥 농축을 사용하여 양적 인산화 과정에 대한 설명.

지방산의 정량 Phosphoproteomics은 자극 Saccharomyces cerevisiae</em

우리는 여기에서 식물 단백질 복합체의 정제 및 특성에 대한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 단지 내에 하나의 단백질을 immunoprecipitating에 의해, 그래서 우리는 그것의 번역 후 변형과 상호 작용하는 파트너를 식별 할 수있는 것을 보여줍니다.

식물 단백질 복합체의 번역 후 변형의 확인

단백질 인산화는 세포가 세포 외 환경에서 정보를 해석하고 반응하는 방법의 핵심 기능입니다. 여기에서는 포유류 세포에서 정제된 kinase를 사용하여 관심 기질을 인산화하는 kinase를 신속하게 식별하는 고처리량 스크리닝 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 검열을 사용 키나제 기판 쌍의 식별

펩타이드 경쟁 분석은 다양한 분자 및 면역 학적 실험에 널리 사용됩니다. 이 논문은 in vitro 올리고 펩티드 - 경쟁 키나아제 분석 및 특정 인산화 부위를 찾는 데 유용한 관련 검증 절차에 대한 상세한 방법을 기술한다.

인산화 부위 결정을위한 올리고 펩타이드 경쟁 분석

이 프로토콜에는 전립선 암 세포 선 또는 단백질 질량 분석 기반 을 통해 phosphoproteome의 분석에 대 한 조직에서 phosphopeptides을 풍부 하 게 추출 하는 절차를 설명 합니다.

전립선 암에 있는 Phosphoproteome를 조사 하기 위해 양적 라벨 무료 질량 분석으로 결합 된 Phosphopeptide 농축

여기, 우리는 공동 immunoprecipitation과 동시에 효소 모집 및 효소 활동에 원형질 막 수용 체의 특정 단백질 도메인의 기여를 연구에 구슬 효소 활동 분석 결과 대 한 프로토콜을 제시.

수용 체와 효소 간의 기능 상호 작용을 공부에 대 한 분석 결과 Co-immunoprecipitation

우리는 강력한 생화확적인 접근을 사용하여 새로운 키나아제 단백질을 특징으로 했습니다: 다른 세포주 및 조직에 있는 전용적인 항체를 가진 서쪽 얼룩 분석, coimmunocipation 실험에 의하여 상호 작용, 서쪽에 의해 검출된 키나아제 활동 인광 특이적 항체를 사용하여 블롯[32 P] ATP 라벨링에 의해.

새로운 키나제 단백질의 강력한 생화학 적 접근법을 사용하여 분자 수준에서특성화

이 프로토콜은 이노 시 톨 인산 염 또는 인산 염에 바인딩하는 단백질의 식별에 초점을 맞추고. 그것은 아가로스 또는 자기 구슬에 streptavidin을 통해 고정되는 생물이노시톨 인산염 또는 인산화물과 친화성 크로마토그래피를 사용합니다. 이노시톨 인산염 또는 인산화결합 단백질은 서양 블로팅 또는 질량 분석법에 의해 확인된다.

이노시톨 인산염 또는 인산성교단백질의 동정은 서부 블롯 또는 질량분광법에 결합된 친화성 크로마토그래피에 의한 단백질

본 프로토콜은 개선된 단일 분자 풀다운(SiMPull) 분석을 사용하여 단백질 인산화를 정량화하기 위한 샘플 준비 및 데이터 분석을 기술한다.

단백질 인산화의 정량화를 위한 최적화된 단일 분자 풀다운 분석

번역 후 변형(PTM)은 단백질 구조와 기능을 변화시킵니다. 여러 PTM 유형을 동시에 농축하는 방법은 분석에서 적용 범위를 최대화할 수 있습니다. 우리는 이중 작용성 Ti (IV) 고정화 금속 친화성 크로마토그래피를 사용한 프로토콜을 제시하고 췌장 조직에서 단백질 N- 글리코실화 및 인산화의 동시 농축 및 분석을 위해 질량 분광법을 제시합니다.

인간 췌장 조직에서 N-글리코펩티드와 포스포펩티드의 동시 분석을 위한 스핀-팁 농축 전략

배우세요 PIB-MS 기법을 이용하여 세포와 조직에서 내인성 포스포단백질 포스파타제와 상호작용 단백질을 농축하고 질량분석으로 정량하는 방법을. 이 기술은 항체나 외인성 태그 없이도 단백질 상호작용을 연구할 수 있습니다.

포스포단백질 포스파타제와 그 상호작용자를 확인하기 위한 질량분석법 기반 접근법

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