인단백질 인산분해효소(Phosphoprotein Phosphatases)와 그 인터랙터를 식별하기 위한 질량 분석 기반 접근법

PIB-MS는 내인성 인단백질 인산가수분해효소(endogenous phosphatase)를 농축하는 데 사용되는 새로운 기술로, 세포와 조직의 단백질과 상호 작용합니다. 여기에는 질량 분석 기반 단백질체학을 사용하여 이러한 단백질을 식별하고 정량화하는 작업이 포함됩니다. 이 기술은 단백질 활성이나 국소화를 변경할 수 있는 인단백질 인산가수분해효소의 태그가 지정된 버전의 외인성 발현을 필요로 하지 않습니다.

또한 비특이적이거나 특정 동형을 구별할 수 없는 항체를 사용하지 않습니다. PPPM을 조사하기 위한 이 방법은 세포에서 임상 샘플에 이르기까지 모든 것에 사용할 수 있도록 확장할 수 있습니다. 먼저 실온에서 2분 동안 277배 g의 원심분리를 통해 세포 펠릿을 수집합니다.

배지를 제거하고 5ml의 PBS로 세포를 세척합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 용해 버퍼를 준비하고 얼음 위에 보관하십시오. 샘플에 1ml의 냉각 용해 완충액을 추가한 다음 음파화로 샘플을 균질화하고 펄스 사이에 세포를 얼음 위에 유지합니다.

용해물을 새 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 초음파 처리 된 샘플을 섭씨 4도에서 15 분 동안 21, 130 회 g에서 원심 분리한다. 용해물의 부분 표본을 사용하여 bicinchoninic acid assay를 사용하여 총 단백질 농도를 정량화합니다.

이 단계는 각 샘플에서 동일한 단백질 농도를 보장하는 데 필수적입니다. 인단백질 인산가수분해효소 억제제 제어를 위해 각 샘플에 대해 동일한 단백질 농도의 두 개의 부분 표본을 준비합니다. 용해 완충액을 사용하여 각 튜브가 동일한 단백질 농도를 갖도록 샘플을 희석할 수 있습니다.

한 부분 표본에 유리 microcystin-LR의 1마이크로몰을 추가하고 다른 부분 표본에 동일한 부피의 DMSO를 추가합니다. 샘플을 소용돌이치고 15분 동안 얼음 위에서 배양합니다. phosphatase inhibitor beads의 준비는 미리 또는 sample preparation section에 설명된 incubation 단계 중에 수행해야 합니다.

단백질 1mg에 10마이크로리터의 고체 인산가수분해효소 억제제 비드 또는 PIB 수지를 사용하여 1.5ml 튜브에 추가합니다. 볼텍싱(vortexing)에 의해 0.5 밀리리터의 용해 완충액으로 PIB를 세 번 세척한 후 실온에서 30초 동안 376회 g에서 원심분리합니다. 세척된 PIB에 적절한 양의 용해 완충액을 첨가하여 50% 부피 기준 PIB 완충액을 만듭니다.

부드럽게 피펫팅하여 혼합하고 피펫 팁과 슬러리를 휘젓어 PIB를 다시 현탁시킵니다. 20마이크로리터의 슬러리를 0.5ml의 용해 완충액이 들어 있는 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 30초 동안 376회 g으로 튜브를 돌립니다.

각 튜브에는 동일한 부피의 PIB가 포함되어 있습니다. 상층액은 버리고 각 튜브에는 고체 수지와 최대 50마이크로리터의 용해 완충액만 남깁니다. 용해물을 PIB를 포함하는 적절하게 라벨링된 튜브로 옮깁니다.

8rpm에서 회전하면서 섭씨 4도에서 1시간 동안 PIB로 용해물을 배양합니다. 용해물로 배양한 후, PIB를 섭씨 4도에서 30초 동안 376회 g로 원심분리하고 상등액을 제거합니다. 0.5ml의 용해 완충액을 첨가하고 튜브를 뒤집어 비드를 세척하고 원심분리로 비드를 수집하고 상층액을 제거합니다.

이 단계를 반복하여 총 3회 세탁합니다. 최종 세척 후 PIB를 피펫팅하지 않고 용해 버퍼를 최대한 제거합니다. 2%SDS를 함유하는 용출 완충액을 준비하고 PIB 부피의 4-5배에 달하는 용출 완충액을 첨가합니다.

섭씨 65도에서 1시간 동안 배양하여 비드에서 인단백질 인산가수분해효소를 용리시킵니다. 실온에서 30초 동안 376회 g으로 튜브를 원심분리합니다. 용리액을 별도의 튜브에 모으고 질량 분석 또는 웨스턴 블로팅을 진행합니다.

PIB를 재생하려면 실온에서 1시간 동안 8rpm으로 회전하면서 2% SDS 용액에서 PIB를 배양합니다. 비드를 25 밀리 몰 Tris-HCl pH 7.5에서 세척 당 30 분 동안 회전하면서 3-5 번 세척합니다. PIB는 아지드화나트륨과 함께 25밀리몰 Tris HCL pH 7.5에 보관하십시오.

질량 분석 분석의 경우 데이터 필터링 및 분석 방법이 다양하며 연구원 또는 핵심 시설에서 수행할 수 있습니다. 종별 단백질체 데이터베이스에 대해 원시 데이터를 검색한 후 검색 결과를 필터링하고 Microsoft Excel 워크시트로 내보냅니다. 데이터를 세 번으로 분석합니다.

무표지 정량화의 경우 MS1 피크 면적 측정을 사용하여 데이터를 정량화합니다. PPP subunit과 그 상호작용 인자를 식별하기 위해 microcystin-LR 억제 및 DMSO 처리된 샘플의 생물학적 삼중체를 비교하십시오. 총 펩타이드 수가 DMSO 대조군 처리된 샘플 3개 중 최소 2개 중 1개 이상인 단백질만 존재하도록 데이터를 필터링합니다.

수지에 비특이적으로 결합하는 단백질을 걸러내려면 마이크로시스틴-LR 처리 조건의 총 펩타이드 수가 PPP 촉매 서브유닛의 총 펩타이드 수보다 높은 단백질을 제거합니다. 케라틴, 콜라겐, 리보솜 단백질 및 이종 핵 리보핵단백질과 같은 일반적인 오염 물질을 분석에서 제외합니다. CSV 파일은 데이터를 Perseus로 가져오는 데 필수적입니다.

Load 섹션에서 Generic matrix upload를 클릭하여 필터링된 데이터를 Perseus로 가져옵니다. Basic Transform으로 이동하여 데이터를 선택하고 변환 함수를 x의 밑이 2인 로그로 지정하여 데이터를 변환합니다. 정규 분포에서 누락된 값을 대치하려면 Imputation, Replace missing values from normal distribution으로 이동하여 데이터를 선택하고 계산을 위한 너비와 하향 이동을 지정합니다.

Normalize, Quantile normalization으로 이동하여 Quantile normalization을 수행합니다. Annot rows, Categorical annotation rows(범주형 주석 행)로 이동하여 데이터에 주석을 추가합니다. 테스트, 2표본 테스트로 이동하여 그룹을 선택하고 수행할 테스트 및 잘림에 사용되는 다중 가설 테스트 수정 방법을 선택하여 학생의 T 테스트를 수행합니다.

이 함수는 로그 2 비율도 계산합니다. 인단백질 포스포테이트 및 그 상호작용 인자는 PIB 풀다운 실험을 사용하여 HeLa 세포에서 식별된 후 DMSO 처리 및 마이크로시스틴-LR 처리 샘플에서 단백질 풍부도를 표지 없이 정량화했습니다. 질량 분석의 화산 플롯은 빨간색으로 표시된 특정 PIB 바인더, 파란색으로 표시된 촉매 소단위체, 흰색으로 표시된 새로운 후보 PPP 소단위 또는 상호 작용 단백질을 식별했습니다.

비특이적 바인더는 회색으로 표시되었습니다. DMSO 처리된 HeLa 세포 용해물에서 log2 영역의 산점도는 존재량이 높은 상관관계를 보였으며 이는 데이터의 재현성을 나타냅니다. 모든 인단백질 인산가수분해효소 소단위 및 상호 작용 단백질의 네트워크 분석은 이러한 단백질이 PIB 풀다운에서 특정 상호 작용자임을 보여주었습니다.

글로벌 단백질체학 분석을 수행하고 그 결과를 PIB 분석과 비교하여 PPPome 조성이 PPP 풍부에 의해 주도되는지 또는 번역 후 메커니즘에 의해 조절되는지 확인할 수 있습니다. PIB-MS는 간기 샘플과 유사분열 샘플 또는 암 세포주 간의 차이와 같은 다양한 조건에서 PPP 발현 패턴의 차이를 식별할 수 있는 광범위하게 적용 가능한 도구입니다.