Name: 여러 형광 염색 및 조직 제거 접근법을 사용하여 3D 패턴으로 털이 많고 글래브러스 한 피부 신경을 보여줍니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: 학습하세요 콘포컬 현미경을 이용한 조직 투명화 기법으로 두꺼운 피부 절편에서 CGRP 양성 신경 섬유의 3D 네트워크를 관찰하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구자들이 피부 신경 분포를 정밀하게 분석하는 데 도움을 줍니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 중국 의학 과학 혁신 기금의 중국 아카데미에 의해 지원되었다 (프로젝트 코드 번호. CI2021A03404) 및 국가 전통 중국 의학 학제 간 혁신 기금 (프로젝트 코드 번호. ZYYCXTD-D-202202).

본 연구는 중국 의학 아카데미 침술 및 Moxibustion 연구소의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (참조 번호 D2018-04-13-1). 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드 (National Academy Press, Washington, D.C., 1996)에 따라 수행되었습니다. 세 마리의 성인 수컷 래트 (Sprague-Dawley, 체중 230 ± 15 g)를 본 연구에 사용하였다. 모든 동물은 온도와 습도가 조절 된 12 시간의 빛 / 어둠주기에 수용되었으며 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있었습니다.
1. 관류 및 샘플 준비
<ol><li>안락사를 유도하기 위해 250 mg / kg의 트리브로모 에탄올 용액 ( 물질 표 참조)을 쥐에 복강내 주사하십시오.</li>
	<li>호흡이 멈추면 스테인레스 스틸 외과 용 가위를 사용하여 쥐의 흉강을 엽니 다. 20G 바늘을 사용하여 좌심실13을 0.9% 정상 식염수 100mL와 함께 3mL/min의 속도로 관류시킨 다음 0.1M 인산염 완충액(PB, pH 7.4)에서 4% 파라포름알데히드 250-300mL를 사용합니다(그림 1A, B).</li>
	<li>관류 후, 메스를 사용하여 뒷발에서 등받이와 발바닥의 피부를 제거하십시오.<ol>
<li>냉동 절편을 필요로 하는 샘플의 경우, 조직을 2시간 동안 0.1 M PB 중의 4% 파라포름알데히드에 고정시킨 후; 이어서 조직을 4°C에서 24시간 이상 동안 0.1 M PB 중의 25% 수크로오스로 보호한다.</li>
		<li>조직 제거를 필요로 하는 두꺼운 절편을 갖는 샘플의 경우, 조직을 1x 포스페이트 완충 식염수(1x PBS) 중의 4% 파라포름알데히드에 2시간 동안 고정시킨 후; 그런 다음 조직을 4°C에서 1x PBS로 동결 보호한다(그림 1C–E).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CGRP, phalloidin 및 LYVE1로 삼중 형광 염색을 한 후 조직 제거 처리
참고: CGRP, phalloidin 및 LYVE1을 사용한 삼중 형광 염색을 적용하여 조직 제거 처리 후 두께가 300 μm인 조직 절편에 털이 많고 글래브러스 피부의 신경 섬유, 혈관 및 림프관을 밝혔습니다.
<ol><li>2% 아가로오스를 1x PBS에서 2분 동안 마이크로오븐에서 가열하여 아가로오스가 용해될 때까지 제조하였다(표 참조).</li>
	<li>세척 후, 피부 조직을 37°C에서 2% 아가로오스에 집어넣고, 이를 아이스박스 내부에 넣어 냉각시킨다(그림 1F,G).</li>
	<li>장착된 조직을 빙수로 진동 마이크로톰에 고정시키고 횡단 방향으로 500 μm의 두께로 슬라이스한다. 진동 슬라이서 및 마무리 슬라이싱을 설정하려면 속도, 0.50mm/s, 진폭 1.5mm(그림 1H-K)를 설정합니다.</li>
	<li>슬라이스 후, 절편으로부터 아가로스를 제거하고, 이를 1x PBS(pH 7.4)로 6웰 플레이트에 저장한다(도 1L).</li>
	<li>조직 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 1x PBS(TriX-PB) 중의 2% 트리톤 X-100의 용액으로 인큐베이션한다. 다음 절차는 그림 2 를 참조하십시오.</li>
	<li>조직 절편을 블로킹 완충액에 넣고 4°C에서 하룻밤 동안 진탕기 상에서 72 rpm으로 회전시킨다. 참고: 블로킹 완충액 조성물은 1x PBS 중 10% 정상 당나귀 혈청, 1% 트리톤-X 100, 및 0.2% 아지드 나트륨이다( 표 참조).</li>
	<li>조직 절편을 마이크로원심분리 튜브 내의 희석 완충액에 마우스 모노클로날 항-CGRP (1:500) 및 양 폴리클로날 항-LYVE1 항체 (1:500)의 1차 항체를 함유하는 용액 ( 표 문헌 참조)에 넣고, 4°C에서 2일 동안 진탕기 상에서 회전시킨다. 참고: 희석 완충액 조성물은 1x PBS 중의 1% 정상 당나귀 혈청, 0.2% 트리톤-X 100, 및 0.2% 아지드 나트륨이다.</li>
	<li>조직 절편을 실온에서 세척 완충액으로 두 번 세척한 다음, 세척 완충액 중에서 4°C에서 밤새 진탕기 상에 보관한다. 주: 세척 완충액 조성물은 0.1 M PB (pH 7.4) 중 0.2% 트리톤-X 100이다.</li>
	<li>다음날, 조직 절편을 당나귀 항-마우스 IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) 및 당나귀 항-양 IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) 및 Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000) ( 물질표 참조)의 2차 항체를 포함하는 혼합 용액으로 옮기고 마이크로원심분리 튜브에서 72 rpm으로 회전시키고 4°C에서 5시간 동안 진탕기에서 회전시킨다.</li>
	<li>여섯 웰 플레이트에서 조직 절편을 실온에서 1 시간, 두 번 세척 완충액으로 세척하십시오. 조직 절편을 4°C에서 하룻밤 동안 진탕기 상의 세척 완충액에 보관한다.</li>
	<li>조직 절편을 조직 클리어링 시약 내로 옮기고( 표 참조, 그의 부피는 샘플 부피보다 다섯 배 더 컸다) 진탕기 상에서 60 rpm으로 실온에서 1 h 동안 부드럽게 회전시킨다. 참고: 이 치료 후 조직 절편이 명확해집니다(그림 2B).</li>
	<li>클리어 티슈를 슬라이드에 장착하고, 스페이서로 조직을 동그라미로 돌린 다음, 신선한 조직 제거 시약과 커버슬립으로 틈새를 붙입니다.</li>
</ol>3. 통상적인 접근법에 따른 CGRP, 팔로이딘 및 LYVE1을 이용한 삼중 형광 염색
참고: 비교로서, 통상적인 기술에 따라 30 μm의 두께로 조직 절편에 대해 동일한 염색을 수행하였다.
<ol><li>조직 절편을 횡단 방향으로 마이크로톰에서 30μm로 슬라이스하여 슬라이드에 장착합니다.</li>
	<li>0.1 M PB 중 3% 정상 당나귀 혈청 및 0.3% 트리톤 X-100으로 블로킹 용액을 첨가하고, 절편을 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>블로킹 용액을 제거하고, 절편을 마우스 모노클로날 항-CGRP (1:500) 및 양 폴리클로날 항-LYVE1 항체 (1:500)의 1차 항체를 함유하는 용액과 함께 4°C에서 하룻밤 동안 희석 완충액에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>다음날, 조직 절편을 0.1 M PB (pH 7.4)로 세 번 세척하고, 당나귀 항-마우스 IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) 및 당나귀 항양 IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500) 및 Alexa-Flour594 phalloidin (1:1000)의 2차 항체를 포함하는 혼합 용액을 절편에 첨가하고, 실온에서 1 h 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>현미경 관찰 전에, 절편을 0.1 M PB (pH 7.4)로 세 번 세척한 다음, 50% 글리세린의 커버슬립으로 덮는다.</li>
</ol>4. 이미징 및 분석
<ol><li>염색된 시료를 형광현미경으로 관찰한 다음, 공초점 현미경을 이용하여 영상을 촬영하였다.</li>
	<li>각 300 μm 두께의 섹션으로부터 각각 10 μm 프레임에서 30개의 이미지(Z-스택)를 캡처하고 공초점 현미경 시스템의 이미지 프로세서를 사용하여 단일 인-포커스 이미지를 통합합니다( 자료 표 참조).<ol>
<li>3차원(3D) 분석을 위한 공초점 설정의 이미지 처리 소프트웨어에서 다음 단계를 수행합니다: 초점면 시작 | 설정 초점 평면 끝 | 설정 단계 크기를 |으로 설정 깊이 패턴 | 선택 이미지 캡처 | Z 시리즈. 참고: 청색 형광 신호의 여기 및 방출 파장은 각각 401nm 및 421nm였다. 녹색 형광 신호의 여기 및 방출 파장은 각각 499 nm 및 519 nm였다. 적색 형광 신호의 여기 및 방출 파장은 각각 591 nm 및 618 nm였다. 152 μm는 공초점 핀홀의 직경이다(10x 대물렌즈, NA: 0.4). 이미지 캡처 해상도는 1024 × 1024 픽셀이었습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>종래의 샘플의 경우(단계 3), 각 30 μm 두께의 섹션으로부터 1 μm 프레임에서 30개의 이미지(Z-스택)를 캡처하고, 이들 이미지를 상기 언급된 바와 같이 추가로 처리한다(단계 4.1-4.2).</li>
	<li>이미지 처리 시스템을 사용하여 3D 재구성 패턴의 이미지를 시연합니다.</li>
	<li>Z-스택 공초점 이미지를 Imaris 9.0(셀 이미징 소프트웨어, 재질 표 참조)으로 가져와 3D 재구성을 수행하고 얼룩 강도를 기반으로 표면 렌더링을 생성: 새 서피스 추가 | 소스 채널 | 선택 서피스 세부 정보 |의 부드러운 옵션에서 매개변수 결정 절대 강도 |의 임계값 옵션에서 매개변수 결정 서피스 | 분류 마침.</li>
	<li>세포 이미징 소프트웨어를 사용하여 양성 신경 섬유의 표면적에 대한 데이터를 수집합니다. 렌더링된 이미지 |을 선택합니다. 통계 | 자세한 | 특정 값 | 볼륨.</li>
</ol>

<ol><li>Vidal Yucha, S. E., Tamamoto, K. A., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+the+neuro-immuno-cutaneous+system+on+human+skin+equivalent+design%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Proliferation%22%5BJournal%5D)">The importance of the neuro-immuno-cutaneous system on human skin equivalent design.</a> Cell Proliferation. 52 (6), 12677(2019).</li>
<li>Wu, H., Williams, J., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphologic+diversity+of+cutaneous+sensory+afferents+revealed+by+genetically+directed+sparse+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Morphologic diversity of cutaneous sensory afferents revealed by genetically directed sparse labeling.</a> Elife. 1, 00181(2012).</li>
<li>Pomaville, M. B., Wright, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+and+genetic+labeling+of+hairy+and+glabrous+skin+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Currents+Protocols%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical and genetic labeling of hairy and glabrous skin innervation.</a> Currents Protocols. 1 (5), 121(2021).</li>
<li>Navarro, X., Verdú, E., Wendelscafer-Crabb, G., Kennedy, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innervation+of+cutaneous+structures+in+the+mouse+hind+paw%3A+a+confocal+microscopy+immunohistochemical+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Innervation of cutaneous structures in the mouse hind paw: a confocal microscopy immunohistochemical study.</a> Journal of Neuroscience Research. 41 (1), 111-120 (1995).</li>
<li>Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat+mount+imaging+of+mouse+skin+and+its+application+to+the+analysis+of+hair+follicle+patterning+and+sensory+axon+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology.</a> Journal of Visualized Experiments. (88), e51749(2014).</li>
<li>Yamazaki, T., Li, W., Mukouyama, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+confocal+microscopy+for+adult+ear+skin%3A+a+model+system+to+study+neuro-vascular+branching+morphogenesis+and+immune+cell+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole-mount confocal microscopy for adult ear skin: a model system to study neuro-vascular branching morphogenesis and immune cell distribution.</a> Journal of Visualized Experiments. (133), e57406(2018).</li>
<li>Hendrix, S., Picker, B., Liezmann, C., Peters, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+and+hair+follicle+innervation+in+experimental+models%3A+a+guide+for+the+exact+and+reproducible+evaluation+of+neuronal+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Skin and hair follicle innervation in experimental models: a guide for the exact and reproducible evaluation of neuronal plasticity.</a> Experimental Dermatology. 17 (3), 214-227 (2008).</li>
<li>Salz, L., Driskell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+whole+mount%3A+a+novel+processing+and+imaging+protocol+for+thick%2C+three-dimensional+tissue+cross-sections+of+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Horizontal whole mount: a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-sections of skin.</a> Journal of Visualized Experiments. (126), e56106(2017).</li>
<li>Yokomizo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-mount+three-dimensional+imaging+of+internally+localized+immunostained+cells+within+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Whole-mount three-dimensional imaging of internally localized immunostained cells within mouse embryos.</a> Nature Protocols. 7 (3), 421-431 (2012).</li>
<li>Jing, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+of+both+hard+and+soft+tissue+organs+with+the+PEGASOS+method%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the PEGASOS method.</a> Cell Research. 28 (8), 803-818 (2018).</li>
<li>Pende, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+ultramicroscopy+of+the+developing+and+adult+nervous+system+in+optically+cleared+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">High-resolution ultramicroscopy of the developing and adult nervous system in optically cleared Drosophila melanogaster.</a> Nature Communications. 9 (1), 4731(2018).</li>
<li>Russell, F. A., King, R., Smillie, S. J., Kodji, X., Brain, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcitonin+gene-related+peptide%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Calcitonin gene-related peptide: physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 94 (4), 1099-1142 (2014).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+the+calcitonin+gene-related+peptide+immunoreactive+innervation+of+the+rat+cranial+dura+mater+with+immunofluorescence+and+neural+tracing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing the calcitonin gene-related peptide immunoreactive innervation of the rat cranial dura mater with immunofluorescence and neural tracing.</a> Journal of Visualized Experiments. (167), e61742(2021).</li>
<li>Wulf, E., Deboben, A., Bautz, F. A., Faulstich, H., Wieland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+phallotoxin%2C+a+tool+for+the+visualization+of+cellular+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Fluorescent phallotoxin, a tool for the visualization of cellular actin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (9), 4498-4502 (1979).</li>
<li>Banerji, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LYVE-1%2C+a+new+homologue+of+the+CD44+glycoprotein%2C+is+a+lymph-specific+receptor+for+hyaluronan%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan.</a> Journal of Cell Biology. 144 (4), 789-801 (1999).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CUBIC+protocols+for+whole-brain+and+whole-body+clearing+and+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).</li>
<li>Liang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CUBIC+protocol+visualizes+protein+expression+at+single+cell+resolution+in+whole+mount+skin+preparations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">CUBIC protocol visualizes protein expression at single cell resolution in whole mount skin preparations.</a> Journal of Visualized Experiments. (114), e54401(2016).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li>
<li>Ashrafi, M., Baguneid, M., Bayat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+neuromediators+and+innervation+in+cutaneous+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Dermato-Venereologica%22%5BJournal%5D)">The role of neuromediators and innervation in cutaneous wound healing.</a> Acta Dermato-Venereologica. 96 (5), 587-594 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+examining+the+neurovascular+structure+with+phalloidin+and+calcitonin+gene-related+peptide+in+the+rat+cranial+dura+mater%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Histology%22%5BJournal%5D)">A new approach for examining the neurovascular structure with phalloidin and calcitonin gene-related peptide in the rat cranial dura mater.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 541-548 (2020).</li>
<li>Chazotte, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Labeling+cytoskeletal+F-actin+with+rhodamine+phalloidin+or+fluorescein+phalloidin+for+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Labeling cytoskeletal F-actin with rhodamine phalloidin or fluorescein phalloidin for imaging.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2010).</li>
<li>Breslin, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+vessel+network+structure+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Comprehensive+Physiology%22%5BJournal%5D)">Lymphatic vessel network structure and physiology.</a> Comprehensive Physiology. 9 (1), 207-299 (2018).</li>
<li>Schwager, S., Detmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+lymphatic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and lymphatic function.</a> Frontiers in Immunology. 10, 308(2019).</li>
<li>Hagan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+fission+yeast+filamentous+actin+with+fluorescent+phalloidin+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocol%22%5BJournal%5D)">Staining fission yeast filamentous actin with fluorescent phalloidin conjugates.</a> Cold Spring Harbor Protocol. (6), (2016).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

본 연구는 클리어링 처리와 함께 두꺼운 조직 절편에 대한 면역 형광을 사용하여 털이 많고 글래브러스 피부에서 피부 신경 섬유의 상세한 시연을 제공하고 피부 신경을 더 잘 이해하기 위한 3D 뷰를 제공합니다. 최대 1-2일의 항체 인큐베이션 시간 및 하룻밤 세척 과정이 중요하다. 이 두 가지 주요 단계는 두꺼운 절편의 면역 형광 염색 효과에 직접적인 영향을 미칩니다. 항체의 선택으로부터 또 다른 문제가 제기되었는데, 이들 모두가 두꺼운 부분에 적합한 것은 아니다. 우리는 더 작은 분자량을 가진 항체가 두꺼운 절편의 면역 형광 염색에 이상적 일 수 있다고 추측합니다. 따라서, 항체 선택의 어려움은 이러한 접근법의 주요 한계이다. 본 연구는 쥐의 털이 많고 털이없는 피부에서 혈관, 림프관 및 신경의 분포의 차이를 관찰했다. 인간의 경우 피부 구조는 설치류의 피부 구조와 매우 다릅니다. 우리는 조직 제거 기술을 사용하여 다음 단계에서 인간의 피부를 관찰하고 연구하기를 기대합니다.
이전의...

신체에서 가장 큰 기관인 피부는 환경에 대한 핵심 인터페이스 역할을하며 많은 신경 섬유 1,2,3에 의해 조밀하게 신경을 씁니다. 피부 신경과민은 이전에 전체 탑재 피부 및 조직 절편 4,5,6에 대한 염색과 같은 다양한 조직학적 방법으로 널리 연구되었지만, 피부 신경 섬유의 상세한 효과적인 입증은 여전히 과제입니다 7,8. 이를 감안할 때, 본 프로토콜은 두꺼운 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 보다 명확하게 나타낼 수 있는 독특한 기술을 개발하였다.
절편의 두께에 의한 한계 때문에, 신경과민된 피부 신경 섬유의 관찰은 획득된 이미지 정보로부터 칼시토닌 유전자 관련 펩티드(CGRP) 신경 섬유와 국소 조직 및 기관 사이의 관계를 정확하게 묘사하기에 충분히 정확하지 않다. 3D 조직 제거 기술의 출현은 이러한 문제(9,10)를 해결할 수 있는 실현 가능한 방법을 제공한다. 조직 제거 접근법의 빠른 개발은 최근11 시간 동안 조직 구조, 전체 장기, 신경 세포 돌기 및 전체 동물을 연구하기위한 많은 도구를 제공했습니다. 투명한 피부 조직은 공초점 현미경으로 훨씬 더 두꺼운 단면에서 이미징되어 피부 신경 섬유를 시각화하는 데이터를 얻을 수 있습니다.
본 연구에서, 쥐 뒷발의 발바닥 및 등쪽 피부는 털이 많고 윤곽이 있는 피부 3,4,7의 두 가지 표적 부위로서 선택되었다. 피부 신경 섬유를 더 먼 거리에서 추적하기 위해, 피부 조직을 면역조직화학 및 조직화학적 염색을 위해 300 μm의 두께로 슬라이스하고, 이어서 조직 소거 처리를 하였다. CGRP는 감각 신경 섬유12,13을 라벨링하는데 사용되었다. 또한, 조직 배경에 피부 신경 섬유를 강조하기 위해, 팔로이드인 및 림프관 내피 히알루로난 수용체 1(LYVE1)을 혈관과 림프관을 각각14,15로 표지하기 위해 추가로 사용하였다.
이러한 접근법은 피부 신경 섬유의 고해상도 뷰를 입증하고 또한 피부의 신경 섬유, 혈관 및 림프관 간의 공간적 상관 관계를 시각화하기 위해 적용 할 수있는 간단한 방법을 제공했으며, 이는 병리학 적 조건 하에서 정상 피부의 항상성 및 피부 변화를 이해하는 데 훨씬 더 많은 정보를 제공 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>1x 인산염 완충 식염수</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>pH 7.2-7.4, 0.01 Mol</td></tr><tr><td>2,2,2-Tribromoethanol</td><td>Sigma Life Science</td><td>T48402-5G</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 형광 현미경 Olympus</td><td>Corporation</td><td>Fluoview FV1200</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 마우스 IgG H& L 알렉사 - 밀가루 488</td><td>Abcam plc.</td><td>ab150105</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 양 IgG H& L 알렉사 - 밀가루 405</td><td>Abcam plc.</td><td>ab175676</td><td></td></tr><tr><td>EP 튜브</td><td>무석 NEST 생명 공학 Co.</td><td>615001</td><td>1.5 mL</td></tr><tr><td>동결 단계 슬라이딩 마이크로톰 시스템</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1860</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 소프트웨어</td><td>Oxford Instruments</td><td>v.9.0.1</td><td></td></tr><tr><td>IRIS 표준 가위</td><td>WPI (World Precision Instruments Inc.)</td><td></td><td></td>503242</tr><tr><td>iSpacer</td><td>선진연구소</td><td>IS005</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 집게 -Str</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td><td></td></tr><tr><td>마우스 단클론 항 CGRP 항체</td><td>Santa cruz biotechnology, Inc.</td><td>sc-57053</td><td></td></tr><tr><td>중성 완충 포르말린</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>G2161</td><td>10%</td></tr> <tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>017-000-12</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>연동 펌프</td><td>Longer Precision Pump Co., Ltd</td><td>BT300-2J</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin Alexa-Fluor 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A12381</td><td></td></tr><tr><td>RapiClear 1.52 솔루션</td><td>SunJin Lab co.</td><td>RC152001</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>일반 아가로스</td><td>Gene Company Limited</td><td>G-10</td><td></td></tr><tr><td>SEMKEN 1 x 2 치아 조직 집게-Str</td><td>RWD</td><td>F13038-12</td><td></td></tr><tr><td>양 다클론 항 LYVE1 항체</td><td>R& 주식회사 디 시스템즈</td><td>AF7939</td><td></td></tr><tr><td>6웰 플레이트</td><td>Corning Incorporated</td><td>3335</td><td></td></tr><tr><td>아지드화나트륨</td><td>시그마 생명과학</td><td>S2002</td><td>25g</td></tr><tr><td>자당</td><td>시그마 생명과학</td><td>V900116</td><td>500g</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Henkel AG & Co.</td><td>Pattex 502</td><td></td></tr><tr><td>수술용 핸들</td><td>RWD</td><td>S32003-12</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>9002-93-1</td><td>100mL</td></tr><tr><td>우레탄</td><td>시그마 생명 과학</td><td>U2500</td><td>500g</td></tr><tr><td>VANNAS 스프링 가위</td><td>RWD</td><td>S1014-12</td><td></td></tr><tr><td>진동 마이크로톰</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr></tbody></table>

여러 형광 염색 및 조직 제거 접근법을 사용하여 3d 패턴으로 털이 많고 글래브러스 한 피부 신경을 보여줍니다.

Demonstrating Hairy and Glabrous Skin Innervation in a 3D Pattern Using Multiple Fluorescent Staining and Tissue Clearing Approaches

피부 신경은 말초 신경계의 중요한 부분입니다. 피부 신경 섬유에 대한 연구가 빠르게 진행되었지만, 분포 및 화학적 특성에 대한 대부분의 이해는 얇은 조직 절편에 대한 기존의 조직 화학 및 면역 조직 화학 염색에서 비롯됩니다. 조직 제거 기술의 발달로, 더 두꺼운 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 볼 수있게되었습니다. 본 프로토콜은 쥐 뒷발의 발바닥 및 등쪽 피부로부터 300 μm의 두께로 조직 절편에 대한 다중 형광 염색을 기술하며, 두 개의 전형적인 털이 많고 윤곽이 있는 피부 부위이다. 여기서, 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드는 감각신경섬유를 표지하는 반면, 팔로이드인과 림프관내피히알루로난 수용체 1은 혈액과 림프관을 각각 표지한다. 공초점 현미경 하에서, 라벨이 붙은 감각 신경 섬유는 더 먼 거리에서 완전히 추적되었고, 깊은 피부 층의 번들과 피상층의 자유형으로 달렸다. 이 신경 섬유는 혈관과 평행하거나 혈관을 둘러싸고 있었고, 림프관은 털이 많고 윤기가 나는 피부에 3차원(3D) 네트워크를 형성했다. 현재의 프로토콜은 방법론 관점에서 기존의 기존의 방법보다 피부 신경을 연구하는 데보다 효과적인 접근법을 제공합니다.

삼중 형광 염색 후, 신경 섬유, 혈관 및 림프관을 털이 많은 피부와 글래브러스 피부에서 각각 CGRP, phalloidin 및 LYVE1로 명확하게 표지하였다(도 3,4). 클리어링 처리를 통해 CGRP 양성 신경 섬유, 팔로이드 양성 혈관 및 LYVE1 양성 림프관을 더 깊이 이미지화하여 피부의 완전한 구조 정보를 얻을 수 있습니다 (그림 3). 이러한 조직 구조가 3D 패턴으로 더 재구성되었을 때, 그 분포는 추적하기가 더 쉬워졌습니다. CGRP 양성 신경섬유가 피하조직과 진피를 통과하여 표피까지 통과한 것으로 나타났다. 이러한 신경 섬유는 피하 조직에서 다발로 실행되고, 진피 내에서 분지되고, 표피에서 종결되었다(그림 3). 대조적으로, 팔로이드 양성 혈관 및 LYVE1 양성 림프관은 피하 조직 및 진피에 분포한다(<strong cl...

조직 절편의 두께는 피부 신경과민의 형태학적 연구를 제한하였다. 본 프로토콜은 공초점 현미경 검사 하에서 두꺼운 300 μm 조직 절편에서 피부 신경 섬유를 시각화하는 독특한 조직 제거 기술을 기술한다.

여러 형광 염색 및 조직 제거 접근법을 사용하여 3D 패턴으로 털이 많고 글래브러스 한 피부 신경을 보여줍니다.

Skin innervation is an important part of the peripheral nervous system. Although the study of the cutaneous nerve fibers has progressed rapidly, most of ...

우리의 프로토콜은 공초점 현미경을 사용하여 동기화 섹션을 관찰 할 수있는 실현 가능한 방법을 제공하여 신경 섬유의 관찰에서 정밀도를 보장 할 수있었습니다. 간단하고 쉬운 조직 청소 프로토콜은이 기술의 주요 장점입니다. 조직 청소 과정은 효율적이며 약 30 분에서 한 시간이 걸립니다.텍스트 원고에 언급 된 바와 같이 안락사 된 쥐에 관류를 실시하십시오. 메스를 사용하여 뒷발에서 등받이와 발바닥의 피부를 제거하십시오. 냉동 절편을 필요로 하는 샘플의 경우, 조직을 0.1몰 PB의 알데히드로부터 4%로 고정시킨 후 두 시간 동안 고정시킨다.세척 후 피부 조직을 섭씨 37도에서 2 % 아가로스에 넣고 냉각을 위해 아이스 박스 안에 넣으십시오. 장착 된 조직을 얼음물로 진동 마이크로 톤에 고정하고 횡단 방향으로 500 마이크로 미터의 두께로 슬라이스하십시오. 슬라이스 후, 절편으로부터 아가로스를 제거하고 1x PBS로 여섯 웰 플레이트에 보관한다.조직 절편을 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 1x PBS 중의 2%트리톤 X-100의 용액으로 인큐베이션한다. 조직 절편을 블로킹 버퍼에 넣고 섭씨 네 도에서 하룻밤 사이에 쉐이커 위에서 분당 72회 회전으로 회전시킨다. 조직 절편을 마우스 모노클로날 항-CGRP 및 양 폴리클로날 항-LYVE-1 항체의 1차 항체를 포함하는 용액을 마이크로 원심분리 튜브의 희석 완충액 내로 옮긴다.그런 다음 쉐이커에서 섭씨 네 도에서 이틀 동안 회전하십시오. 실온에서 세척 완충액으로 조직 절편을 두 번 세척한 다음, 세척 완충액에서 섭씨 네 도에서 밤새 진탕기에 보관하십시오. 다음날, 조직 절편을 이차 항체를 함유하는 혼합 용액으로 마이크로원심분리 튜브에 옮기고 섭씨 네 도에서 5시간 동안 진탕기 상에서 분당 72회 회전으로 회전시킨다.여섯 웰 플레이트에서 조직 절편을 실온에서 한 시간 동안 세척 완충액으로 두 번 세척하십시오. 조직 절편을 섭씨 네 도에서 하룻밤 동안 쉐이커의 세척 완충액에 보관하십시오. 조직 절편을 조직 제거 시약 내로 옮기고 실온에서 한 시간 동안 쉐이커 상에서 분당 60회 회전으로 부드럽게 회전시킨다.슬라이드에 맑은 조직을 장착한 다음 스페이서로 조직을 동그라미로 만들고 신선한 조직 제거 시약과 커버 슬립으로 틈새를 붙입니다. 3D 패턴은 CGRP 양성 신경 섬유가 피하 조직 및 진피를 통해 표피까지 통과한다는 것을 입증했습니다. 이들 신경 섬유는 진피 내에서 분지된 피하 조직에서 다발로 달렸고 표피에서 종결되었다.대조적으로, 양성 혈관 및 LYVE-1 양성 림프관의 phalloidin은 피하 조직 및 진피에 분포한다. 일반적으로 CGRP 양성 신경 섬유는 혈관과 림프관과 평행하거나 둘러쌌으며 털이 많고 윤기가 나는 피부에서 3D 네트워크를 형성한다. 종래의 접근법으로, 신경 섬유 혈관과 림프관이 얇은 단면에서 CGRP phalloidin 및 LYVE-1로 명확하게 표지되었지만, 이러한 구조의 관찰은 슬라이스 두께에 의해 제한되었고 완전히 관찰 될 수 없었다.두께가 30 마이크로미터인 구간에서, CGRP 양성 신경 섬유의 표면적에서 털이 많은 피부와 글라브루스 피부 사이에는 차이가 없었다. 300 마이크로미터 두께의 조직 절편에서, 털이 많은 피부와 비교하여, 글래브러스 피부의 CGRP 양성 신경 섬유의 표면적이 상당히 증가하였다. 항체 인큐베이션 후 높은 삼투압으로 세척 완충액을 사용하는 것이 중요합니다.여러 번, 면역 형광 염색에 필요한 세척 시간이 필요하다. 이 절차에 따라, 우리는 여섯 섹션에서 다른 조직과 장기의 염색 및 관찰의 가능성이 또한 존재한다고 생각합니다. 이 기술은 신경 과학 연구자들이 표면적과 신경 섬유의 상태를 만나는 데 도움이 될 수 있습니다.또한 조직과 기관의 혁신을 관찰하는 데 도움이됩니다.

demonstrating-hairy-glabrous-skin-innervation-3d-pattern-using

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 전체 마운트 immunohistochemistry를 소개하고 레이저 마우스 배아 사지 피부에 복잡한 혈관 네트워크 형성을 분석하는 데 여러 상표와 공촛점 현미경을 검사합니다.

배아 림브 스킨 Vasculature에 대한 전체 마운트 Immunohistochemical 분석 : 엠브료에 혈관 분기 Morphogenesis를 공부하는 모델 시스템

말초 감각 신경 섬유 subtypes의 Immunocytochemical 식별 (과 그 안의 단백질의 표현 감지)는 주변 센세이션을 기본 분자 메커니즘을 이해하는 데 열쇠입니다. 여기 주변 감각 신경 섬유의 특정 immunostaining 위해 이러한 피부 및 사지 ​​뼈와 같은 주변 기기 / 내장 조직 샘플,의 준비를위한 방법을 설명합니다.

피부와 사지 본즈 Innervating 마우스 감각 신경 섬유의 조직 준비 및 Immunostaining

이러한 신경 근육 접합 (NMJs)에서 터미널 Schwann 세포 (SCS)과 같은 밀도가 높은 포장 조직에 개별 셀을 표시하는 것은 도전입니다. "선형 사진 표백"표백 순서는 시간 경과 영상과 결합 할 수있는 triangularis sterni의 근육 explant, 편리하게 신경 근육 준비에 예를 들어, 단일 터미널 SCS를 delineating 수...

연속 신경 근육 분기점에서 싱글 Schwann 세포를 윤곽을 그리다하는 사진 표백

고통스러운 신경 병증 (PN)의 통각 intraepidermal 신경 섬유 (IENFs)의 변화를 연구하기 위해, 우리는 직접 통각 IENFs에서 관찰 입체 형태 변화를 검사 할 수 프로토콜을 개발했다. IENFs의 3 차원 분석은 PN에 IENF의 형태 학적 변화를 평가하는 잠재력을 가지고있다.

인간의 피부 생검에서 통각 Intraepidermal 신경 섬유의 3 차원 영상

이러한 모낭과 신경 엔딩으로 - - 공간 조직의 독특한 패턴을 전시 포유류의 피부 구조의 다양한 배열을 포함합니다. 플랫 마운트로 피부를 분석하는 것은 피부 구조의 전체 두께의 고해상도 이미지를 생성하기 위해이 조직의 2 차원 적 형상을 이용한다.

마우스의 피부와 모낭 패터닝 및 감각 축삭 형태학의 분석에의 응용의 평면 마운트 이미징

이 프로토콜을 시각화 하 고 신경 특정 미토 콘 드리 아를 계량 3 차원 (3D) 영상 및 분석 기법을 사용 합니다. 기술 한 형광 신호를 다른 형광 신호에서 데이터의 하위 집합을 분리 하는 데 사용은 다른 상황에 적용 됩니다.

3 차원 영상 및 인간 Intraepidermal 신경 섬유 내 미토 콘 드리 아의 분석

여기에서는 스티릴 피리디늄 염료로 염색 및 탈색하는 동안 마우스, 귀 피부, 모낭을 신경 분포시키는 말뚝 말단의 살아있는 피침형 감각 말단을 이미징하기 위한 새로운 준비에 대해 설명합니다.

의 헤어 난포 피침 엔딩에서 생활 신경 터미널 라벨의 광학 모니터링<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 마우스 귀 피부

이 보고서는 전체 두께가 마우스 피부 생검을 명확하게하고, 3 차원의 단세포 해상도 단백질 발현 패턴 증식 세포 및 sebocytes 시각화 입방 프로토콜을 설명한다. 이 방법은 피부 해부학과 병리학의 정확한 평가를 가능하게하고, 유전자 변형 마우스 라인에서 비정상적인 표피 표현형의.

CUBIC 프로토콜 전체 마운트 피부 준비 단일 셀 해상도에서 단백질 발현을 시각화합니다

이 작품은 공 촛점 이미징 양식의 완전한 착취를 가능하게 두께, 3 차원 조직 단면 분석을위한 새로운 처리 및 이미징 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 항원 성을 보존하고 피부 조직 및 잠재적으로 다른 조직 유형을 분석하는 강력한 시스템을 나타냅니다.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

여기에서는 세포 배양 실험실에서 일상적인 연구를 위해 다양한 3D 피부 모델을 소개하는 저렴하고 간단한 절차를 제시합니다. 연구원은 상업적으로 이용 가능한 모델에 의존하지 않고 필요에 맞는 모델을 만들 수 있습니다.

2차원(2D) 단일 배양에서 3차원(3D) 다중 배양에 이르기까지 다양한 응용 분야를 위한 피부 모델 구축

본 연구는 생 체 내 2광자 영상 접근법을 통해 쥐의 앞발 피부에서 저역계 기계수용체(LTMR) 축삭 말단 구조를 시각화하는 방법을 제시합니다. 개별 축삭의 반복적이고 고해상도 영상을 사용하여 이 방법은 발달 과정과 성인에서 피부 감각 회로의 구조와 기능을 연구할 새로운 플랫폼을 제공합니다.

마우스 피부의 촉각 감각 축삭 형태의 생명체 내 2광자 영상

학습하세요 콘포컬 현미경을 이용한 조직 투명화 기법으로 두꺼운 피부 절편에서 CGRP 양성 신경 섬유의 3D 네트워크를 관찰하는 방법을. 이 기술은 신경과학 연구자들이 피부 신경 분포를 정밀하게 분석하는 데 도움을 줍니다.

여러 형광 염색 및 조직 제거 접근법을 사용하여 3D 패턴으로 털이 많고 글래브러스 한 피부 신경을 보여줍니다.

더 많은 동영상 탐색