인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩

동종 사구체 칩은 환자 특이적 질병 모델링 및 신독성 테스트 및 고급 정밀 의학 응용 프로그램을 가능하게 합니다. 사구체 상피와 내피는 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 IPSC의 단일 집단에서 파생됩니다. IPSC는 무제한자가 재생을 가지고 있으며 거의 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있습니다.

이 기술은 병리학 적 세포 표현형 및 질병을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 환자 별 장기 칩은 약물 스크리닝 및 기계 연구를위한 플랫폼 역할도 할 수 있습니다. 이 모델은 특정 환자에게 개인화 된 바디 온 칩 시스템의 개발에 적용될 수 있습니다.

이 시스템은 임상 테스트 전에 환자 별 반응을 예측할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 25 마이크로 리터의 기저막 매트릭스 2 용액을 비뇨기 채널에 부드럽게 추가하고 20 마이크로 리터를 칩의 모세관 채널에 추가하여 시작하십시오. 두 개의 멸균 15 밀리리터 원추형 튜브 캡을 가져 와서 500 마이크로 리터의 멸균 증류수로 채 웁니다.

건조를 방지하기 위해 페트리 접시에 뚜껑을 놓고 접시에 뚜껑을 놓습니다. 섭씨 37도에서 밤새 배양하십시오. 진행하여, 혈관 내피 세포의 15일간 배양물을 함유하는 T75 플라스크로부터 배지를 90% confluency로 흡인한다.

5 밀리리터의 세포 분리 완충액을 추가하고 섭씨 37도에서 5-7 분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 5 밀리리터의 DMEM / F-12를 추가합니다. 200배 G에서 5분 동안 원심분리합니다.

상청액을 제거하고 세포를 300 마이크로리터의 내피 유지 배지에 재현탁시킨다. 혈구계로 세포를 세어 약 2 백만 개의 세포를 얻습니다. P200 배리어 팁을 사용하여 미세유체 칩의 상단 및 하단 채널을 200마이크로리터의 DMEM/F-12로 플러시하는 동시에 콘센트 주변에서 흡인합니다.

흡인기에 부착된 P200 배리어 팁을 하단 채널의 출구에서 멀리 떨어뜨려 칩을 단단히 잡습니다. 20 마이크로 리터의 혈관 내피 세포 현탁액을 칩의 모세 혈관 채널에 단단히 주입하고 출구 주변에서 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 현미경으로 기포 또는 고르지 않은 파종 밀도를 확인하십시오.

세포가 유연한 PDMS 멤브레인의 기저부에 부착 될 수 있도록 칩을 부드럽게 뒤집습니다. 칩을 홀더 카트리지에 넣고 멤브레인이 마르지 않도록 카트리지에 PBS 3ml를 추가합니다. 칩을 섭씨 37도에서 3 시간 동안 배양하십시오.

현미경으로 하단 채널을 확인하여 유연한 PDMS 멤브레인에 부착된 세포의 합류 층이 있는지 확인합니다. 모세관 채널 출구의 주변으로부터 흡인하면서 바닥 채널의 입구에 200 마이크로리터의 내피 유지 배지를 첨가하여 부착되지 않은 세포를 세척한다. 칩을 홀더 카트리지에 다시 넣고 섭씨 37도에서 밤새 배양합니다.

다음날, 모세관 채널을 200 마이크로 리터의 내피 유지 배지로 부드럽게 씻어냅니다. 200 마이크로 리터의 DMEM / F-12로 비뇨기 채널을 플러시하고 입구 및 출구 포트에 50 마이크로 리터의 DMEM / F-12를 떨어 뜨립니다. 중간 중배엽 세포를 진행하고, 12 웰 플레이트의 각 웰에서 중간 중배엽 유도 배지를 1 밀리리터의 트립신 EDTA로 교체하고 섭씨 37도에서 5 분 동안 배양한다.

세포 리프터를 사용하여 세포를 부드럽게 긁어내고 피펫팅을 사용하여 세포를 해리합니다. 각 웰에 2 밀리리터의 트립신 중화 용액을 넣고 세포를 50 밀리리터의 원추형 튜브로 옮깁니다. DMEM/F-12로 세포 현탁액의 부피를 50ml로 구성하고 200배 G에서 5분 동안 원심분리합니다.

상청액을 흡인하고 세포를 500 마이크로리터의 중간 중배엽 유도 배지에 재현탁시켜 약 300만 개의 세포를 얻습니다. 혈구계로 세포를 세십시오. 칩을 잡고 25마이크로리터의 세포 현탁액을 칩의 비뇨기 채널에 단단히 주입하면서 출구 주변에서 배지를 조심스럽게 흡인합니다.

거품이나 고르지 않은 세포 파종 밀도를 확인하십시오. 3 밀리리터의 PBS를 칩 홀더 카트리지에 넣고 섭씨 37도에서 3 시간 동안 배양합니다. 배양 후, 두 채널을 200 마이크로리터의 각각의 세포 배양 배지로 플러시한다.

빈 P200 장벽 팁을 비뇨기 및 모세관 채널의 양쪽 출구에 부착합니다. 200 마이크로리터의 내피 유지 배지를 피펫팅하고 그 중 절반을 모세관 채널 입구에 주입한다. 채널의 입구와 출구가 매체로 채워진 피펫 팁에 부착되도록 입구 내부의 피펫 팁을 해제합니다.

200 마이크로 리터의 중간 중배엽 유지 배지가있는 비뇨기 채널 입구에 대해이 절차를 반복하십시오. 칩을 섭씨 37도에 내장된 팁으로 밤새 배양합니다. 칩을 장기 칩 바이오리액터에 연결하려면 먼저 채널에서 P200 팁을 제거합니다.

건조를 방지하기 위해 비뇨기 및 모세관 채널의 입구와 출구에 각 매체의 물방울을 추가합니다. 3 밀리리터의 따뜻한 족세포 유도 배지를 소변 입구 저장소에 추가하고 3 밀리리터의 따뜻한 내피 유지 배지를 모세 혈관 입구 저장소에 추가합니다. 300마이크로리터의 각 매체를 출구 포트 바로 위의 출구 저장소에 추가합니다.

포드를 트레이와 장기 칩 생물 반응기에 밀어 넣습니다. 회전 다이얼을 사용하여 2분 동안 프라임 사이클을 선택하고 시작합니다. 포드 밑면에 4개의 유체 포트 모두에서 작은 물방울이 있는지 육안으로 검사합니다.

포드 밑면과 미세유체 칩 포트 사이의 유체 대 유체 접촉을 달성하려면 칩 캐리어를 포드 안으로 부드럽게 밀어 넣습니다. 칩 캐리어 탭을 안팎으로 부드럽게 누릅니다. 칩 표면에서 과도한 매체를 흡입합니다.

장기 칩 바이오리액터 유량을 시간당 60마이크로리터로 설정합니다. 순환 변형률을 0.4Hz에서 10%로 설정합니다. 장기 칩 바이오리액터의 회전 다이얼을 사용하여 조절 주기를 선택하고 2시간 동안 실행합니다.

출구 저장소에서 매체 수준의 증가를 육안으로 검사하십시오. 장기 칩 바이오리액터의 회전 다이얼을 사용하여 조절 주기를 선택합니다. 배양 17일 후, 매일 비뇨기 채널 출구 저장소에서 포트에서 대각선으로 떨어진 배지를 흡입하되 일부 배지는 저장소에 보관합니다.

비뇨기 채널 입구 저장소에 5 일 동안 2 일마다 최대 3 밀리리터의 족 세포 유도 배지를 보충하십시오. 5 일 후, 비뇨기 채널에서 배지를 흡입하되 일부 배지는 저장소에 보관하십시오. 비뇨기 채널 입구 저장소에 매일 3 밀리리터의 족세포 유지 배지를 보충하십시오.

유사하게, 모세관 채널 출구에서 배지를 흡입하고 내피 유지 배지로 입구 저장소를 매일 보충합니다. 이 프로토콜을 사용하여 인간 유도 만능 줄기 세포를 사용하여 혈관 내피 세포 및 족세포를 증식시킴으로써 사구체의 기능적 시험관 내 모델을 개발하기 위해 사용하였다. 족세포 유도 및 혈관 내피 증식 후 21일째에 칩 내 세포는 족세포에 대한 포도신 및 네프린, 혈관 내피 세포에 대한 VE Cadherin 및 PECAM-1과 같은 계통 식별 마커를 발현했습니다.

족 세포와 혈관 내피 세포층 모두 신장 사구체에서 가장 풍부한 GBM 단백질 인 콜라겐 IV를 발현했습니다. 사구체 칩은 모세관에서 비뇨기 채널로 이눌린과 같은 작은 분자를 선택적으로 여과하는 동시에 알부민과 같은 큰 단백질이 모세관 채널을 떠나는 것을 방지하여 선택적 분자 여과 기능을 보여줍니다. 4-7 일에 내피 유도 동안 세포 수가 증가하면 세포의 2 차 층이 생길 수 있지만 과도하게 파종하면 응집이 발생하여 분화를 방해 할 수 있습니다.

PDMS 칩 구성 요소의 부적절한 결합, 유체 유로의 막힘 또는 손상된 여과 장벽의 경우 비뇨기 및 모세관 채널 사이의 예기치 않은 유체 교차 흐름이 관찰될 수 있습니다. 내피와 상피를 파종하고 15 일부터 칩을 유지할 때 모든 단계에서 채널의 기포를 육안으로 검사하는 것이 중요합니다. 동종 사구체 칩에서, 임상적으로 관련된 약물 후보를 투여하여 이들의 치료 잠재력 또는 독성 수준을 시험할 수 있다.

이 기술은 이제 인간 신장 질환의 유전 적 기초를 이해하고 개인화 된 치료법을 개발할 수있는 기회를 열어줍니다.