Name: 인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T13:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 배우세요 인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩 기술을 활용하여 환자 특이적 질병 모델링과 신독성 검사를 수행하는 방법을 익히세요. 이 혁신적인 오가노이드 칩 시스템은 정밀 의학 발전에 기여합니다.

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이 연구는 듀크 대학의 프랫 공과 대학, 듀크 의과 대학의 신장학과, 생물 의학 연구의 화이트 헤드 장학금 및 S. Musah의 Genentech 연구 상이 지원했습니다. Y. Roye는 듀크 대학교 의생명공학과에서 듀크 대학교-알프레드 P. 슬론 재단 장학금과 윌리엄 M. "몬티" 라이커트 대학원 펠로우십을 받고 있습니다. DU11 (Duke University 클론 #11) iPS 세포주는 Duke iPSC Core Facility에서 생성되었으며 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 저자는 기술 지원과 유용한 토론에 대해 N. Abutaleb, J. Holmes, R. Bhattacharya 및 Y. Zhou에게 감사드립니다. 저자는 또한 원고에 대한 유용한 의견을 주신 Musah Lab 회원들에게 감사드립니다. 저자는 Acuri C6 유세포분석기를 선물한 Segura Lab에 감사를 표합니다.

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<li>Da Sacco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+source+of+cultured+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A novel source of cultured podocytes.</a> PloS One. 8 (12), 81812(2013).</li>
<li>Singh, V. K., Kalsan, M., Kumar, N., Saini, A., Chandra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cells%3A+applications+in+regenerative+medicine%2C+disease+modeling%2C+and+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cells: applications in regenerative medicine, disease modeling, and drug discovery.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 3, 2(2015).</li>
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<li>Musah, S., Dimitrakakis, N., Camacho, D. M., Church, G. M., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+mature+kidney+podocytes+and+establishment+of+a+Glomerulus+Chip%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human induced pluripotent stem cells into mature kidney podocytes and establishment of a Glomerulus Chip.</a> Nature Protocols. 13 (7), 1662-1685 (2018).</li>
<li>Burt, M., Bhattachaya, R., Okafor, A. E., Musah, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guided+differentiation+of+mature+kidney+podocytes+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+under+chemically+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Guided differentiation of mature kidney podocytes from human induced pluripotent stem cells under chemically defined conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (161), e61299(2020).</li>
<li>Roye, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+glomerulus+chip+engineered+from+stem+cell-derived+epithelium+and+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">A personalized glomerulus chip engineered from stem cell-derived epithelium and vascular endothelium.</a> Micromachines. 12 (8), 967(2021).</li>
<li>Roselli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Podocin+localizes+in+the+kidney+to+the+slit+diaphragm+area%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Podocin localizes in the kidney to the slit diaphragm area.</a> The American Journal of Pathology. 160 (1), 131-139 (2002).</li>
<li>Ruotsalainen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephrin+is+specifically+located+at+the+slit+diaphragm+of+glomerular+podocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Nephrin is specifically located at the slit diaphragm of glomerular podocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (14), 7962-7967 (1999).</li>
<li>Privratsky, J. R., Newman, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PECAM-1%3A+regulator+of+endothelial+junctional+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">PECAM-1: regulator of endothelial junctional integrity.</a> Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).</li>
<li>Menon, M. C., Chuang, P. Y., He, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glomerular+filtration+barrier%3A+components+and+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Nephrology%22%5BJournal%5D)">The glomerular filtration barrier: components and crosstalk.</a> International Journal of Nephrology. 2012, 749010(2012).</li>
<li>Abutaleb, N. O., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+and+characterization+of+human+iPSC-derived+vascular+endothelial+cells+under+physiological+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Differentiation and characterization of human iPSC-derived vascular endothelial cells under physiological shear stress.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100394(2021).</li>
<li>Pammolli, F., Magazzini, L., Riccaboni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+productivity+crisis+in+pharmaceutical+R%26D%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">The productivity crisis in pharmaceutical R&D.</a> Nature Reviews. Drug Discovery. 10 (6), 428-438 (2011).</li>
<li>Atchison, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-derived+endothelial+cells+affect+vascular+function+in+a+tissue-engineered+blood+vessel+model+of+Hutchinson-Gilford+progeria+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">iPSC-derived endothelial cells affect vascular function in a tissue-engineered blood vessel model of Hutchinson-Gilford progeria syndrome.</a> Stem Cell Reports. 14 (2), 325-337 (2020).</li>
</ol>

S.M.은 인간 iPS 세포로부터의 족세포 분화와 관련된 특허의 발명가이다. 다른 저자는 공개 할 것이 없습니다.

이 보고서에서는 동종 인간 iPS 세포주에서 혈관 내피 및 사구체 상피(족세포)를 유도하는 프로토콜과 이러한 세포를 사용하여 신장 사구체의 구조, 조직-조직 인터페이스 및 분자 여과 기능을 모방하는 3D 장기 온 칩 시스템을 설계하는 방법을 간략하게 설명합니다. 이 사구체 칩에는 내피와 사구체 상피가 장착되어 있어 함께 분자를 선택적으로 필터링하는 장벽을 제공합니다. 
이 프로토콜을 적용하는 데 관심이있는 연구원은 다음과 같은 사항을 고려해야합니다 : 첫째, 사용되는 줄기 세포주의 고유 한 성장 특성에 따라 세포 파종에 최적화가 필요할 수 있습니다. 세포 파종 밀도는 인간 iPS 세포 증식 속도의 본질적인 차이로 인해 달라질 수 있습니다. 연구자들은 프로토콜에서 제안한 중배엽 파종 밀도로 시작한 다음 필요한 경우 조정하는 것이 좋습니다. 유사하게, 측면 중배엽 분화는 viEC 수율 및 50% 이상의 분류 효율을 달성하기 위해 필요에 따라 조정하기 전에 제안된 세포 파종 밀도로 시...

Organ-on-a-chip 장치는 분자 및 기계적 자극과 혈관 형성을 사용하여 특정 장기의 구조와 기능을 모델링하는 조직-조직 인터페이스를 형성하는 동적 3D in vitro 모델입니다. 신장의 사구체 (사구체 칩)를 재현하는 것을 목표로하는 이전에 확립 된 organ-on-a-chip 장치는 동물 세포주 1 또는 이종 소스 2,3의 인간1 차 및 불멸화 된 세포주로 구성되었습니다. 유 전적으로 이질적인 세포 공급원의 사용은 환자 특이 적 반응 및 유전학 또는 질병 메커니즘에 대한 연구를 크게 제한하는 변이를 나타냅니다 4,5. 이 문제를 해결하는 것은 시험관 내 모델 2,3,6 엔지니어링을 위한 보다 정확한 미세 환경을 제공하기 위해 보존된 분자 및 유전적 프로필을 가진 특정 개체에서 유래하는 등종 세포주의 가용성에 달려 있습니다. 인간 기원의 이소겐 세포주는 이제 인간 iPS 세포 배양의 발전으로 인해 쉽게 생성될 수 있습니다. 인간 iPS 세포는 전형적으로 비침습적으로 공급되고, 무기한으로 자가 갱신될 수 있고, 거의 모든 세포 유형으로 분화하기 때문에, 이들은 사구체 칩 7,8과 같은 시험관내 모델의 확립을 위한 매력적인 세포 공급원 역할을 한다. 사구체 여과 장벽은 혈액 여과의 주요 부위입니다. 혈액은 먼저 사구체 기저막인 혈관 내피를 통해 여과되고 마지막으로 족세포라는 특수 상피를 통해 여과됩니다. 여과 장벽의 세 가지 구성 요소 모두 분자의 선택적 여과에 기여합니다. 여기에 제시된 것은 단일 인간 iPS 세포 공급원으로부터 혈관 내피 및 사구체 상피와 인터페이스되는 장기 온 칩 장치를 확립하는 프로토콜입니다. 이 프로토콜은 사구체 여과 장벽을 재현하기 위해 등종 및 혈관 화 칩을 설계하는 데 특히 유용하지만, 동종 성 '바디 온 칩'시스템과 같은 다른 유형의 개인화 된 장기 온 칩 및 다중 기관 플랫폼을 개발하기위한 청사진도 제공합니다.
본원에 기재된 프로토콜은 인간 iPS 세포를 2개의 별개의 혈통 - 측면 중배엽 및 중배엽 세포로 발산하는 것으로 시작하고, 이들은 연속적으로 각각 혈관 내피 및 사구체 상피로 분화된다. 측면 중배엽 세포를 생성하기 위해, 인간 iPS 세포를 기저막 매트릭스 1-코팅된 플레이트에 시딩하고, Wnt 활성제, CHIR 99021 및 강력한 중배엽 유도제인 뼈-형태형성 4(BMP4)가 보충된 N2B27 배지에서 3일(배지 교환 없이) 배양하였다. 생성된 측면 중배엽 세포는 이전에 근접(T), 혼합 쌍형 호메오박스(MIXL) 및 에오메소더민(EOMES)의 발현을 특징으로 했습니다.9. 이어서, 측면 중배엽 세포를 VEGF165 및 포스콜린이 보충된 배지에서 4일 동안 배양하여 자기 활성화 세포 분류(MACS)를 사용하여 VE-카데린 및/또는 PECAM-1 발현에 기초하여 분류된 혈관 내피 세포를 유도하였다. 생성된 혈관 내피 세포 (viEC)를 미세유체 장치에서 파종할 준비가 될 때까지 기저막 매트릭스 3-코팅된 플라스크 상에서 배양함으로써 확장시켰다.
중배엽 세포를 생성하기 위해, 인간 iPS 세포를 기저막 매트릭스 2-코팅된 플레이트에 시딩하고, 액티빈 A 및 CHIR99021을 함유하는 배지에서 2일 동안 배양하였다. 생성된 중배엽 세포는 이전에 기술된 바와 같이 HAND1, 구스코이드 및 상완골(T)의 발현을 특징으로 하였다 2,10,11. 중간 중배엽 (IM) 세포 분화를 유도하기 위해, 중배엽 세포를 BMP-7 및 CHIR99021이 보충된 배지에서 14일 동안 배양하였다. 생성된 IM 세포는 Wilm 종양 1 (WT1), 쌍을 이루는 상자 유전자 2 (PAX2) 및 홀수 건너뛴 관련 단백질 1 (OSR-1)2,10,11을 발현합니다.
2채널 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 미세유체 칩은 시험관 내에서 사구체 여과 장벽의 구조를 요약하도록 설계되었습니다. 비뇨기 채널은 1,000 μm x 1,000 μm (w x h)이고 모세관 채널 치수는 1,000 μm x 200 μm (w x h)입니다. 주기적 스트레칭 및 이완 주기는 유체 채널의 각 측면에 존재하는 중공 챔버에 의해 촉진되었습니다. 세포를 비뇨기 및 모세관 채널을 분리하는 유연한 PDMS 막(두께 50μm)에 시딩했습니다. 멤브레인에는 육각형 기공(직경 7μm, 간격 40μm)이 있어 세포 간 신호 전달을 촉진하는 데 도움이 됩니다(그림 1A)2,12. IM 유도가 완료되기 이틀 전에, 마이크로유체 칩을 기저막 매트릭스 2로 코팅하였다. viEC는 IM 유도가 완료되기 1일 전에 내피 유지 배지를 사용하여 미세유체 칩의 모세관 채널에 시딩하고, ECM 코팅된 PDMS 멤브레인의 기저부에서 세포 접착을 가능하게 하기 위해 칩을 거꾸로 뒤집었습니다. IM 유도가 완료된 날에, 세포를 BMP7, 액티빈 A, CHIR99021, VEGF165, 및 모든 트랜스레티노산이 보충된 배지를 사용하여 마이크로유체 칩의 비뇨기 채널 내로 시딩하여 칩 내 족세포 분화를 유도하였다. 다음날, 배지 저장소를 Podocyte 유도 배지 및 내피 유지 배지로 채우고 0.4Hz에서 10 % 기계적 변형 및 유체 흐름 (60μL / h)을 칩에 적용했습니다.
세포화된 미세유체 칩을 Podocyte 유도 배지(비뇨기 채널 내) 및 내피 유지 배지(혈관 채널 내)를 사용하여 추가로 5일 동안 배양하였다. 생성된 신장 사구체 칩을 족세포 및 내피 세포 모두에 대한 유지 배지에서 최대 7일 동안 추가로 배양하였다. 분화된 족세포는 포도신 및 네프린 13,14를 포함한 계통 특이적 단백질을 양성으로 발현한 반면, viEC는 혈통 식별 단백질 PECAM-1 및 VE-Cadherin을 양성으로 발현했으며, 이들 모두는 사구체 여과 장벽 15,16의 무결성을 유지하는 데 필수적인 분자입니다. . 족세포와 viEC는 모두 조직 성숙과 기능에도 중요한 가장 풍부한 사구체 기저막 단백질인 콜라겐 IV를 분비하는 것으로 밝혀졌습니다.
사구체 칩의 여과 장벽 (내피, 기저막 및 상피)의 3 성분 시스템은 분자를 선택적으로 필터링하고 화학 요법, 신 독성 약물 치료에 반응하는 것으로 밝혀졌습니다. 약물 치료 결과는 사구체 칩이 신 독성 연구 및 질병 모델링에 사용될 수 있음을 나타냅니다. 이 프로토콜은 등종 iPS 세포 유도체로부터 기능성 미세유체 신장 사구체 칩을 엔지니어링하기 위한 일반적인 지침을 제공합니다. 엔지니어링 칩의 다운스트림 분석은 연구원이 원하는 대로 수행할 수 있습니다. 사구체 칩을 사용하여 약물로 인한 사구체 손상을 모델링하는 방법에 대한 자세한 내용은 이전 간행물 2,12를 참조하십시오.

<table><tbody><tr><td>Antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488- 및 Alexa Fluor 594 접합 2차 항체</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>A32744; A32754입니다. A-11076; A32790입니다. A21203입니다. A11015</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 IV</td><td>열/생활 기술</td><td>14-9871-82</td><td></td></tr><tr><td>네프린</td><td>프로젠</td><td>GP-N2</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1</td><td>R& D Systems</td><td>AF806</td><td></td></tr><tr><td>Podocin</td><td>Abcam</td><td>ab50339</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-9989</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane matrices</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Fibronectin, Human</td><td>Corning</td><td>356008</td><td>Basement membrane (3)</td></tr><tr><td>iMatrix-511 Laminin-E8 (LM-E8) fragment</td><td>Iwai North America</td><td>N8922012</td><td>기저막 매트릭스 (2)</td></tr><tr><td>Matrigel hESC 인증 매트릭스, 5-mL 바이알</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>기저막 매트릭스 (1); 로트별 변동</td></tr><tr><td>Cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DU11 human iPS cells</td><td></td><td></td><td>DU11 (Duke University clone #11) iPS 세포주는 Duke iPSC Core Facility에서 생성되었으며 Duke University의 Bursac Lab에서 제공했습니다. 이 라인은 테스트를 거쳐 마이코플라스마(2021년 11월 마지막 테스트) 및 핵형 이상(2019년 7월)이 없는 것으로 확인</td></tr>되었습니다<tr><td>Culture 배지 성장 인자 및 배지 보충제</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from bovine serum, Texas Red conjugate</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>A23017</td><td></td></tr><tr><td>All-trans retinoic acid (500 mg)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72262</td><td></td></tr><tr><td>B27 무혈청 보충제</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제(50x) 비타민 A 없음</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004</td>는 <td>로트별 변동을 보일 수 있음</td></tr><tr><td>CultureBoost-R</td><td>세포 시스템</td><td>4Z0-500-R</td><td>포도세포 유지 관리 매체</td>가 포함된 완전한 배지 키트</tr><tr><td>DMEM/F12 Thermo</td><td>/Life Technologies</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제가 포함된 DMEM/F12</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>10565042</td><td>DMEM/F12와 글루타민</td></tr><tr><td>포스콜린(아데닐릴 시클라아제 활성제)</td><td>Abcam</td><td>ab120058</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX 보충제</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>35050061</td><td>글루타민 보충제</td></tr><tr><td>열 비활성화 FBS</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>헤파린 용액</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7980</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>PHC9544</td><td></td></tr><tr><td>인간 BMP4</td><td>Preprotech</td><td>120-05ET</td><td></td></tr><tr><td>인간 BMP7</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>PHC9544</td><td></td></tr><tr><td>Human VEGF</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>PHC9394</td><td></td></tr><tr><td>Inulin-FITC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3272</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 매체</td><td>줄기 세포 기술</td><td>05850</td><td>인간 iPS 세포 배양 배지(CCM). 제조업체에 따라 5x 보충제를 추가하십시오. Human iPS CCM은 -20°C에서 최대 6개월 동안 보관할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal media</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>21103049</td><td>Lateral mesoderm basal media</td></tr><tr><td>PBS (Phosphate-buffered saline)</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin, liquid (100x)</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>ROCK 억제제 (Y27632)</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>StemPro-34 SFM</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>10639011</td><td>내피 세포 배양 배지(CCM). 제조업체에 따라 보충제를 추가하십시오. 내피 CCM은 4°C; C 또는 -20 &deg; C는 최대 6개월 동안 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>TGF-베타 억제제 (SB431542)</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72234</td><td></td></tr><tr><td>Enzymes and other reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Cell detachment buffer</td></tr><tr><td>Dimethyl Suloxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol solution, 70% (vol/vol), biotechnology grade</td><td>VWR</td><td>97065-058</td><td></td></tr><tr><td>파라포름알데히드(PFA)</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>28906</td><td></td></tr><tr><td>멸균 증류수</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>15230162</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>VWR</td><td>97062-208</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA, 0.05%</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>(Orb) 허브 모듈</td><td>에뮬레이트</td><td>ORB-HM1</td><td></td></tr><tr><td>100mm x 15mm 원형 페트리 접시</td><td>Fisherbrand</td><td>FB087579B</td><td></td></tr><tr><td>120 x 120mm 정사각형 세포 배양 접시</td><td>VWR</td><td>688161</td><td></td></tr><tr><td>Accuri C6</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>흡입 피펫, 개별 포장</td><td>Corning</td><td>29442-462</td><td></td></tr><tr><td>흡입 장치</td><td>SP Bel-Art</td><td>F19917-0150</td><td></td></tr><tr><td>Avanti J-15R 원심분리기</td><td>Beckman Coulter</td><td>B99516</td><td></td></tr><tr><td>원추형 원심분리기 튜브, 15mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>원추형 원심분리기 튜브, 50mL</td><td>Corning</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>AMF7000</td><td>형광 현미경을 사용하여 고정 및 염색된 이미지 촬영 셀.</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>VWR</td><td>100503-092</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i CO2 인큐베이터</td><td>Thermo/Life Technologies</td><td>51030403</td><td></td></tr><tr><td>AxioCam 503 카메라 장착 Inverted Zeiss Axio Observer</td><td>Carl Zeiss Micrscopy</td><td>491916-0001-000(microscope) ; 426558-0000-000(camera)</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark 니트릴 장갑</td><td>VWR</td><td>40101-346</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes, large</td><td>VWR</td><td>21905-049</td><td></td></tr><tr><td>Leoca SP8 직립 컨포칼 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>미디어 저장소 (POD 휴대용 모듈)</td> <td>에뮬레이트</td><td>POD-1</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 플레이트 셰이커</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>장기 칩</td><td>에뮬레이트</td><td>S-1 칩</td><td></td></tr><tr><td>장기 칩 홀더</td><td>에뮬레이트</td><td>AK-CCR</td><td></td></tr><tr><td>P10 정밀 배리어 피펫 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P1096-FR</td><td></td></tr><tr><td>P100 배리어 피펫 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P1125</td><td></td></tr><tr><td>P1000 배리어 피펫 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P1121</td><td></td></tr><tr><td>P20 배리어 피펫 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>P200 배리어 피펫 팁</td><td>Denville Scientific</td><td>P1122</td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 Asher</td><td>Quorum tech</td><td>K1050X RF</td><td>이 플라즈마 에칭기/Asher/클리너는 Duke University의 Shared Materials Instrumentation Facility(SMiF)의 일부로 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>세포 여과기 스냅 캡이 있는 둥근 바닥 폴리스티렌 시험관</td><td>Corning</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 10mL, 개별 포장</td><td>Corning</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 25mL, 개별 포장</td><td>Corning</td><td>356525</td><td></td></tr><tr><td>혈청학 피펫, 5mL, 개별 포장</td><td>Corning</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip, 0.22 &micro; m, PES</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>멸균 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Thomas Scientific</td><td>1138W14</td><td></td></tr><tr><td>T75cm2 벤트 캡이 있는 세포 배양 플라스크</td><td>Corning</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 처리된 12웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 처리된 6웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>진공 변조기 및 침투 펌프 (Zoe Culture Module)</td><td>에뮬레이트</td><td>ZOE-CM1</td><td>장기 칩 생물 반응기</td></tr><tr><td>VE-Cadherin CD144 항 인간 항체 - APC conjugated</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-126-010</td><td></td></tr><tr><td>Wide-beveled cell lifter</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>MACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD144 MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-857</td><td></td></tr><tr><td>CD31 MicroBead Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>LS 컬럼</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr></tbody></table>

인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 isogenic 신장 사구체 칩

Isogenic Kidney Glomerulus Chip Engineered from Human Induced Pluripotent Stem Cells

만성 신장 질환(CKD)은 미국 성인 인구의 15%에 영향을 미치지만 인간의 생물학적 반응과 신독성을 정확하게 예측할 수 있는 기능 모델이 부족하여 표적 치료법의 확립이 제한되었습니다. 신장 정밀 의학의 발전은 이러한 한계를 극복하는 데 도움이 될 수 있습니다. 그러나, 이전에 확립된 인간 신장 사구체의 시험관내 모델(혈액 여과를 위한 주요 부위이자 많은 질병 및 약물 독성의 주요 표적)은 일반적으로 제한된 기능적 특성과 타의 추종을 불허하는 유전적 배경을 가진 이질적인 세포 집단을 사용합니다. 이러한 특성은 환자 특정 질병 모델링 및 치료 발견에 대한 적용을 크게 제한합니다. 
이 논문은 단일 환자의 인간 유도 만능 줄기 (iPS) 세포 유래 사구체 상피 (podocytes)와 혈관 내피를 통합하여 등성 및 혈관 화 된 미세 유체 신장 사구체 칩을 설계하는 프로토콜을 제시합니다. 결과 사구체 칩은 줄기 세포 유래 내피 및 상피 세포층으로 구성되어 계통 특이 적 마커를 발현하고 기저막 단백질을 생성하며 신장의 사구체 여과 장벽과 유사한 조직-조직 인터페이스를 형성합니다. 설계된 사구체 칩은 분자를 선택적으로 필터링하고 약물로 인한 신장 손상을 요약합니다. 이소제닉 세포 유형을 사용하여 신장 사구체의 구조와 기능을 재구성하는 능력은 환자 특이성으로 신장 질환을 모델링하고 신장 정밀 의학 및 관련 응용 분야를 위한 장기 온 칩의 유용성을 발전시킬 수 있는 기회를 제공합니다.

여기서 우리는 사구체의 기능적 3D 시험관 내 모델이 인간 iPS 세포의 등종 공급원으로부터 혈관화되고 상피화될 수 있음을 보여줍니다. 특히, 이 프로토콜은 인간 iPS 세포 기술, 특히 특수 세포 유형으로 분화하는 능력을 적용하여 환자 특정 수준에서 인간 신장의 구조와 기능을 모델링하기 위해 미세유체 장치와 통합될 수 있는 신장 사구체 상피(podocytes) 및 혈관 내피(viECs)를 생성하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 프로토콜 및 타임라인(그림 1A)의 개략적인 개요는 유사분열적으로 활성화된 인간 iPS 세포(그림 1B)를 배양한 다음 중배엽 및 측면 중배엽 세포 계통(그림 1C, D)으로 (병렬로) 분화하는 방법을 설명합니다. 생성된 중배엽 세포는 근접(T)을 발현하는 것으로 밝혀졌고, 측면 중배엽 세포는 ...

여기에 제시된 것은 인간 유도 만능 줄기 세포에서 분화 된 유 전적으로 일치하는 상피 및 혈관 내피 세포를 통합하여 신장 사구체 여과 장벽의 구조와 기능을 요약하는 개인화 된 장기 온 칩 시스템을 설계하는 프로토콜입니다. 이 생체 공학 시스템은 신장 정밀 의학 및 관련 응용 분야를 발전시킬 수 있습니다.

인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩

Chronic kidney disease (CKD) affects 15% of the U.S. adult population, but the establishment of targeted therapies has been limited by the lack of ...

동종 사구체 칩은 환자 특이적 질병 모델링 및 신독성 테스트 및 고급 정밀 의학 응용 프로그램을 가능하게 합니다. 사구체 상피와 내피는 인간 유도 만능 줄기 세포 또는 IPSC의 단일 집단에서 파생됩니다. IPSC는 무제한자가 재생을 가지고 있으며 거의 모든 세포 유형으로 분화 할 수 있습니다.이 기술은 병리학 적 세포 표현형 및 질병을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 환자 별 장기 칩은 약물 스크리닝 및 기계 연구를위한 플랫폼 역할도 할 수 있습니다. 이 모델은 특정 환자에게 개인화 된 바디 온 칩 시스템의 개발에 적용될 수 있습니다.이 시스템은 임상 테스트 전에 환자 별 반응을 예측할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 25 마이크로 리터의 기저막 매트릭스 2 용액을 비뇨기 채널에 부드럽게 추가하고 20 마이크로 리터를 칩의 모세관 채널에 추가하여 시작하십시오. 두 개의 멸균 15 밀리리터 원추형 튜브 캡을 가져 와서 500 마이크로 리터의 멸균 증류수로 채 웁니다.건조를 방지하기 위해 페트리 접시에 뚜껑을 놓고 접시에 뚜껑을 놓습니다. 섭씨 37도에서 밤새 배양하십시오. 진행하여, 혈관 내피 세포의 15일간 배양물을 함유하는 T75 플라스크로부터 배지를 90% confluency로 흡인한다.5 밀리리터의 세포 분리 완충액을 추가하고 섭씨 37도에서 5-7 분 동안 배양합니다. 그런 다음 세포를 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮기고 5 밀리리터의 DMEM / F-12를 추가합니다. 200배 G에서 5분 동안 원심분리합니다.상청액을 제거하고 세포를 300 마이크로리터의 내피 유지 배지에 재현탁시킨다. 혈구계로 세포를 세어 약 2 백만 개의 세포를 얻습니다. P200 배리어 팁을 사용하여 미세유체 칩의 상단 및 하단 채널을 200마이크로리터의 DMEM/F-12로 플러시하는 동시에 콘센트 주변에서 흡인합니다.흡인기에 부착된 P200 배리어 팁을 하단 채널의 출구에서 멀리 떨어뜨려 칩을 단단히 잡습니다. 20 마이크로 리터의 혈관 내피 세포 현탁액을 칩의 모세 혈관 채널에 단단히 주입하고 출구 주변에서 배지를 조심스럽게 흡인합니다. 현미경으로 기포 또는 고르지 않은 파종 밀도를 확인하십시오.세포가 유연한 PDMS 멤브레인의 기저부에 부착 될 수 있도록 칩을 부드럽게 뒤집습니다. 칩을 홀더 카트리지에 넣고 멤브레인이 마르지 않도록 카트리지에 PBS 3ml를 추가합니다. 칩을 섭씨 37도에서 3 시간 동안 배양하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 정의된 화학적 조건 하에서 세포 분화를 통해 유도 만능 줄기 세포에서 인간 신장 포도세포를 추출하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 생성된 포도사이트(podocytes)는 신독성 검사 및 질병 모델링에 사용할 수 있습니다.

유도 만능 줄기 세포에서 인간 신장 Podocytes 도출: 줄기 세포에서 성숙한 Kidney Podocytes 의 지시된 분화를 위한 절차

여기 우리는 신장 혈관 주위 Stromal 세포 (kPSCs) 소화 효소와 NG2 셀 농축 전체가 장기 관류에 따라 새로운 임상 등급 고립과 문화 방법 제시. 이 방법으로 세포 치료에 대 한 충분 한 셀 번호 취득 가능 하다.

인간의 신장 혈관 주위 Stromal 세포에 대 한 새로운 임상 등급 격리 방법

여기에 제시된 화학적으로 정의된 프로토콜은 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 &gt; 유전 조작 또는 하위 집단 선택과 무관하게 유도된 다능성 줄기 세포로부터 의하여 유래한다. 이 프로토콜은 26 일 이내에 원하는 세포 유형을 생성하고 신장 독성 검사 및 질병 모델링에 유용 할 수 있습니다.

화학적으로 정의된 조건하에서 인간 유도된 다능성 줄기 세포에서 성숙한 신장 분피의 유도된 분화

여기서 우리는 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)로부터 신장 오가노이드를 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 두 주 이내에 신장 오가노이드를 생성합니다. 생성된 신장 오가노이드는 병렬 약물 테스트 접근법을 위해 대규모 스피너 플라스크 또는 다중 웰 자기 교반 플레이트에서 배양될 수 있다.

인간 다능성 줄기 세포로부터 신장 오가노이드를 생성하는 단순화된 방법

여기에서 우리는 닭 배아의 celomic cavity에서 신장 오가노이드의 이식을 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. 이 방법은 8일 이내에 오가노이드의 혈관 형성 및 성숙 향상을 유도하고 이러한 과정을 효율적인 방식으로 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

닭 배아에서 Intracelomic Transplantation을 통한 신장 오가노이드의 효율적인 혈관 형성

이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포(hiPSC)로의 에피솜 재프로그래밍과 후속 족세포로의 분화를 통해 진피 섬유아세포에서 환자 특이적 족세포를 생성하는 2단계 프로토콜을 설명합니다.

피부 생검에서 환자 유래 Podocytes의 생성

이 프로토콜은 현탁 배양 조건을 사용하여 유도만능줄기세포(iPSC)에서 신장 오가노이드를 생산하기 위한 포괄적이고 효율적인 방법을 제시합니다. 이 연구의 주요 초점은 초기 세포 밀도와 WNT 작용제 농도의 결정에 있어 신장 오가노이드 연구에 관심이 있는 연구자에게 도움이 됩니다.

유도만능줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells)에서 현탁액의 신장 오가노이드 생성

이 프로토콜의 개발, 확대, hESCs에와 유도 만능에서 파생 된 NK 세포의 생체 내 이미징에 대해 설명합니다.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

선물이 파생 된 세포 (PDCs) 비타민 C (비타민 C) 및 1, 25-dihydroxy 비타민 D [1,25-(OH)2D3]에 의해 유도 된의 mRNA 식 biomarkers를 조사 하는 프로토콜. 또한, 우리는 osteocytes, chondrocytes, adipocytes에 차별 하는 Pdc의 능력을 평가 합니다.

인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

배우세요 인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩 기술을 활용하여 환자 특이적 질병 모델링과 신독성 검사를 수행하는 방법을 익히세요. 이 혁신적인 오가노이드 칩 시스템은 정밀 의학 발전에 기여합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포로 설계된 Isogenic 신장 사구체 칩

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