Name: 난소 눈의 유리체 내 주사 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 3 min 37 s
Description: 배우세요 양 눈 유리체 내 주사를 통한 망막 퇴행성 질환 유전자 치료법. 이 프로토콜은 인간 안과 치료를 위한 덜 침습적인 동물 모델로서 안전성과 효능을 평가합니다.

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저자는 Steve Heap 박사 (BVSc, CertVOphthal)가이 프로토콜을 수립하고 Murray et al.15에 의해 설명 된 주사를 수행하는 데 도움을 준 것에 대해 인정하고자합니다. 저자는 또한 CureKids New Zealand, Canterbury Medical Research Foundation, Neurogene Inc 및 Batten Disease Support and Research Association의 자금 지원을 인정합니다.

모든 실험 프로토콜은 링컨 대학 동물 윤리위원회의 승인을 받았으며 연구에서 동물의 관리 및 사용에 대한 미국 국립 보건원 지침 및 뉴질랜드 동물 복지법 (1999)과 일치합니다. 보더데일 양은 출생14 세에 진단을 받았고 링컨 대학교 연구 농장에서 관리되었습니다. 3개월 된 동형접합체(CLN5-/-) 암양 3마리가 왼쪽 눈에 IVT 단일 주사를 맞았고, 치료되지 않은 오른쪽 눈은 내부 대조군 역할을 했습니다. 전기 망막 조영술 및 병리학 데이터는 과거의 건강 및 영향을받은 대조군 데이터와 비교되었습니다. 이 연구에 사용된 바이러스 벡터는 치킨 베타 작용(CBh) 프로모터와 코돈 최적화된 양 CLN5 (scAAV9/CBh-oCLN5opt)를 포함하는 자가 상보적인 아데노 관련 바이러스 혈청형 9였습니다. 바이러스 벡터는 미국 노스캐롤라이나주 노스캐롤라이나 대학교 벡터 코어에 의해 제공되었다.
1. 수술 전
<ol><li>수술 키트를 오토클레이브합니다(그림 1).</li>
	<li>수술 전에 양을 24 시간 동안 금식하십시오.</li>
	<li>수술 전에 생체중을 기록하십시오.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig01.jpg"> 그림 1: 유리체내 수술 키트. IVT 수술에 필요한 도구에는 (1) 눈꺼풀을 열린 상태로 유지하는 검경과 (2) 구근 결막을 잡고 눈을 회전시키는 한 쌍의 구부러진 코 집게가 포함됩니다. (3) 구근 결막을 잡고 안와로 다시 굴러 들어간 경우 눈을 제자리에 고정하는 대체 도구로 직선 코 지혈 장치도 포함됩니다. 이 키트는 수술 전에 오토클레이브됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
2. 수술 절차
<ol><li>동물을 제지하고 전자 클리퍼를 사용하여 목의 한쪽에서 경정맥 위로 양모를 면도하십시오.</li>
	<li>경정맥 홈의 기저부에 압력을 가하여 경정맥을 폐색하고 융기된 정맥을 시각화합니다.</li>
	<li>적절한 양의 디아제팜(0.3mg/kg)과 케타민(7.5mg/kg)을 멸균 주사기에 넣고 멸균 20G 바늘을 부착합니다. 바늘을 경정맥에 삽입하고 플런저를 부드럽게 뒤로 당겨 혈액이 허브로 들어가고 바늘이 정맥 내부에 있는지 확인합니다. 일단 확인되면, 정맥 (jugular) 투여를 통해 유도한다.</li>
	<li>유도 직후 동물을 등쪽 누운 자세에 놓고 목을 펴고 후두경을 사용하여 후두를 시각화하여 혀를 위아래로 잡습니다. 동물이 숨을 내쉴 때 성대 사이에 기관 내 튜브 (양의 크기에 따라 크기 6.0-9.0)를 부드럽게 삽입하여 기관 내 삽관을 수행하십시오. 기관 내 커프를 즉시 팽창시키고 아래턱 주위에 넥타이로 튜브를 고정하십시오. 튜브를 통한 공기 흐름을 확인하십시오.</li>
	<li>양을 수술대로 옮기고 옆으로 누운 곳에 놓습니다.</li>
	<li>기관 내 튜브를 마취기의 호스에 즉시 연결하여 100 % 산소에서 이소 플루 란을 전달합니다. 처음에는 3%-4% 이소플루란으로 시작한 다음 유지 관리를 위해 2%-3%로 줄입니다. 양의 자발적인 환기를 관찰하십시오.</li>
	<li>시술 전반에 걸쳐 심박수, 호흡수, 산소 포화도, 호기말CO2 수준 및 직장 체온을 모니터링합니다. 마취된 양에서 이러한 매개변수에 대한 생리학적 값은 표 1 을 참조하십시오(가변적이지만 지침으로 사용).</li>
	<li>수술용 카트에 크고 멸균된 사각형 드레이프를 놓고 멸균 기구를 그 뒤에 놓습니다.</li>
	<li>주사할 눈 위에 멸균된 수술용 드레이프를 놓습니다.</li>
	<li>멸균 된 20mL 주사기를 사용하여 눈을 무균 적으로 소독하여 1-5 % 포비돈-요오드 용액으로 눈을 관개하십시오.</li>
	<li>알카인 0.5% W/V 안액에 1-2방울을 국소 마취제로 눈에 바릅니다.</li>
	<li>노파 바라케르-콜리브리 눈 검경(10mm)을 눈꺼풀에 맞추어 눈을 뜨게 합니다.</li>
	<li>집게로 눈의 배외측 쪽에 있는 구근 결막을 잡고 눈 지구를 복측으로 회전시킵니다.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>의식</td>
			<td>마 취</td>
			<td>권장되는 중요 개입 지점</td>
		</tr><tr><td>심박수(비트/분)</td>
			<td>50-80(휴식)에서 280(활성)</td>
			<td>50-80</td>
			<td>&lt;50, &gt;100</td>
		</tr><tr><td>호흡수(호흡수/분)</td>
			<td>15-40 (휴식)에서 350 (과열)</td>
			<td>10-30</td>
			<td>&lt;8, &gt;40</td>
		</tr><tr><td>산소 포화도 (밀리미터 Hg)</td>
			<td>95-100</td>
			<td>98-100</td>
			<td>&lt;90</td>
		</tr><tr><td>호기말 CO2 (mmHg)</td>
			<td>35-45</td>
			<td>35-45</td>
			<td>&gt;55</td>
		</tr><tr><td>체온 (°C)</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>38.5-39.5</td>
			<td>&lt;36, &gt;40</td>
		</tr></tbody></table>표 1 : 마취 된 양에서 모니터링 할 매개 변수의 생리 학적 값.
3. 바이러스 제제
<ol><li>AAV 벡터 분취량은 사용할 때까지 -80°C에서 보관하십시오.</li>
	<li>수술 당일, 얼음에서 IVT 전달에 필요한 수의 바이알을 해동하십시오.</li>
	<li>투여 직전에, 바이러스 벡터 분취량을 400 × g 에서 10초 동안 와동시켜 내용물을 수집하였다.</li>
	<li>멸균 여과된 1x 인산완충 식염수(PBS)에 각 바이러스 벡터 분취량을 최종 부피 100μL의 원하는 용량으로 희석합니다. 멸균 필터 피펫 팁을 사용하여 멸균된 1.5mL 저단백질 결합 마이크로원심분리 튜브에서 벡터 희석액을 준비합니다. 바이러스 벡터와 접촉 한 모든 소모품을 소독액에 폐기하십시오 ( 재료 표 참조). 참고: 원래 간행물15 에서 치료제(AAV9. CLN5)는 1.9 x 1010 바이러스 게놈이었다. 권장 복용량은 투여되는 치료제에 따라 다릅니다. 따라서 여기에 제시된 표준 프로토콜에는 복용량이 포함되지 않았습니다.</li>
	<li>AAV 벡터 제제의 전체 100μL를 즉시 주입할 수 있도록 바늘에 영구적으로 부착된 28G x 1/2가 있는 멸균된 저사수 공간 1mL 주사기에 넣습니다. 준비에서 주사까지의 시간이 2분 미만인지 확인하십시오.</li>
</ol>4. 바이러스 투여
<ol><li>바늘을 눈의 측면에있는 공막에 약 7mm 뒤쪽으로 삽입하고 렌즈를 피하기 위해 뒤쪽으로 기울입니다 (그림 2 및 그림 3). 100 μL의 단일 주사를 망막 표면을 교란하지 않고 가능한 한 망막에 가까운 볼루스로 투여한다.</li>
	<li>검경과 드레이프를 제거하기 전에 약 10-15mL의 1-5% 포비돈-요오드 용액과 10mL의 식염수로 눈을 헹굽니다.</li>
	<li>양을 뒤집고 필요한 경우 다른 눈으로 반복하십시오.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig02.jpg"> 그림 2: 눈 지구본의 복측 회전. (A) 톱니가 없는 겸자로 구근 결막을 잡고 (B) 복부로(즉, 아래쪽으로) 회전하여 주사를 위해 눈의 등측 표면을 노출시킵니다. 약어 : V = 복부, D = 등쪽, M = 내측, L = 측면. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63823/63823fig03.jpg"> 그림 3: 사출 위치 및 깊이. 바늘은 눈 지구본의 등측 측면에 주입되고 바늘 샤프트의 전체 길이(0.5인치/12.7mm)가 눈에 삽입됩니다. 렌즈를 피하고 가능한 한 망막에 가깝게 주입하기 위해 눈의 뒤쪽을 향한 바늘의 각도에 유의하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63823/63823fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
5. 수술 후 관리
<ol><li>절차가 완료되면 이소 플루 란 가스 흡입 마취를 중단하고 100 % 산소로 라인을 세척하고 기관 내 튜브에서 호스를 분리 한 다음 양을 회복실로 옮깁니다.</li>
	<li>양을 흉골 누운 자세로 놓고 다리를 아래에 집어 넣고 완전히 회복 될 때까지 모니터링하십시오. 동물의 입에 장애물이 없는지 확인하십시오.</li>
	<li>삼키는 반사가 관찰되면 기관 내 튜브의 커프를 부분적으로 수축시키고 입에서 튜브를 부드럽게 제거하십시오.</li>
	<li>뒷다리의 이두근 대퇴근에 근육 내 비 스테로이드 성 항염증제를 투여하고 목 옆이나 어깨 뒤쪽의 피하 항생제를 투여하고 0.5 % 클로람페니콜 점안액을 눈 구체 표면에 투여합니다.</li>
	<li>양이 도움 없이 설 수 있게 되면 물과 음식(루체른 알갱이와 왕겨)을 제공하십시오.</li>
	<li>수술 후 7 일 동안 하루에 2-3 % 0.5 % 클로람페니콜 안약을 투여하십시오.</li>
	<li>수술 후 약 24 시간 후에 야외 목장으로 돌아 오기 전에 양을 밤새 실내에 두십시오.</li>
	<li>3 주 동안 매일 직장 온도를 기록하십시오. 맥박 또는 호흡수, 음식 섭취, 신경 행동, 체온, 체중, 자세, 눈 건강 및 건강 악화의 임상 징후의 변화를 모니터링합니다. 부작용의 징후가있는 경우 적절한 수의 치료를 받으십시오.</li>
</ol>6. 생체 내 효능 평가
<ol><li>IVT 주사의 목표가 시력을 보존하는 것이라면 망막 세포 기능을 평가하기 위한 미로 검사 또는 전기 망막 조영술(ERG) 또는 망막 구조를 평가하기 위한 광학 간섭 단층 촬영(OCT)과 같은 방법으로 생체 내 효능을 모니터링합니다. 참고: 이러한 효능 측정은 IVT 유전자 요법11,15,16 이후에 잘 설명되었습니다.</li>
</ol>7. 사후 조직 분석
<ol><li>유리체 내 주사 수술 후 적절한 종말점에서 승인 된 방법으로 양 안락사를 수행하십시오. 참고: 정맥 주사 수의학 안락사 약물 또는 경추에 관통하는 포로 볼트와 같은 제안된 안락사 방법은15,16의 다른 곳에 자세히 설명되어 있습니다.</li>
	<li>외과 용 날카 롭고 뭉툭한 곡선 가위를 사용하여 양 눈 지구를 수확합니다. 측면 및 내측 칸투스를 절단하여 눈 소켓 개구부를 늘린 다음 결막 주름, 결합 조직, 근육 및 시신경을 체계적으로 절단하여 소켓에서 눈 지구를 제거합니다.</li>
	<li>2 시간 동안 10 % 포르말린에 온전한 상태로 핵을 제거한 눈 구체를 침지 고정시킨 다음 4 시간 동안 Bouin의 용액에 후고정하여 충분한 관류를 허용하기 위해 공막에서 작은 (0.5cm) 절단을합니다. 또는 데이비슨의 용액에 아이 글로브를 48시간 동안 침지하여 고정할 수 있습니다.</li>
	<li>일상적인 파라핀 왁스 매립 및 3-5 μm의 절편을 통해 눈 조직의 절편을 처리합니다. 참고: 헤마톡실린 및 에오신 (H&amp;E) 염색 및 면역조직화학 분석을 위한 염색 절차는 이전에15,16에 기술되었다.</li>
	<li>망막 세포 유형, 망막 아교 세포 또는 관심 단백질에 대한 총 망막 두께, 망막 층 두께, 외부 핵층 세포 열 수 및 면역 조직 화학적 염색과 같은 측정을 통해 사후 조직의 효능을 평가합니다. 참고: 이러한 분석에 대한 프로토콜은 이전 간행물15,16을 참조하십시오.</li>
</ol>

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저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

유리체 내 주사는 인간 안과에서 가장 일반적인 수술 절차 중 하나이며 양의 망막에 AAV 매개 유전자 요법을 전달하는 데 효과적인 것으로 입증되었습니다. 우리는 이전에 AAV9의 효능을 입증했습니다. CLN5 유전자 요법은 CLN5 NCL15로 양에서 망막 기능 장애 및 퇴행을 약화시키는 유리체 내 전달을 받았습니다. 인간 NCL 환자에게이 투여 경로의 번역이 또한 유익한 것으로 입증 될 것으로 기대된다.
양의 눈에 소량 IVT 주사를 위한 프로토콜은 비교적 간단하고 비침습적이며 쉽게 재현할 수 있고 비전문가도 쉽게 배울 수 있습니다. 성공 여부는 망막 내의 표적 세포, 전달되는 치료법, 주사 자체의 위치와 방향에 달려 있습니다. IVT 주사는 종종 망막 내층을 표적으로 하는 데 가장 효과적인 것으로 생각되지만, 많은 연구자들은 망막 외막이 질병 발병기전의 주요 위치인 질병에서 IVT 주사의 효능을 입증했습니다 <sup class="xr...

치료제를 망막에 전달하기 위해 유리체내(IVT), 망막하, 흉막상, 안구주위 또는 국소 투여를 포함하는 여러 방법이 사용될 수 있다. 각 투여 경로는 혈액 망막 장벽 또는 내부 및 외부 제한막과 같은 장벽을 극복하는 것을 포함하며 전달되는 약물 및 특정 망막 표적 1,2에 따라 효능 비율이 다릅니다.
IVT 약물 전달은 눈의 후방을 차지하는 젤라틴 물질 인 눈의 유리체 체액에 주사하는 것을 포함합니다. 유리체 유머의 주요 기능은 눈 구체의 모양을 유지하고 렌즈 및 망막과 같은 안구 조직을 제자리에 유지하는 것입니다. 유리체 체액은 주로 물로 구성되어 있으며 소량의 콜라겐, 히알루 론산 및 기타 비 콜라겐 성 단백질3. IVT 주사는 연령 관련 황반 변성, 당뇨병성 황반 부종, 당뇨병성 망막병증, 망막 정맥 폐색 및 여러 유전성 망막 이영양증 4,5를 포함한 광범위한 안구 상태를 치료하기 위해 일상적으로 사용되는 간단하고 일반적인 절차입니다.
뉴런 세로이드 리포푸시노스(NCL; Batten disease)는 뇌와 망막의 심각한 퇴행을 유발하는 치명적인 리소좀 축적 질환의 그룹입니다. 현재 주로 어린이에게 영향을 미치지 만 발병 연령과 질병 중증도가 다양한 다양한 다른 유전자 (CLN1-8, CLN10-14)의 돌연변이로 인한 NCL의 13 가지 알려진 변종이 있습니다6. NCL은인지 및 운동 저하, 발작 및 시력 상실을 포함한 일반적인 진행성 증상을 공유합니다. NCL에 대한 치료법은 없습니다. 그러나 뇌 유도 효소 대체 요법은 현재 CLN2 질환 7,8에 대한 임상 시험 중이며 AAV 매개 유전자 요법은 전임상 연구에서 큰 가능성을 보여 CLN5 유전자 요법에 대한 임상 시험은 2022 년에 시작될 것으로 예상됩니다 9,10.
다른 많은 종들은 고양이, 개, 양 및 소를 포함하여 자연적으로 발생하는 형태의 NCL을 개발합니다. NCL의 두 가지 양 모델은 현재 뉴질랜드에서 활발히 연구 중입니다 : 보더 데일 양의 CLN5 질병 모델과 사우스 햄프셔 양의 CLN6 질병 모델. 영향을받은 양은 망막 위축 및 시력 상실10,11을 포함하여 인간 질병의 많은 임상 적 및 병리학 적 특징을 나타냅니다. CLN5 질환이 있는 양에서 뇌 유도 CLN5 유전자 요법이 뇌 위축과 임상적 쇠퇴를 예방하거나 중단시킬 수 있지만, 치료받은 양은여전히 시력을 잃습니다9. 이것은 시력을 보존하고 더 나은 삶의 질을 유지하기 위해 망막을 치료할 필요성을 강조하여 양의 안구 유전자 치료를위한 프로토콜을 수립하게되었습니다.
양눈은 눈 구체 치수, 유리체 부피 및 망막 구조10,12,13의 유사성으로 인해 인간 눈의 좋은 모델을 나타냅니다. 이 논문은 소량의 (≤100 μL) 치료 바이러스 벡터를 난소 눈에 IVT 전달하기위한 수술 프로토콜을 자세히 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>영구적으로 부착된 0.5인치 바늘이 있는 1mL 저데드 스페이스 안전 주사기</td><td>Fisher Scientific, Auckland, New Zealand</td><td>05-561-28</td><td>Covidien Monoject Tuberculin 안전 주사기 또는 유사한</td></tr><tr><td>1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HS4323</td><td>Autoclave 튜브를 사용하여 사용 전 살균</td></tr><tr><td>마취기와 가스 벤치 및 모니터&nbsp;</td><td>Hyvet Anesthesia, 크라이스트처치, 뉴질랜드</td><td></td><td></td></tr><tr><td>항생제 안약&nbsp;</td><td>Teva Pharma Ltd, 오클랜드, 뉴질랜드</td><td></td><td>상업명: Chlorafast (0.5% chloramphenicol)</td></tr><tr><td>BrightMount plus anti-fade mounting medium</td><td>Abcam, Cambridge, United Kingdom</td><td>ab103748</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4&prime; ,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, United States</td><td>10236276001</td><td></td></tr><tr><td>Diazepam 진정제</td><td>Ilium, Troy Laboratories Pty Ltd, 뉴질랜드</td><td></td> 타우랑가 <td>5mg/mL</td></tr><tr><td>기관내관</td><td>Flexicare Medical Ltd, Mountain Ash, 영국</td><td></td><td>표준, 수갑. 양 크기에 따라 사이즈 7, 7.5 또는 8</td></tr><tr><td>Eye speculum</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>KP151/14</td><td>Nopa Barraquer-Colibri (10 mm)</td></tr><tr><td>Fenestrated surgical drape</td><td>Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand</td><td>DI583</td><td>또는 유사한&nbsp;</td></tr><tr><td>필터 팁</td><td>Interlab, 오클랜드, 뉴질랜드</td><td></td><td>10, 200 및 1,000 &마이크로; 엘&nbsp;</td></tr><tr><td>포름알데히드 용액 (37%)</td><td>Fisher Scientific, Auckland, New Zealand</td><td>AJA809-2.5PL</td><td>0.9% NaCl</td></tr><tr><td>염소 항토끼 Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen Carlsbad, CA, USA</td><td>&nbsp; A-11012</td> 1<td>:500</td></tr><tr><td>Isoflurane 마취제</td><td>Attane, Bayer Animal Health, Auckland, New Zealand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamine HCl 마취제/진통제</td><td>PhoenixPharm Distributors Ltd, Auckland, New Zealand</td><td></td><td>100 mg/mL</td></tr><tr><td>후두경 (수의학)</td><td>KaWe Medical, Denmark</td><td></td><td>Miller C 블레이드, 크기 2</td></tr><tr><td>바늘&nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>302025</td><td>BD Hypodermic Needles, 또는 이와 유사한</td></tr><tr><td>비스테로이드성 항염증제</td><td>Boehringer Ingelheim (NZ) Ltd, Auckland, New Zealand</td><td>49402/008</td><td>상업명: Metacam 20 (20 mg/mL meloxicam)</td></tr><tr><td>Non-toothed forceps</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>AB864/16</td><td>또는 이와 유사한&nbsp;</td></tr><tr><td>비이빨 헤모스탯</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>AA150/12</td><td>또는 이와 유사한&nbsp;</td></tr><tr><td>일반 염소 혈청</td><td>Thermo Fisher Scientific, 크라이스트처치, 뉴질랜드</td><td>16210072</td><td></td></tr><tr><td>산소 (의료)</td><td>BOC 가스, 크라이스트처치, 뉴질랜드</td><td></td><td>D2 실린더, 가스 코드 180</td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific, 크라이스트처치, 뉴질랜드</td><td>10010023</td><td>멸균, 여과된</td></tr><tr><td>포비돈-요오드 용액</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>005835</td><td>상업명: Betadine (10% povidone-iodine)</td></tr><tr><td>Rabbit anti-cow glial glial fibrillary acidic protein (GFAP)</td><td>Dako, Glostrup, Denmark</td><td>Z0334</td><td>1:2,500</td></tr><tr><td>의 희석액에서 사용치킨 베타 작용(CBh) 프로모터 및 코돈 최적화 양 CLN5를 포함하는 자가 보완성 아데노 관련 바이러스 혈청형 9</td>, <td>University of North Carolina Vector Core, NC, USA.</td><td>scAAV9/CBh-oCLN5opt</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 0.9% IV 용액</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>AHB1322</td><td>상업명: 식염수 용액&nbsp;</td></tr><tr><td>피하 항생제</td><td>Intervet Schering Plough Animal Health Ltd, 웰링턴, 뉴질랜드</td><td></td><td>상업 이름: Duplocillin LA (150,000 IU/mL 프로카인 페니실린 및 115,000 IU/mL 벤자틴 페니실린)</td></tr><tr><td>외과용 날카로운 뭉툭한 곡선 가위&nbsp;</td><td>Capes Medical Ltd, Tauranga, New Zealand</td><td>SSSHBLC130</td><td></td></tr><tr><td>Terumo Syringe Luer Lock</td><td>Amtech Medical Ltd, Whanganui, New Zealand</td><td>SH159/SH160</td><td>멸균 주사기; 유도 약물 작성용 10mL, 식염수</td></tr><tr><td>Virkon 소독제 분말</td> 작성용 20mL <td>EBOS Group Ltd, 뉴질랜드 크라이스트처치</td><td>28461115</td><td></td></tr></tbody></table>

난소 눈의 유리체 내 주사

Intravitreal Injections in the Ovine Eye

망막에 치료제를 전달하는 방법에는 유리체내(IVT), 망막하, 흉막상, 안구주위 또는 국소 투여를 비롯한 여러 방법이 있습니다. IVT 약물 전달은 눈의 후방을 채우고 눈 구체의 모양을 유지하는 젤라틴 물질인 눈의 유리체액에 주사하는 것을 포함합니다. IVT 경로는 망막 하 전달보다 덜 구체적으로 표적화되지만 훨씬 덜 침습적이며 다양한 안구 질환에 대한 임상 환경에서 널리 사용됩니다. 
우리는 이전에 아데노 관련 바이러스(AAV) 매개 유전자 치료 제품(AAV9)의 유리체내 전달의 효능을 입증했습니다. CLN5) 자연적으로 발생하는 CLN5 형태의 신경 세로이드 리포푸신증(NCL)이 있는 양에서. 영향을받은 양은 한쪽 눈에서 IVT 유전자 치료를 받았고 다른 쪽 눈은 내부 대조군으로 사용되었습니다. 망막 구조와 기능은 치료 후 최대 15개월까지 치료된 눈에서 유지된 반면, 치료되지 않은 눈은 사후 검사 중에 점진적으로 기능 저하와 심각한 위축을 보였습니다. 양 연구에 따르면 CLN5 유전자 치료 제품은 2021년 9월 미국 식품의약국(FDA)으로부터 후보 임상시험용 신약(IND)으로 승인되었습니다. 이 논문은 치료 바이러스 벡터를 난소 눈에 IVT 전달하기위한 수술 프로토콜을 자세히 설명합니다.

CLN5 NCL을 가진 양에서 망막 기능 장애 및 퇴행을 약화시키는 CLN5 유전자 요법 벡터의 IVT 전달의 효능은 이전에 이 연구 그룹15에 의해 입증되었습니다. 영향을 받은 양은 AAV 혈청형 9(AAV9) 벡터(AAV9)에 패키징된 CLN5의 단일 100μL IVT 주사를 받았습니다. CLN5)를 한쪽 눈으로, 반대쪽 눈은 치료되지 않은 내부 대조군 역할을합니다. 시력은 주사 시점의 연령 (3 개월)부터 말기 질환 (18 개월)까지 매월 평가되었다. 망막 조직학의 사후 분석은 치료된 눈과 치료되지 않은 눈뿐만 아니라 연령이 일치하는 건강한 대조군과 CLN5에 영향을 받은 대조군에서 수행되었습니다.
망막 조영술(ERG) 분석은 치료된 눈에서 보존된 망막 기능을 입증한 반면, 치료되지 않은 눈은 CLN5에 영향을 받은 동물과 유사한 방식으로 감소했습니다(그림 4)<sup class...

유리체 내 주사는 망막에 바이러스 매개 유전자 요법을 전달하기 위해 양 눈에서 수행되었습니다.

There are several methods for the delivery of therapeutic agents to the retina, including intravitreal (IVT), subretinal, suprachoroidal, periocular, or ...

유리체내 주사는 치료제를 망막에 전달하는데 사용될 수 있다. 인간의 눈의 모델로서 양의 눈에 유리체 주사를위한 프로토콜이 여기에 제시됩니다. 유리체 주사는 다른 안구 주사보다 훨씬 덜 침습적입니다.유리체내 주사는 유전자 치료 제품을 전달하고 자연적으로 발생하는 뉴런 세로이드 리포푸시노스로 양의 망막 변성을 치료하는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 양이 마취되면 20 밀리리터 주사기를 사용하여 1-5 % 포비돈 요오드 용액으로 관개하여 주사 할 눈을 무균 적으로 소독하기 시작합니다. 그런 다음 멸균 된 수술 드레이프를 눈 위에 놓습니다.눈 검경을 눈꺼풀에 맞추어 눈을 뜨게 합니다. 집게로 눈의 등쪽 측면에 있는 구근 결막을 잡고 눈 지구를 복측으로 회전시킵니다. 바늘을 눈의 측면 측면에서 공막에 약 7mm 후방으로 삽입하고 렌즈를 피하기 위해 후방으로 기울입니다.망막 표면을 방해하지 않고 가능한 한 망막에 가깝게 100 마이크로 리터의 단일 주사를 볼 루스로 투여하십시오. 검경과 드레이프를 제거하기 전에 약 10-15 밀리리터의 1-5 % 포비돈 요오드 용액과 10 밀리리터의 식염수로 눈을 헹굽니다. 전기 망막 조영술 분석은 치료받은 눈에서 보존 된 망막 기능을 입증 한 반면, 치료되지 않은 눈은 CLN5에 영향을받은 동물과 유사한 방식으로 감소했습니다.망막 조직학은 중앙 망막의 건강한 대조군 동물과 비슷한 총 망막 두께로 치료 된 눈에서 거의 정상화되었습니다. 대조적으로, 치료되지 않은 망막의 두께는 CLN5에 영향을 받은 동물과 비슷했습니다. 망막 스트레스와 성상교세포의 마커인 신경교섬유소 산성 단백질(GFAP)의 발현은 치료되지 않은 눈보다 치료된 눈에서 낮았으며, 이는 치료 후 질병 관련 염증이 약화되었음을 나타냅니다.양의 눈에 유리체내 주사를 위한 프로토콜이 확립됨에 따라 양은 이제 유리체내 전달되는 많은 치료제의 안전성과 효능을 테스트하는 데 사용될 수 있습니다.

Research

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의학

Intravitreous 주사는 안구 질환 또는 현지 치료의 직접적인 응용 프로그램으로 시각 과학 연구에 널리 사용되는 기법입니다. 이 동영상은 유리 피펫과 1ml 주사기를 사용하여 intravitreous 사출을위한 프로토콜을 보여주었다. 과다 출혈 및 렌즈 손상을 피하에 대한 유용한 팁은 주어집니다.

안구 질환 모델 구축을위한 Intravitreous 사출

출처: Park, SW, et al. 생쥐 망막 색소 상피에서 유전자 치료를 위한 바이러스 벡터의 윤부 접근법-망막하 주사. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 마우스 모델에서 망막 색소 상피(RPE)에 바이러스 벡터를 망막하 주입하는 방법을 설명합니다. 마취 및 눈 준비부터 정확한 렌티바이러스 벡터 전달에 이르기까지 RPE에서 유전자 통합 및 발현을 보장하는 절차를 자세히 설명합니다.

마우스 모델에서 망막 색소 상피에 바이러스 벡터의 망막하 주사

토끼는 안구 주사 약물의 약동학을 연구하는 데 널리 사용됩니다. 토끼 눈을 사용하여 안구 내 약물의 약동학 연구를 수행하는 방법을 설명합니다.

안구 약의 약동학 연구에서 토끼 눈의 사용

여기를 사용 하 여 고해상도 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (HR-SD-10 월) subretinal 공간으로 유전자 치료 대리인의 납품을 지원, 그 영역 범위를 평가 하 고 포토 리셉터 활력을 특성화 새로운 접근 방식을 설명 합니다.

초고 해상도 마우스 광학 일관성 단층 촬영 망막 유전자 치료 연구에서 안 구내 주사를 돕기 위해

망막 색소 상피 세포 건조 연령 관련 황 반 변성의 고급 형태에 대 한 세포 보충 치료 될 수 있습니다. 이 프로토콜 지리적 위축의 눈이 큰 모델 및 질병의이 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식의 생성을 설명합니다.

지리적 위축의 눈이 큰 모델에 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 색소 상피 세포의 subretinal 이식

우리는 여기에서 세균성 내과염의 마우스 모형에 있는 intravitreal 주입 및 후속 세균량의 방법을 기술합니다. 이 프로토콜은 숙주 면역 반응 및 세균 및 숙주 유전자 발현을 측정하기 위해 확장될 수 있다.

세균 성 내분염의 마우스 모형에 있는 감염 매개변수의 인트라비탈 주입 및 양

이 원고에서 결막 하 주사는 주입 / 회수 주사기 펌프와 미세 주입 바늘과 결합 된 기밀 제거 가능한 주사기로 구성된 주사 시스템을 사용하여 마우스의 안구 조직에 대한 유효한 벡터 전달 방법으로 입증됩니다. 이 주사 시스템은 다른 안내 내 투여 경로에도 적용 가능합니다.

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이 프로토콜은 중앙 각막 절개와 전방으로의 긴 터널을 사용하여 쥐에서 안내 주사 기술을 설명합니다. 이 주입 방법은 부주의한 조직 손상을 유발할 위험을 최소화하여 정밀도와 재현성을 향상시킵니다.

부작용 위험이 낮은 쥐에 대한 카메라내 주사

이 프로토콜은 주사를 위해 쥐의 시신경에 접근하기 위해 경결막 접근법을 사용하는 독특한 기술을 설명합니다.

쥐의 시신경에 주입하기 위한 경결막 접근법

이 연구는 성체 쥐의 망막과 시신경에 치료제를 전달하는 방법론을 제시합니다. 또한, 성체 쥐의 시신경과 망막을 하향식으로 일괄적으로 수집하기 위해 독특한 조직 회수 방법이 도입되었습니다.

성체 쥐의 안구 치료 전달 및 고급 조직 회수(Ocular Therapeutic Delivery and Advanced Tissue Retrieval in adult rats)

배우세요 양 눈 유리체 내 주사를 통한 망막 퇴행성 질환 유전자 치료법. 이 프로토콜은 인간 안과 치료를 위한 덜 침습적인 동물 모델로서 안전성과 효능을 평가합니다.

난소 눈의 유리체 내 주사

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