Name: 갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA의 전기천공-매개 전달 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: 배우세요 CRISPR-Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA를 일차 마우스 간세포에 전기천공으로 전달하는 방법을. 이 기술은 대사성 간 질환의 유전자 편집 및 세포 치료 연구에 활용됩니다.

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RNC는 사우스 캐롤라이나 생명 공학 센터 재생 및 Tissues 형성 파일럿 보조금 국립 보건원 (National Institutes of General Medical Sciences)의 NIGMS, 미국 간 질환 연구 협회 재단 및 미국 유전자 및 세포 치료 협회 (American Society of Gene & Cell Therapy)가 지원하는 보조금 번호 P30 GM131959, 2021000920, 및 2022000099 각각. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 미국 유전자 및 세포 치료 협회 또는 미국 간 질환 연구 재단 협회의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 그림 1 의 회로도는 BioRender.com 로 작성되었습니다.

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저자는 공개 할 경쟁 이익이 없습니다.

간세포 격리를위한 프로토콜에 설명 된 단계는 도전적이며 숙련도를위한 연습이 필요합니다. 간에서 성공적인 간세포 분리를위한 몇 가지 주요 단계가 있습니다. 첫째, 열등한 정맥 카바의 적절한 통조림은 완전한 간 관류에 필수적입니다. 관류 후 간에서 블랜칭이 없다는 것은 카테터의 변위를 나타냅니다 (표 1). 열등한 정맥 카바 (역행 관류)는 포털 정맥 (antegrade perfusion)보다 간단하고 접근하기 쉽기 때문에 절차에서 캐뉼레이션되었습니다 (antegrade perfusion)17,18. 일부 프로토콜은 카테터(19)를 고정하기 위해 봉합사를 사용한다; 그러나 봉합사는 과정을 복잡하게 만듭니다. 카테터를 봉합하면 카테터의 잘못된 배치와 같은 원치 않는 결과가 발생할 수 있으며 카테터의 위치를 조정할 수 없게 될 수 있습니다. 또한, 바늘을 제거...

간장의 IMD는 독성 대사 산물의 축적으로 이어지는 신진 대사에 관여하는 중요한 간 효소의 결핍을 특징으로하는 유전 질환입니다. 치료를받지 않으면 간 IMD가 장기 부전 또는 조기 사망 1,2를 초래합니다. 간장의 IMD 환자를위한 유일한 치료 옵션은 동종 외과 간 이식이며, 이는 기증자 장기의 낮은 가용성과 절차 3,4 이후의 면역 억제 요법으로 인한 합병증으로 인해 제한됩니다. 장기 조달 및 이식 네트워크에 의해 수집 된 최근 데이터에 따르면, 간 이식 대기자 명단에있는 성인 환자의 40 % -46 %만이 장기를 받고,이 환자의 12.3 %는 대기자 명단5에있는 동안 사망합니다. 또한, 모든 희귀 간 질환 중 5 %만이 FDA가 승인 한 치료법을 가지고 있습니다6. 간 IMD에 대한 새로운 치료법이 절실히 필요하다는 것은 분명합니다. 그러나 새로운 치료 옵션을 개발하기 위해서는 적절한 질병 모델이 필요합니다.
시험관 내 및 생체 내 시스템을 사용하여 인간 질병을 모델링하는 것은 효과적인 치료법을 개발하고 간 IMD의 병리학을 연구하는 데 장애물로 남아 있습니다. 희귀 간 질환 환자의 간세포는7을 얻기가 어렵습니다. 동물 모델은 질병 병리학에 대한 이해를 개발하고 치료 전략을 테스트하는 데 중요합니다. 그러나 한 가지 장애물은 치명적인 돌연변이를 가진 배아에서 모델을 생성하는 것입니다. 예를 들어, Jag1 유전자의 5'-말단 근처에서 5 kb 서열의 동형접합성 결실을 포함하는 배아를 갖는 알라길 증후군 (ALGS)의 마우스 모델을 생성하려는 시도는 배아8의 조기 사망을 초래하였다. 또한, 배아 줄기 세포에서 유전자 편집에 의해 마우스 모델을 생성하는 것은 시간-집약적 및 자원-집약적일 수 있다9. 마지막으로, 돌연변이는 표적 조직 외부에 나타나 질병의 연구를 방해 할 수있는 혼란스러운 변수로 이어질 것입니다9. 체세포 유전자 편집은 간 조직에서 더 쉽게 편집 할 수있게하고 배아 줄기 세포를 사용하여 모델을 생성하는 것과 관련된 문제를 우회합니다.
전기천공은 세포막에 침투하기 위해 고전압 전류를 인가함으로써 CRISPR-Cas9를 핵으로 직접 전달할 수 있게 해주며, 인간 배아줄기세포, 다능성 줄기세포 및 뉴런 10,11,12와 같은 형질감염 기술에 비타협적인 것을 포함한 많은 세포 유형과 양립할 수 있다10,11,12 . 그러나, 낮은 생존력은 전기천공의 잠재적인 단점이다; 절차를 최적화하면 독성을 제한하면서 높은 수준의 전달을 얻을 수 있습니다13. 최근의 연구는 CRISPR-Cas9 성분을 일차 마우스 및 인간 간세포로 전기천공하는 것이 매우 효율적인 접근법으로서 실현 가능성을 입증한다14. 간세포에서의 생체외 전기천공은 간세포의 인간 IMDs에 대한 새로운 마우스 모델을 생성하는데 적용될 수 있는 잠재력을 갖는다.
이 프로토콜은 마우스 간세포를 간세포로부터 단리하고 이어서 Cas9 단백질 및 합성 단일 가이드 RNA (sgRNA) 또는 sgRNA와 결합 된 Cas9 mRNA로 구성된 RNP 복합체로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 높은 수준의 표적 유전자 편집을 얻기 위한 상세한 단계별 절차를 제공합니다. 또한, 이 프로토콜은 갓 분리된 마우스 간세포로의 CRISPR-Cas9의 전기천공에 따른 유전자 편집 효율, 생존력 및 기능성을 정량화하는 방법을 제공한다.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE 스트립, 부착된 투명 플랫 캡, natural</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>6-well Collagen Plates</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5073</td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>All-in-one Fluorescent Microscope</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>아날로그 보텍스 믹서</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>ART 와이드 보어 필터링 팁 1,000 &마이크로; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>자동 세포 계수기</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>블루 왁스 해부 트레이</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>DTW1</td><td>9" x 6.5" x 1/2"+F21</td></tr><tr><td>셀 스크레이퍼/리프터</td><td>Argos Technologies</td><td>UX-04396-53</td><td>비발열성, 멸균</td></tr><tr><td>원뿔형 튜브(15mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>원뿔형 튜브(50mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>면 어플리케이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-170</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 가위</td><td>Cooper Surgical</td><td>62131</td><td></td></tr><tr><td>일회용 페트리 접시</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>100mm, 멸균</td></tr><tr><td>일회용 Petri Dish</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td>35mm, 멸균</td></tr><tr><td>Epoch Microplate 분광 광도계</td><td>BioTek Instruments</td><td>250082</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell 스트레이너 (70 &micro; </td><td>피셔 사이언티픽</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>펜치</td><td>쿠퍼 수술</td>용 <td>61864</td><td>유로-메드 애드슨 티슈 펜치</td></tr><tr><td>IV 카테터&nbsp;</td><td>BD</td><td>382612</td><td>24 G x 0.75 in</td></tr><tr><td>IV 주입 세트</td><td>Baxter</td><td>2C6401</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 12 미니 원심분리기</td><td>벤치마크 Scientific</td><td>1220P38</td><td></td></tr><tr><td>바늘</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-20</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Device</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Program T-028은 마우스 간세포 연동 펌프의 전기천공에 사용되었습니다</td></tr>.<tr><td></td><td>마스터플렉스</td><td>&nbsp; HV-77120-42</td><td>10 - 60 rpm; 90 - 260 VAC</td></tr><tr><td>정밀 펌프 튜빙</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-14</td><td>25 ft,</td></tr><tr><td>실리콘 Primaria 배양 플레이트</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353846</td><td>질소 함유 조직 배양 플레이트</td></tr><tr><td>혈청학 피펫 (25 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-604</td><td></td></tr><tr><td>주사기</td><td>BD</td><td>329464</td><td>1 mL, 멸균</td></tr><tr><td>T100 Thermal Cycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>ALT</td><td>27577</td><td>Thermo Scientific 정밀 마이크로프로세서 제어 280 시리즈, 2.5 L</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9959336</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7606-100</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap&nbsp; EGFP mRNA</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7201-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrix</td><td>Corning Life Sciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885076</td><td>저포도당, 피루브산</td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>VWR</td><td>71001-652</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Thermoscientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>간세포 유지 관리 중간 (MM)</td><td>Lonza</td><td>MM250</td><td></td></tr><tr><td>간세포 도금 중간 (PM)</td><td>Lonza</td><td>MP100</td><td></td></tr><tr><td>마우스 알부민 ELISA 키트</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0010653</td><td></td></tr><tr><td>마우스/쥐 간세포 핵세포 키트</td><td>Lonza</td><td>VPL-1004</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq 핫스타트 DNA 중합효소</td><td>New England Biolabs</td><td>M0481L</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x pH 7.4&nbsp;</td><td>Thermoscientific</td><td>70011-044</td><td>칼슘 또는 염화마그네슘 없음</td></tr><tr><td>Percoll (PVP solution)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-500790A</td><td></td></tr><tr><td>Periodic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7875-25G</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>VWR</td><td>100496-550</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract DNA Extraction Solution</td><td>Lucigen Corporation</td><td>QE05090</td><td></td></tr><tr><td>쉬프' s 푹신-아황산염 시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>Phenol red</td></tr><tr><td>Vybrant MTT 세포 생존력 분석</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Solution 1 (pH 7.4, 필터 멸균)&nbsp; </td><td></td><td></td><td>4°C에서 안정적입니다. C 2 개월 동안</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14155063</td><td>200 mL</td></tr><tr><td>EGTA (0.5 M)</td><td>에 완료 Bioworld</td><td>40520008-1</td><td>200 &micro; L</td></tr><tr><td>HEPES (pH 7.3, 1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td><강>관류 용액 2 (pH 7.4, 필터 멸균)&nbsp; </td><td></td><td></td><td>4°C에서 안정적입니다. C 2개월 동안</td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H20 (1.8 mM)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>360 &마이크로; 1M 재고의 L&nbsp;</td></tr><tr><td>EBSS (칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-155-063</td><td>Complete to 200 mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp;</td></tr><tr><td>MgSO4&미드닷; 7H20 (0.8 mM)</td><td>시그마</td><td>30391-25G</td><td>160 &마이크로; 1M 스톡의 L</td></tr><tr><td><강력>관류 솔루션 3&nbsp; </td><td></td><td></td><td>사용 전에 신선하게 준비됨</td></tr><tr><td>Solution 2</td><td></td><td></td><td>50</td></tr><tr><td>mL Liberase</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>0.094 Wunsch units/mL</td></tr><tr><td>Mouse Anesthetic Cocktail&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acepromzine</td><td></td><td></td><td>0.25 mg/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>케타민</td><td></td><td></td><td>7.5 mg/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td></td><td></td><td>1.5 mg/mL 최종 농도</td></tr><tr><td>Software</td><td>URL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchling</td><td>https://www.benchling.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>TIDE: 분해 https://tide.nki.nl/</td><td></td><td></td><td></td> 에 의한 Indels 추적</tr></tbody></table>

갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 cas9 리보뉴클레오단백질 및 mrna의 전기천공-매개 전달

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

이 프로토콜은 원발성 마우스 간세포를 단리하기 위한 빠르고 효과적인 방법에 이어 리보뉴클레오단백질(RNPs) 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9의 전기천공 매개 전달을 기술한다. 일차 마우스 간세포는 3단계 역행 관류 방법을 사용하여 분리하여 간 당 최대 50 × 10,6 세포의 높은 수율과 >85%의 세포 생존율을 초래하였다. 이 프로토콜은 간세포를 플레이팅, 염색 및 배양하기 위한 상세한 지침을 제공합니다. 결과는 전기천공이 녹색 형광 단백질(GFP) 양성 세포의 백분율로 측정되는 89%의 높은 형질감염 효율과 마우스 간세포에서 >35%의 겸손한 세포 생존율을 제공한다는 것을 나타낸다.
이러한 접근법의 유용성을 입증하기 위해, 하이드록시페닐피루베이트 디옥시게나제 유전자를 표적화하는 CRISPR-Cas9를 원발성 마우스 간세포 내로 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환(IMD)과 관련된 치료 유전자를 교란시키는 원리 증명 유전자 편집으로서 하였다. mRNA를 사용한 47% 편집 효율에 비해 RNP에 대해 78%의 더 높은 온-타겟 편집이 관찰되었다. 간세포의 기능성은 RNP 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전달하는 것이 원발성 마우스 간세포에서 필적할만한 세포 생존율을 초래한다는 것을 나타내는 알부민 검정을 사용하여 시험관내에서 평가되었다. 이 프로토콜에 대한 유망한 응용 프로그램은 간에 영향을 미치는 인간 유전 질환에 대한 마우스 모델의 생성입니다.

간에서 도금 가능한 원발성 간세포의 분리 간 관류 및 간세포 분리의 전체 과정은 도 1에 예시되어 있다. 본 실험에서는 야생형, 8-10주령의 C57BL6/6J 마우스를 사용하였다. 이 절차는 85 %와 95 % 사이× 생존력을 가진 마우스 당 106 세포에 대해 20-50을 산출 할 것으로 예상됩니다. 생존율이 &lt;70 %이면 죽은 세포를 제거하기 위해 퍼콜 치료를 따라야합니다. 갓 분리된 간세포는 콜라겐 I 코팅 또는 질소 함유 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅되어야 한다. 도금 후 3-12시간 이내에, 간세포는 플레이트에 부착될 것으로 예상되며, 세포 형태학은 24시간 이내에 전형적인 다각형 또는 육각형 외관을 가정한다(도 2). 간세포는 글리코겐 형태로 포도당을 저장하는 간에서 유일한 세포입니다. 분리된 세포의 순도를 검증하기 위해, 글리코겐 염색은 도금 후...

이 프로토콜은 간으로부터 원발성 마우스 간세포를 단리하고 리보뉴클레오단백질 및 mRNA로서 CRISPR-Cas9를 전기천공하여 간장의 유전된 대사성 질환과 관련된 치료적 표적 유전자를 교란시키는 기술을 기술한다. 기술된 방법은 전기천공 후 높은 생존력과 높은 수준의 유전자 변형을 초래한다.

갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA의 전기천공-매개 전달

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

우리 기술의 주요 장점은 시험관 내 및 생체 내 질병 모델을 생성하는 방법으로 일차 마우스 간세포에서 유전자를 편집하기 위한 쉽고 빠르며 재현 가능한 접근 방식이라는 것입니다. 우리의 기술을 사용하면 분리된 간세포에서 표적 유전자를 녹다운한 다음 환자에게 다시 이식하여 병든 세포를 유전자 편집 간세포로 대체할 수 있습니다. 경험이 부족한 연구원은 캐뉼러와 관류 내내 카테터를 안정적으로 유지하는 데 어려움을 겪을 수 있습니다. 사용자는 시작하기 전에 절차와 문제 해결 방법을주의 깊게 읽고 연습하는 것이 좋습니다.간 관류 및 간세포 분리를 시연하는 것은 임상 시설 관리자 인 Tina Parker와 대학원 연구 조교 인 Ilayda Ates입니다. 전기 천공 절차는 내 실험실의 대학원 연구 조교 인 Callie Stuart가 시연 할 것입니다. 마취의 수술 평면에서.가위를 사용하여 복부 피부에 U 자형 측면 절개를하여 간 관류를 시작하고 측면을 통해 구멍을 확장하십시오. 흉곽에 피부를 계속 엽니 다. 가위를 사용하여 복막을 잘라 복강을 흉곽까지 노출시킵니다.장기에 흠집이 생기지 않도록주의하십시오. 집게의 뒷면이나 가위의 무딘 표면을 사용하여 내장을 오른쪽으로 움직입니다. 문맥과 하대 정맥을 확인하십시오.펌프를 시작하여 카테터를 통해 예열된 관류 용액을 세척합니다. 펌프를 멈추고 카테터를 제거하십시오. 그런 다음 카테터에 연결된 바늘 끝을 정맥과 10-20도 각도로 하대 정맥에 삽입하고 카테터에서 바늘을 제거합니다.그런 다음 정맥과 평행 한 움직임으로 카테터를 정맥에 부드럽게 밀어 넣습니다. 카테터를 정맥으로 더 이상 이동시키지 않고 튜브를 카테터에 연결하십시오. 분당 2 밀리리터의 유속으로 펌프를 시동하십시오.관류가 성공했다는 신호로 간이 즉시 창백 해지는 것을 찾으십시오. 가위를 사용하여 문맥을 자릅니다. 점차적으로 유속을 분당 5 밀리리터로 증가시킵니다.관류 용액 3이 흐르면 간의 탄력성을 주의 깊게 모니터링한다. 간이 부드러워 졌는지 확인하려면 면봉이나 집게로 간을 부드럽게 누르고 간장에 들여 쓰기가 형성되는지 확인하십시오. 세포 생존력의 손실을 피하기 위해 과도하게 관류하지 않도록주의하십시오.30 내지 50 밀리리터의 관류 용액이 3 번 흘렀을 때 간이 부드러워지면 펌프를 멈추고 카테터와 담낭을 제거합니다. 내용물을 흘리지 않도록주의하십시오. 그런 다음 조심스럽게 간을 해부하십시오.간을 100 % FBS 배지

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

microelectrode 배열 (MEA)를 사용하여 자기편 포유류의 세포 배양에 siRNA의 스크램블 시퀀스의 특정 사이트 transfection에 대한 기사 내용은 프로토콜.

Microelectrode 배열을 사용하여 siRNA와 자기편 세포의 높은 효율, 특정 사이트 Transfection (MEA)

유체역학 꼬리 정 맥 주입 transposon 기반 통합 벡터의 수 murine hepatocytes의 안정 되어 있는 transfection vivo에서. 여기, 우리는 단일 transgene의 장기 제정 식 또는 결합 된 제정 및 doxycycline 유도할 수 있는 표현의 transgene 또는 간에서 미르 shRNA 있도록 transfection 시스템을 위한 실용적인 프로토콜 제시.

유체역학 꼬리 정 맥 주입을 사용 하 여 마우스 Hepatocytes의 유전 Vivo에서 수정에 대 한 제정 및 유도할 수 있는 시스템

클러스터는 정기적으로 짧은 구조 반복/CRISPR 관련 된 단백질 9 (CRISPR/Cas9) interspaced 시스템 유전 공학에 대 한 유망한 도구를 제공 하 고 transgenes 대상된 통합의 가능성을 엽니다. (HMEJ)에 가입 하는 homology 중재 끝 설명-효율적인 DNA 비보에 통합 대상 및 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 유전자 치료를 대상으로 전략을 기반으로.

CRISPR/Cas9-중재 대상된 통합에서 Vivo에서 Homology 중재 끝에 합류 기반 전략을 사용 하 여

프로토콜에 대 한 빠른 마우스에서 유전자 장애 CRISPR/Cas9-중재 하 고 인간의 기본 조 혈 모 세포가이 문서에서 설명 하는. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins sgRNAs 녹음 방송 생체 외에서 그리고 상업적인 Cas9를 통해 생성 된 electroporation 통해 소개 된다. 높은 편집 효율성 제한 시간 및 금융 비용으로 달성 된다.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

여기, 우리는 건강 하 고 기능적인 기본 마우스 hepatocytes의 격리에 대 한 프로토콜을 제시. 비 방사성 라벨 기판 간 초기 단백질 합성을 탐지 하기 위한 지침에에서 에너지 대사 항상성의 맥락에서 단백질 합성을 기본 메커니즘을 이해할 수 있도록 제공 되었다.

비 방사성 L-azidohomoalanine 라벨 방법에 의해 초기 단백질 합성 분석에 대 한 기본 마우스 Hepatocytes의 절연

여기에 제시된 것은 튜브 전기포공을 이용한 포유류 세포에서 효율적인 CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질 매개 유전자 편집을 위한 프로토콜이다.

CRISPR/Cas9 리보뉴클레오단백질-튜브 전기포공에 의한 정밀 유전자 편집

리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.

마우스 간에서 세포 유형 별 유전자 발현 프로파일링

여기에 제시된 단세포 전기기화는 체외 해마 슬라이스 배양 연령의 범위에 걸쳐 흥분성 및 억제 뉴런 모두에서 유전자를 전달할 수 있는 프로토콜입니다. 우리의 접근은 개별 적인 세포에 있는 유전자의 정확하고 능률적인 발현을 제공합니다, 세포 자율및 세포 간 기능을 검토하기 위하여 이용될 수 있는.

마우스 해마 흥분및 직업 별 억제 신경의 다른 organotypic 슬라이스 문화에 걸쳐 단세포 전기화

이 프로토콜은 시험관내에서 조립되고 전기천공법으로 전달되는 Cas9-sgRNA 리보핵단백질 복합체를 사용하여 마우스 골수 유래 대식세포에서 게놈 편집 절차를 설명합니다.

전기천공된 Cas9-sgRNA 복합체를 사용한 일차 골수 유래 대식세포의 고효율 유전자 파괴

이 프로토콜은 디지털 마이크로유체 전공 플랫폼인 'DMF-ection'을 사용하여 원차 인간 T 세포에서 TCRα/β 수용체의 소형화된 CRISPR–Cas9 유전체 편집을 설명합니다. 이 방법은 병렬, 저입력 유전자 편집을 높은 생존율로 가능하게 하며, 다세포 3D 구형체에 mRNA 전달에도 추가적으로 적응할 수 있습니다.

현탁 T 세포 및 3D 세포 모델에서 저입력 CRISPR 유전체 편집 및 mRNA 트랜스펙션을 위한 디지털 마이크로유체 전기천공 플랫폼

배우세요 CRISPR-Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA를 일차 마우스 간세포에 전기천공으로 전달하는 방법을. 이 기술은 대사성 간 질환의 유전자 편집 및 세포 치료 연구에 활용됩니다.

갓 분리된 일차 마우스 간세포로의 Cas9 리보뉴클레오단백질 및 mRNA의 전기천공-매개 전달

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