Name: 대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T14:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: 배우세요 대사 표지 및 질량 분광법을 사용하여 노화 및 비분할 배양된 세포에서 단백질 회전율을 측정하는 방법을. 이 기술은 세포 노화와 신경퇴행성 질환 연구에 단백질 동역학에 대한 통찰을 제공합니다.

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이 연구는 NIH (National Institutes of Health)와 IRP (Intramural Research Program), National Institute on Aging (NIA)의 지원을 받았습니다. N.B.는 Longevity Impetus Grants와 Office of Dietary Supplements (ODS) Scholars Program의 지원을 받았습니다. 그림 1은 BioRender.com 로 작성되었습니다.

저자는 공개가 없습니다.

pSILAC는 여러 세포 조건에서 단백질 회전율의 글로벌 정량화를 가능하게 하는 강력한 기술입니다. 이 논문은 노화 및 정동작 세포의 준비, SILAC 라벨링 및 수확, 궁극적으로 DDA 질량 분광법을 사용한 분석을 포함하여 노화 및 정지 세포 사이의 글로벌 단백질 반감기를 비교하기 위해 pSILAC의 사용에 대해 자세히 설명합니다. 추가적으로, 노화 관련 단백질을 코딩하는 mRNA의 패널의 SA-βGal 및 RT-qPCR 분석을 사용하여 노화 표현형의 검증을 위한 두 단계 검정이 기술된다. 기술된 두 가지 접근법을 통한 노화의 검증 외에도, 프로테오믹 수준에서 노화 및 정지 세포 사이의 공지된 노화 마커의 변화를 조사함으로써 질량 분광법 분석에 이어 노화의 세 번째 검증을 수행할 수 있다. 상승될 것으로 예상되는 노화-관련 단백질은 p16, p21, 및 BCL2를 포함하며, 다른 것들 중에서도, 다른 곳에서 기술된44,45. 상기 기술된 프로토콜에서, 이온화 방사선은 정지 세포에 대한 노화 및 혈청 기아의 유도를 위해 사용되었다. 노화의 유도를 위해, 이용 가능한 여러 가지 옵션이 있으며, 그들 중 실질적인 이질성이41,42,46이다. 현재 "가장 생리적"으로 간주되는 노화 방법은 없으므로 노인성 유도제의 선택은 주로 실험의 맥락에 기반합니다. 그러나 노화에 대한 일반적인 현상을 진술하는 것을 목표로하는 실험은 적어도 두 개의 다른 노화 유도제를 사용하는 것이 좋습니다. 노화 패러다임의 범위를 논의하는 것은이 논문의 범위를 벗어나지 만, 노화를 유도하는 몇 가지 일반적인 방법에는 DNA 손상 유발 (IR, 독소루비신, 복제 고갈), 발암 단백질 발현 (HRAS, BRAF) 및 미토콘드리아 기능 파괴2가 포함됩니다.
노화 유도제의 선택 이외에, 대조군 세포의 선택은 똑같이 중요한 고려 사항이다. 노인성 세포는 정의에 따라 무기한 성장 정지하에 있으므로 다른 성장 정지 세포와의 비교가 종종 선택됩니다. pSILAC의 경우, 세포 주기 정지된 세포는 복제되지 않고 따라서 단백질 반감기 계산(47)에 사용하기가 더 쉽기 때문에 일반적으로 바람직하다. 그러나, 배양된 세포는 종종 일부 분열 세포를 보유할 것이기 때문에, 세포 주기 정지를 유도하기 위해 사용되는 방법들이 여전히 증식하고 있는 세포로부터의 오류를 최소화하기 위해 가능한 한 동질적인 반응으로서 생산을 정지시키는 것이 중요하다. pSILAC를 사용하여 사이클링 세포에 대한 단백질 분해 속도를 계산하려면 단백질이 딸 세포(27)로 희석되는 속도를 보상하기 위한 추가적인 계산이 필요하다. 그러나 정동작 성장 정지 자체는 합병증이없는 것은 아닙니다. 세포 주기 정지를 위한 두 가지 일반적인 방법이 있다: 혈청 박탈과 접촉 억제(48). 모든 세포가 접촉 억제를 통해 정지될 수 있는 것은 아니지만, 일부 섬유아세포는 배양49일의 며칠 후에 정지를 입증하는 것으로 나타났다. 이 방법은 노인성 세포의 비교에 더 일반적으로 사용되기 때문에 혈청 박탈을 사용했지만, 정확한 비교를 위해 노인 세포가 유사하게 혈청 박탈 될 것을 요구한다. 혈청은 mTOR 복합체를 활성화시키고, 따라서 혈청 박탈은 세포 주기 정지(50) 이외에 세포에 대한 몇 가지 하류 효과를 갖는다. 주목할 만하게, 노년기 세포는 혈청 박탈 또는 mTOR 억제시 감소된 SASP를 나타내는 것으로 나타났다51,52.
pSILAC에서 고려해야 할 또 다른 중요한 점은 테스트 할 시간 포인트의 수입니다. 이 프로토콜은 단일 시점 (경량 또는 무거운 표지의 3 일)에서 세포를 수집하여 결과 분석을 실질적으로 단순화합니다. 시점의 선택은 실험의 목적을 기반으로해야합니다. 글로벌 분석의 경우 3 일 동안 대부분의 단백질을 포획 할 것으로 예상되지만 3 일 이내에 완전히 회전하는 단기 단백질의 반감기 (모든 빛 신호가 손실됨)는이 시점에서 측정 할 수 없습니다. 반대로, 3 일 동안 회전율이 거의없는 수명이 긴 단백질은 정량화하기가 어렵고 종종 매우 큰 반감기 (주 순서로)를 갖는 것으로 나타나며, 이는 일반적으로 매우 적은 신호 축적의 결과 일뿐입니다. 더 짧고 긴 시점에서, 새로 합성된 단백질의 백분율 대 무거운 펩티드 및 경질 펩티드 신호의 비율에서의 비선형 관계로 인해, 반감기의 정량화는 추가적인 라벨링 시점들을 추가함으로써 개선될 수 있었다. 이 프로토콜에서와 같이 두 세포 상태 간의 상대적 비교를 위해, 대략적인 반감기로 충분할 수 있지만, 정량적 정확도를 향상시키기 위해 추가적인 시간점을 사용할 수 있다.
이 프로토콜은 단백질 회전율의 비표적 DDA 기반 분석을 수행하는 방법을 설명합니다. 그러나, 단백질 턴오버 계산은 일반적으로 무겁고 가벼운 펩티드 쌍의 상대적 풍부도를 유도할 수 있는 임의의 획득 스킴에 적용될 수 있다. 예를 들어, 데이터 독립적 획득(DIA/SWATH)과 같은 MS2-기반 방법들이 또한 성공적으로 회전율(53)의 계산을 위해 적용될 수 있다. 추가적으로, 이 프로토콜에 기술된 것 이외의 계측 및 소프트웨어 파이프라인은 DDA 분석, 단백질 식별 및 단백질 정량화를 수행하는 데 사용될 수 있다. Skyline과 같은 단백질 정량 소프트웨어 플랫폼을 사용하여 펩티드 피크 영역을 추출하는 경우 문서 작업 공간에서 추출 된 이온 크로마토 그램을 수동으로 검사하고 잘못 통합 된 피크와 비 정량적 피크를 식별하고 그에 따라 문서를 큐레이팅하는 것이 좋습니다. 광범위한 튜토리얼 컬렉션은 스카이 라인 (skyline.ms)에 대한 온라인으로 제공됩니다.
pSILAC는 우수한 멀티플렉싱(프로테옴 커버리지) 및 처리량으로 인해 배양된 세포에서 단백질 반감기의 글로벌 정량화를 위한 가장 이상적인 방법 중 하나를 나타낸다. pSILAC는 합성 또는 분해의 직접적인 속도를 제공하지 않지만, 가볍고 무거운 신호의 변화는 인자의 합류로 인한 것이기 때문에, pSILAC는 조건과 상이한 세포 유형 사이의 비교에 매우 유용하다. 낮은 처리량 방법은 종종 두 가지 유형으로 나뉩니다 : 1) 사이클로헥시미드로 세포를 처리하여 부패를 모니터링하기 위해 첨가 후 시간 간격으로 단백질 합성 및 수확을 차단하거나, 2) 단백질 붕괴 억제제로 세포를 처리하고 단백질 축적을 모니터링하여 단백질 붕괴율을 추론합니다. 두 방법의 한계는 그러한 치료가 필연적으로 세포 생리학에 상당한 변화를 일으킬 것이라는 것입니다. 대조적으로, pSILAC는 실질적인 개입을 필요로하지 않으며 동위원소 아미노산이 그들의 비 동위원소 대응물과 단 하나의 중성자에 의해서만 다르기 때문에 이론적으로 세포 생리학에 검출 가능한 영향을 미치지 않습니다. 따라서, pSILAC에 대해 여기에 기술된 방법은 비분할 세포에서 가장 생리적인 단백질 반감기의 글로벌 측정을 위한 간단한 프로토콜을 나타낸다.
단백질 회전율의 변화는 노화, 연령 관련 질병, 신경 변성 및 장수54,55와 밀접한 관련이 있습니다. 이 프로토콜은 노화 세포에서 단백질 회전율을 측정하기 위해 세포 배양물에서 아미노산의 안정한 동위원소 표지를 사용하여 이러한 관계를 조사하는 방법을 설명합니다. 그러나, 마우스와 같은 전체 유기체에서 생체 내에서 노화 및 신경 변성의 맥락에서 연구를 수행하기 위해 수많은 유사한 방법이 존재한다. 실제로,이 연구는 연령 관련 질병 56,57,58,59의 맥락에서 단백질 회전율을 측정하는 것이 중요하다는 것을 강조했습니다.
이 연구에서, 소포체에 상주하는 리보솜 단백질과 단백질은 각각 노년기 세포에서 반감기가 감소하고 증가한 두 가지 범주의 단백질로 두드러졌다. 확실한 결론을 내리기 위해서는 정상 상태 수준의 추가 분석이 필요하지만, 이러한 결과는 노쇠한 세포가 리보솜 단백질의 반감기 감소를 통해 번역을 고유하게 조절할 수 있음을 시사합니다. 앞으로, 마우스 모델 에서 생체 내에서 세포 노화와 신경변성 사이의 관계를 연구하기 위해 안정한 동위원소 표지 접근법을 적용하는 것은 이러한 프로토콜에 의해 설명된 동위원소 표지 접근법의 유망한 확장이 될 것이다.

노화는 먼저 복제 고갈에 도달한 후 배양된 일차 세포에 의해 나타나는 무기한 성장 정지 상태로서확인되었다 1. 그 이후로 노화는 유전 독성, 미토콘드리아 및 발암 유발 스트레스를 포함한 수많은 세포 모욕에 대한 반응으로 발생할 수 있음이 밝혀졌습니다2. 노화 는 종양 억제 및 상처 치유와 같은 몇 가지 생리학적으로 중요한 역할을 하지만, 노화 동안 노화 세포의 축적은 여러 신경 퇴행성 상태4,5,6를포함하여 건강에 해로운 영향을 미치는 호스트와 관련이 있습니다3. 세포 노화 는 뉴런 7,8,9,10, 성상세포(11), 미세아교세포(12), 및 희소돌기아교세포 전구체(13)를 포함하는 다수의 뇌 세포 유형에서 발생하며, 신경변성 및 인지 기능 장애에 기여한다. 알츠하이머 병 14의 특징 중 하나 인 아밀로이드 베타 올리고머는 신경 노화13,15,16을 가속화하는 것으로 나타났습니다. 노화 세포의 증가 된 유병률은 또한 파킨슨 병17, 특히 환경 스트레스 요인11,18에서 발생합니다. 중요하게도, 전임상 모델에서 노인성 세포의 선택적 제거는 수명을 연장하고 다수의 연령 관련 질환(3,5,12)을 완화시키고, 인지 결핍(8,11,12,13)을 개선시킨다. 따라서 노화 세포는 많은 연령 관련 상태의 치료를 위한 유망한 치료 표적으로서 등장하였다.
노화 세포의 해로운 효과의 대부분은 국소 염증, 혈관 형성, 세포외 기질의 파괴 및 주변 조직에서의 노화의 전파를 일으킬 수있는 노화 세포에 의해 분비되는 생리 활성 분자의 복잡한 혼합물 인 노화 관련 분비 표현형 (SASP)에 의해 유발됩니다 19,20,21 . SASP는 또한 세포 주기 정지 상태 동안 상당한 전사 및 번역 노력을 필요로 하기 때문에 노화의 흥미로운 생물학적 현상을 나타낸다. 실제로, 노년기 세포는 단백질 합성을 감소시켜야 하는 리보솜 생물발생 22,23,24의 감소를 나타내는 것으로 나타났다. 대신, 노화 세포는 일부 단백질, 특히 SASP 인자를 견고하게 번역하고 주변 조직25의 신진 대사에 영향을 미칩니다. 따라서, 영구적인 세포 주기 정지를 겪는 노화 세포가 어떻게 단백질 항상성을 계속 유지하면서 동시에 SASP 인자 및 다른 선택된 단백질을 견고하게 발현하는지를 이해하는 데 상당한 관심이 있다.
이 방법은 세포 배양물(pSILAC)에서 아미노산에 의한 질량 분광법 및 펄스 안정한 동위원소 표지를 사용하여 프로테옴 전체 규모로 노인성 세포에서 단백질의 반감기를 전역적으로 측정하는 방법을 설명합니다. 전통적인 SILAC에서, 배양된 세포는 단백질 풍부도의 하류 분석을 위해 아미노산의 무겁고 가벼운 비방사성 동위원소로 완전히 대사적으로 표지된다. 이 방법은 배양된 섬유아세포(26)의 SASP에서 풍부 변화를 포괄적으로 그리고 정량적으로 평가하기 위해 이전에 적용되었다. pSILAC에서, 세포는 가벼운 동위원소로 사전 표지된 다음, 하나 이상의 시간 간격으로 수확되는 무거운 동위원소의 펄스로 유사하게 대사적으로 표지된다. 기존의 경질 동위원소와 관련하여 무거운 동위원소의 혼입 속도는 상대적 단백질 회전율을 계산하는 데 사용됩니다. 일반적으로, 아르기닌 및 리신의 동위원소는 트립신이 이들 잔기에서 절단되기 때문에 사용된다; 따라서, 표준 소화로부터의 모든 펩티드는 잠재적으로 무거운 표지를 함유할 것이다. 무거운 라이신 또는 아르기닌의 존재 또는 부재에 의해서만 상이한 펩티드 쌍은 화학적으로 동일하며 질량 분광계에 의해 분화되고 정량화 될 수있다. 질량 분광분석법 분석 후, 펩티드는 생성된 펩티드 동위원소 표지의 존재 또는 부재에 기초하여 새롭게 합성되거나 기존에 존재하는 것으로 확인될 수 있다. 이어서, 단백질 턴오버 속도는 주어진 단백질에 대한 무거운 (13C-15N) 대 경량 (12C-14N) 펩티드의 비율을 지수 성장 또는 붕괴에 대한 운동 모델27,28에적합시킴으로써 결정될 수 있다. pSILAC는 단백질 회전율 29,30,31,32의 여러 비교에 사용되어 왔으며 현재 단백질 반감기 측정을위한 가장 포괄적이고 높은 처리량 방법입니다.
이 프로토콜은 배양물에서 유사하게 성장-정지된 정지 세포와 병행하여 노화 세포의 제조를 상세히 기술하고, 이어서 pSILAC로 대사 표지를 부착한다. 그런 다음 세포를 수확하고, 용해물로 균질화하고, 질량 분광법 수집 및 분석을 위해 처리한다. 질량 분광법에서 얻은 데이터는 스프레드 시트에서 수행 된 단일 시점 및 반감기 계산을 사용하는 단순화 된 정량적 방법을 사용하여 단백질 반감기를 결정하는 데 사용됩니다. 이 접근법을 사용하여, 단백질 반감기의 추정치는 단백질 합성 또는 턴오버의 차단제를 사용하는 프로토콜보다 교란되지 않은 세포 조건에 더 확실한 포괄적이고 정량적인 방식으로 측정될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>아세토니트릴(LC-MS 등급)</td><td>Grainger</td><td>AH015</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Bicarbonate</td><td>Millipore-Sigma</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic (100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15240062</td><td></td></tr><tr><td>BCA Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreotol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, 고포도당, HEPES</td><td>ThermoFisher</td><td>12430112</td><td></td></tr><tr><td>dNTP Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>R0191</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, 인증, 열 비활성화</td><td>ThermoFisher</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Formic Acid</td><td>Sigma</td><td>27001</td><td></td></tr><tr><td>Gammacel 40 Exactor</td><td>Best Theratronics</td><td></td><td>세포용 세슘 조사기</td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>요오드아세트아미드(IAA)</td><td>Sigma</td><td>I1149</td><td>감광성</td></tr><tr><td>IMR-90 일차 폐 섬유아세포</td><td>ATCC</td><td>CCL-186</td><td></td></tr><tr><td>iRT 키트(인덱스 머무름 시간)</td><td>Biognosys</td><td>Ki-3002-2</td><td>인덱스 머무름 시간 펩타이드 표준</td></tr>물 <tr><td>이소프로판올</td><td>ThermoFisher</td><td>423835000</td><td></td></tr><tr><td>마스코트</td><td>매트릭스 사이언</td><td>스Mascot Daemon 2.8</td><td>단백질체 데이터베이스 검색 소프트웨어</td></tr><tr><td>Maxima Reverse Transcritase (200 U/&micro; L)</td><td>ThermoFisher</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액(100x)</td><td>ThermoFisher</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>나노 LC 시스템</td><td>ThermoFisher</td><td>ULTIM3000RSLCNANO</td><td></td></tr><tr><td>Oasis HLB 고체상 추출 Cartirdges</td><td>Waters</td><td>186000383</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap 질량분석기</td><td>ThermoFisher</td><td>Q Exactive HF Orbitrap</td><td></td></tr><tr><td>페놀/클로로포름/이소아밀 알코올 (25:24:1), 100 mM EDTA, pH 8.0</td><td>ThermoFisher</td><td>327110025</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수(PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Pierce SILAC 단백질 정량 분석 키트(트립신) -DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>A33972</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Real-Time PCR 시스템</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>랜덤 헥사머 프라이머</td><td>ThermoFisher</td><td>SO142</td><td></td></tr><tr><td>노화 &베타;-갈락토시다아제 염색 키트</td><td>세포 신호</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Skyline</td><td>University of Washington</td><td>Skyline-Daily v21.2.1.424</td><td>무료 및 오픈 소스 qantiative 단백질체학 소프트웨어. </td></tr><tr><td>www.skyline.ms Sonicator 수조</td>에서 사용 가능 <td>Branson</td><td>CPX-952-516R</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 시약</td><td>ThermoFisher</td><td>15596018</td><td>텍스트에서 페놀이라고 함; 위험한</td></tr><tr><td>TRYPle Express</td><td>ThermoFisher</td><td>12605010</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin (시퀀싱 등급)</td><td>Promega</td><td>V5113</td><td></td></tr><tr><td>TURBO Dnase (2U/ uL)</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>요소</td><td>ThermoFisher</td><td>29700</td><td></td></tr><tr><td>물(LC-MS 등급)</td><td>Grainger</td><td>AH365</td><td></td></tr></tbody></table>

대사 표지 및 질량 분광법으로 노화 및 비분할 배양된 세포에서의 단백질 회전율 측정

Measurement of Protein Turnover Rates in Senescent and Non-Dividing Cultured Cells with Metabolic Labeling and Mass Spectrometry

중추 신경계에 노인 세포의 축적이 알츠하이머 및 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 장애에 기여한다는 증거가 있습니다. 세포 노화는 일반적으로 치명적이지 않은 스트레스에 대한 노출에 반응하여 발생하는 영구적 인 세포 주기 정지 상태입니다. 그러나, 다른 비분할 세포와 마찬가지로, 노년기 세포는 대사적으로 활성으로 남아 있으며, 독특한 전사 및 번역 요구와 세포내 및 분비된 프로테옴의 광범위한 변화를 필요로 하는 많은 기능을 수행한다. 노화 동안 단백질 합성과 붕괴율이 어떻게 변하는지 이해하면 세포 노화의 기본 메커니즘을 조명하고 노화 세포에 의해 악화 된 질병에 대한 잠재적 인 치료 방법을 찾을 수 있습니다. 이 논문은 질량 분광법과 조합하여 세포 배양물(pSILAC)에서 아미노산에 의한 펄스 안정한 동위원소 표지를 사용하여 비분할 세포에서 단백질 반감기의 프로테옴 스케일 평가 방법을 기술한다. pSILAC는 아미노산의 안정한 무거운 동위원소 함유 버전을 갖는 세포의 대사 표지를 포함한다. 현대 질량 분광법 접근법과 결합하여, pSILAC는 복잡한 혼합물에서 수백 또는 수천 개의 단백질의 단백질 회전율을 측정할 수 있게 합니다. 대사 표지 후, 단백질의 턴오버 역학은 질량 분광법에 의해 검출된 펩티드에서 무거운 동위원소의 상대적 농축에 기초하여 결정될 수 있다. 이 프로토콜에서는 노인성 섬유아세포 배양물 및 유사하게 정지된 정지 섬유아세포의 생성뿐만 아니라 예상되는 단백질 회전율의 커버리지를 최대화하는 단순화된 단일 시점 pSILAC 라벨링 시간 과정에 대한 워크플로우가 설명됩니다. 또한, pSILAC 질량 분광법 데이터의 분석 및 스프레드 시트를 사용하여 단백질 분해 속도의 사용자 친화적 인 계산을위한 파이프 라인이 제시됩니다. 이 프로토콜의 적용은 노화 세포를 넘어 뉴런과 같은 모든 비분할 배양 세포로 확장될 수 있다.

이 프로토콜은 pSILAC 및 최소 시점을 사용하여 노화 및 비분할, 정동작 대조군 세포 사이의 단백질 반감기를 전역적으로 비교하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 배양물에서 노화 및 정지 세포의 생성, 3 일 동안 아르기닌과 라이신의 안정한 동위원소를 가진 세포의 대사 표지, 질량 분광법에 의한 무겁고 가벼운 펩티드 동위원소의 상대적 풍부도를 정량화하고, 스프레드 시트 공식을 사용하여 단백질 반감기를 간단하고 접근 가능한 계산에 대해 자세히 설명합니다 (그림 1). 이 방법은 매우 유연하며 수많은 세포 유형 및 조건에 적응할 수 있습니다.
이 프로토콜에 대한 노화 세포 생성의 일환으로 노화 검증의 두 가지 방법이 사용됩니다 : 현미경으로 시각화 된 SA-βGal 양성 세포와 RT-qPCR 분석을 사용하여 정량화 된 노화 마커의 수준 증가. 노인성 마커의 측정은 유효한 것으로 간주되는 두 세포 집단의 비교를 위해 정지 세포와 노인성 세포 사이의 명확한 구별을 산출해야합니다. SA-βGal 활성의 경우, 노화 세포는 파란색으로 나타나야 하지만 정동작 대조군 세포는 색이 없거나 거의 나타나지 않아야 합니다(그림 2A). 이 분석은 양성, 청색 염색된 세포를 총 세포 수의 백분율로 계수한 다음, 정동작 대조군과 노인성 세포 사이의 백분율 양성률을 비교함으로써 정량화될 수 있다. 이 프로토콜이 두 세포 상태의 비교를 위해 동시에 수행되는 것이 중요합니다. SA-βGal 활성은 염색 용액의 pH에 의존하므로 결과는 분석마다 크게 다를 수 있으므로 정성적 측정으로 간주되어야합니다.
노화 마커의 RT-qPCR 분석은 대부분의 노화 모델에서 SASP 인자 (IL6, CXCL8, IL1B) 및 세포 주기 억제제 (CDKN2A / p16, CDKN1A / p21)를 코딩하는 mRNA의 높은 수준을 보여줍니다. 세포 유형, 배양 조건 및 노화 유도제 41,42에 기초하여 약간의 변동이 예상되지만, 대부분의 노화 세포는 정지 대조군 세포에 비해 IL6, CXCL8 및 CDKN1A/p21 mRNA의 5배 이상 더 높은 수준을 나타낸다; 반대로, 증식 마커를 코딩하는 LMNB1 및 PCNA mRNA의 수준은 정지 세포와 비교하여 노인성 세포에서 낮거나 부재해야 한다(도 2B). 종합하면, SA-βGal 양성의 상당한 비율 및 노화 관련 mRNA 마커의 패널의 예상되는 발현은 실험에서 노화의 유도를 확인하기에 충분하다.
질량 분광분석을위한 단백질 샘플 처리는 용액 내 소화 (2 일) 및 고체상 추출 (4-6 h)으로 구성됩니다. 표적화되지 않은 프로테오믹 분석을 수행하기 위해, 생성된 펩티드는 데이터 의존적 획득(DDA)을 이용한 LC-MS/MS 분석을 위해 제출된다. Orbitrap 기기에서는 질량 분광법 기기 소프트웨어 방법 편집기에서 DDA 방법을 지정할 수 있습니다. 본 연구에 사용된 질량분석기 설정은 도 3A에 도시되어 있다. 액체 크로마토그래피 설정은 방법 편집기 내에서 지정할 수도 있습니다. 이 연구를 위해, 유기 상 증가와 함께 90분 선형 구배(아세토니트릴)가 사용되었다(도 3B). 성공적인 획득 후, 총 이온 전류(TIC)는 방법의 선형 구배 부분 동안 강렬한 신호를 포함해야 한다(그림 3C). 이 프로토콜은 Orbitrap 장비의 예제 프로토콜을 설명하지만 단백질 반감기의 계산은 DDA 모드에서 수집 된 질량 분광계에서 얻은 데이터에 대해 수행 할 수 있으며 여러 유형의 장비 (예 : Orbitraps 및 비행 시간 계측기) 및 공급 업체에서 사용할 수 있습니다. 수집 설정은 사용 된 장비의 유형 및 구성에 따라 고유하며 질량 분광법 시설에서 제안하는 설정을 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 비 DDA 방법 (SRM, PRM, DIA)과도 호환되며, 무겁고 가벼운 피크에 대한 정량적 크로마토그래피 피크 영역을 원시 데이터 파일에서 추출하여 스프레드 시트 공식에 입력 할 수있는 한 가능합니다.
원시 질량 분광법 파일은 펩티드와 단백질을 식별하기 위해 사용 가능한 많은 프로테오믹 데이터베이스 검색 도구 중 하나를 사용하여 검색됩니다. 예를 들어,이 연구는 마스코트43 검색 엔진을 활용했습니다. 무겁고 가벼운 펩티드의 정량화를 위한 크로마토그래피 피크 영역을 얻기 위해, 데이터베이스 검색 결과는 스카이라인39,40과 같은 크로마토그래피 피크 영역을 할 수 있는 프로테오믹 소프트웨어로 임포트된다. 펩티드의 추출된 이온 크로마토그램(도 4)을 조사하면 무겁고 가벼운 펩티드 신호의 상대적 비율을 알 수 있을 것이다. 노화 세포에서 경질 펩티드 신호에 비해 무거운 펩티드 신호의 낮은 비율은 더 느린 단백질 턴오버 속도를 나타내고(도 4A), 빛에 비해 더 높은 무거운 펩티드 신호는 더 빠른 단백질 턴오버 속도를 나타낸다(도 4B). 표지되지 않은 샘플은 무거운 펩티드 신호가 거의 또는 전혀 나타나지 않아야 한다. 표지되지 않은 샘플에서 겉보기 무거운 펩티드 신호는 배경 잡음으로 간주되며 최종 계산 중에 뺄 것입니다. 모든 처리 및 라벨링 조건에 대한 가볍고 무거운 펩티드에 대한 크로마토그래피 피크 영역의 정량화는 단백질 회전율 및 통계 분석의 후속 계산을 위해 수출되어야 한다.
단일 시점 분석을 사용하여 단백질 반감기의 정량화를 수행하기가 간단하며 스프레드 시트에서 편리하게 수행 할 수 있습니다. 표 3에서, 질량 분광분석으로부터 확인된 695개의 단백질에 대한 반감기를 계산하였다. 샘플의 각 단백질에 대한 단백질 수준의 무겁고 가벼운 동위원소 풍부도 ( 1) Raw Data 시트에 대한 입력)에서 시작하여 백분율 무거운 동위 원소 (Ratio, R이라고 함)가 2) 비율 H |이라는 제목의 시트에서 자동으로 계산됩니다. H + L. 이 단계에서, 무거운 표지된 샘플로부터의 R은 비표지된 샘플로부터 R을 뺀 것에 의해 정규화되어 정동작 및 노화 삼중산물에 대한 최종 R을 생성한다. 표지되지 않은 샘플은 외인성으로 첨가 된 무거운 동위원소를 가져서는 안되기 때문에 배경 신호를 제거하는 데 사용됩니다. R로부터,kdeg (회전율)는 다음 공식을 사용하여 계산된다:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq01.jpg" style="margin: auto;">
반감기 (H, 일 단위)는 다음 공식을 사용하여 정동작 대조군 및 노인성 삼중항 ( 3) 반감기 (일)라는 제목의 시트)에서 각 단백질에 대해 결정된다.
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63835/63835eq02.jpg" style="margin: auto;">
그런 다음 이러한 반감기는 정동작 및 노화 삼중항 중에서 평균화되어 p-값뿐만 아니라 각 단백질에 대한 정동작 및 노화 평균 반감기를 생성합니다. 그런 다음 계산된 반감기가 음수인 값에 대해 필터링되며, 이는 가벼운 레이블이 지정된 셀(배경)의 무거운 신호가 헤비 레이블이 지정된 셀의 무거운 신호보다 클 때 발생합니다. 이 필터링은 841 개의 707 개의 단백질이 여기에 제시된 결과에 대해 유효한 반감기로 확인되었습니다.
반감기는 정지 대조군 세포 (log2FC )에 대한 노화의 로그 2 비율로보고되고 화산 플롯에 플롯됩니다 (그림 5). 예를 들어, 5) 분석 시트를 살펴보면, 응고 II 트롬빈 수용체(F2R) 단백질은 0.51일의 정동작 세포(컬럼 B)에서 반감기를 가지며, 1.07일의 노화 세포(컬럼 C)에서 반감기가 0.001의 p-값을 갖는 ∼1.06(컬럼 D)의 log2FC를 산출함을 알 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig01.jpg"> 그림 1: 노화 및 정동작 제어 셀에 대한 pSILAC 워크플로우 다이어그램. 인간 IMR-90 섬유아세포를 단백질 반감기의 비교를 위해 정동작(저혈청) 또는 노인성(IR) 세포 배양물을 제조하는데 사용하였다. 이어서, 세포를 3일 동안 동위원소 아르기닌 및 리신으로 SILAC 라이트 또는 SILAC 헤비 배지로 표지하였다. 용해물을 세포로부터 추출하고, 소화시키고, 탈염하고, 질량 분광법을 사용하여 분석하였다. 무거운 펩티드 및 경질 펩티드 동위원소 피크는 각각 새로 합성된 펩티드 및 기존에 상응한다. 반감기는 지수 붕괴에 대한 방정식을 사용하여 계산되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig02.jpg"> 그림 2: SA-βGal 및 RT-qPCR 분석을 사용하여 노인성 표현형의 검증. (A) Senescent 및 정동작 세포는 수확 시에 6-웰 플레이트에 재플레이팅되고 SA-βGal 염색 키트를 사용하여 SA-βGal에 대해 염색된다. 세포 몸의 파란색은 노화에 양성입니다. 이미지는 밝은 필드에서 10x 배율, 빨간색의 크기 마커로 채색됩니다. (b) 관련없는 실험에서 노화 세포 (적색)와 사이클링 세포 (회색)를 비교하는 RT-qPCR 분석. CDKN1A/p21, CXCL8 및 IL6 mRNA의 수준의 증가는 LMNB1 mRNA 수준의 감소와 마찬가지로 노화를 나타낸다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig03.jpg"> 그림 3: Q-Exactive HF 오비랩 질량분석기에서 pSILAC 배양물의 데이터 의존적 수집(DDA) 스캔 및 액체 크로마토그래피 구배를 위한 대표적인 방법. (A) pSILAC 실험에서 전체 세포 용해물의 데이터 의존적 분석을 위한 계측기 소프트웨어의 권장 기기 설정. (b) 액체 크로마토그래피 유동 구배 방법 설정의 예. 펩티드는 5% 내지 35% 완충액 B (0.2% 포름산 및 99.8% 아세토니트릴)의 범위의 90분 선형 구배에 걸쳐 용출되고, 이어서 80% 완충액 B로 10분 세척하고, 5% 완충액 B로 25분간 평형화시킨다. (C) 명시된 설정으로 획득된 IMR-90 섬유아세포 펩티드의 질량 분광분석법 획득의 대표적인 총 이온 크로마토그램(TIC). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig04.jpg"> 도 4: 노화 동안 변화된 턴오버를 갖는 펩티드의 대표적인 추출된 이온 크로마토그램 . (A) 노화 및 비노화 세포에서 단백질 DnaJ 상동체 B 구성원 11(DNAJB11)로부터의 펩티드 FQMTQEVVCDECPNVK++의 크로마토그래피 피크 영역. SILAC의 3일 후, 노화 세포는 경질 펩티드(적색)에 비해 무거운 동위원소 함유 펩티드(청색)의 피크 면적의 감소에 의해 나타난 바와 같이, 정동작(non-senescent) 세포와 비교하여 이 펩티드 내로 덜 무거운 동위원소를 통합하는데, 이는 이 펩티드가 노화 세포에서 턴오버를 감소시켰다는 것을 나타낸다. (b) 노화 및 비노화 세포에서 단백질 스플라이싱 인자 3a 서브유닛 1 (SF3A1)로부터의 펩티드 VQAQVIQETIVPK++의 크로마토그래피 피크 영역. SILAC의 3일 후, 노화 세포는 경질 펩티드(적색)에 비해 무거운 동위원소 함유 펩티드(청색)의 피크 면적의 감소에 의해 나타난 바와 같이, 정동작(non-senescent) 세포와 비교하여 이 펩티드 내로 더 높은 비율의 무거운 동위원소를 통합하는데, 이는 이 펩티드가 노화 세포에서 턴오버를 증가시켰다는 것을 나타낸다. 표지되지 않은 (Day 0) 조건은 예상한 바와 같이 두 펩티드 모두에 대한 무거운 동위원소의 혼입이 없음을 보여준다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63835/63835fig05.jpg"> 도 5: pSILAC 표지로부터 결정된 노화 및 정동작 세포에서의 단백질 반감기의 비교. (a) 확인된 695개의 단백질 각각에 대한 노화/대조군(quiescent)의 로그2 비율을 표시하는 화산 플롯; 이 실험에서, 경량 및 중질 라벨링 배지는 글루코스와 페놀 레드를 함유하지 않았다. (B) 정지 세포 대 노인성 세포에서 반감기가 가장 많이 증가하거나 감소한 상위 10개 단백질을 보여주는 표(각각 왼쪽 및 오른쪽). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/63835fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 이 프로토콜에 사용되는 미디어 및 버퍼. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%201-63835R1.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 이 프로토콜에 사용된 RT-qPCR 프라이머. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%202-63835R1.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 3: 단백질 반감기, 접이식 변화 및 t-테스트 계산을 위한 SILAC 분석 통합 문서. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63835/Table%203%20v3.xlsx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 펄스 SILAC를 사용한 노화 및 비분열 세포의 대사 표지, 비표적 질량 분석법 분석 및 단백질 반감기의 간소화된 계산을 위한 워크플로우를 설명합니다.

Mounting evidence has shown that the accumulation of senescent cells in the central nervous system contributes to neurodegenerative disorders such as ...

세포가 단백질 항상성을 유지하는 방법은 세포 스트레스와 노화의 맥락에서 잘 이해되지 않는다. 이 프로토콜에서 우리는 살아있는 세포에서 단백질 항상성의 핵심 구성 요소 인 단백질 회전율을 계산하는 간단하고 정확한 방법을 제공합니다. Pulse SILAC는 실험자에게 다른 방법보다 생물학적 시스템에 더 확실한 높은 처리량 방식으로 개별 단백질 및 전체 프로테옴에 대한 단백질 회전율을 측정 할 수있는 능력을 제공합니다.이 방법의 원리는 전체 유기체를 포함하여 대사적으로 표지 될 수있는 모든 시스템에 적용될 수 있습니다. 이 방법은 또한 세포 노화, 노화 및 신경 퇴행성 질환에 대한 통찰력으로 이어질 수 있습니다. 질량 분광법 분석은 세제와 같은 특정 화학 오염 물질에 매우 민감합니다.이 절차 전반에 걸쳐 LC-MS 등급 시약을 사용하여 고품질 데이터 수집을 보장하십시오. 세포의 대사 표지를 시작하려면, 노화 및 정지 세포의 세 플레이트 각각에 대한 배지를 30 밀리리터의 SILAC 라이트 배지로 교체하십시오. 별도로 세 개의 노년기 플레이트와 세 개의 정동작 플레이트의 매체를 30 밀리리터의 SILAC Heavy로 교체하십시오.배지를 변경하지 않고 사흘 동안 세포를 성장시킵니다. 배양 플레이트로부터 세포를 분리하기 위해, 미리 가온된 트립신 시약 5밀리리터를 각 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 섭씨 37도에서 5분 동안 인큐베이션한다. 나중에, 분리된 세포를 배양에 사용된 동일한 배지의 다섯 밀리리터에 10 밀리리터의 총 부피로 재현탁시킨다.다음으로, 세포를 얼음으로 옮기고 섭씨 네 도에서 300배 G에서 세포를 원심분리한다. 펠렛을 두 번 세척한 후, 세포를 다시 스핀다운하고, 펠렛을 150 마이크로리터의 갓 제조된 8몰우레아 및 50밀리몰 중탄산암모늄 용해 완충액에 재현탁시키기 전에 상층액을 제거하였다. 튜브의 내용물을 위아래로 피펫팅하여 혼합하십시오.단백질 샘플의 분취량 50 마이크로 그램을 새로운 튜브에 넣고 용해 버퍼로 샘플을 동일한 부피로 가져옵니다. 그런 다음 디티오트레이톨을 튜브에 20-밀리몰의 최종 농도로 첨가하고, 진탕하면서 샘플을 섭씨 37도에서 30분 동안 인큐베이션한다. 샘플을 실온에서 10분 동안 냉각시키도록 허용한 후 요오도아세트아미드를 최종 농도 40밀리몰로 첨가하고 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 인큐베이션한다.그런 다음 샘플을 50-밀리몰 암모늄 중탄산염 완충액으로 일몰 우레아 이하로 희석한다. 시작 단백질의 50 마이크로그램 또는 1:50 트립신에서 샘플 대 단백질 비율에 대해 트립신 1마이크로그램을 첨가한다. 샘플을 섭씨 37도에서 밤새 진탕 배양하여 단백질을 펩티드로 소화시킨다.다음날, 단백질 소화를 켄칭하기 위해 샘플의 1 % 부피에 포름산을 첨가하십시오. 샘플 정리를 위해 제조업체의 지침에 따라 각 샘플에 대해 하나의 추출 카트리지를 사용하여 진공 매니폴드에 고체상 추출 카트리지를 놓습니다. 추출 후, 펩티드 샘플을 진공 매니폴드로부터 제거하고, 이를 진공 농축기에서 완전히 건조시킨다.건조에는 약 세 시간이 걸립니다. 질량 분광법 또는 MS 분석을 위해, 펩티드 샘플을 마이크로리터 당 400 나노그램의 농도로 0.2%포름산 완충액에 재현탁시킨다. 펩티드를 재가용화시키려면, 샘플을 다섯 분 동안 혼합한다.그런 다음 수조 초음파 처리기에서 다섯 분 동안 초음파 처리하십시오. 이어서, 샘플을 원심분리하여 불용성 물질을 펠릿화하고, 펩티드 상청액을 MS 바이알 내로 옮긴다. 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 또는 LC-MS-MS를 사용하여 프로테오믹 분석을 위해 샘플을 제출한다.질량 분광법 시설에 의한 비표적 분석에 권장되는 설정을 사용합니다. 샘플을 분당 400 나노리터의 유속으로 분석 컬럼에 로딩하여 유기 및 무기 용매의 혼합물을 사용하여 90분 선형 구배에 걸쳐 펩티드를 용출시키고, 유기 용매는 5 ~ 35%범위의 질량 분광법 데이터를 수집하고, MS1 조사 스캔의 연속 사이클과 HCD 단편화를 통한 20개의 데이터 의존적 MS2 스캔을 통해 데이터 의존적 MS2 스캔을 획득한다. Proteome Quantitation 소프트웨어 도구에서 무겁고 가벼운 펩티드에 대한 펩티드 피크 영역을 정량화하십시오.이어서, 무겁고 가벼운 펩티드 피크 영역을 내보낸다. 단백질 반감기를 계산하려면 SILAC 분석 통합 문서를 Raw Data라는 첫 번째 시트에 열고 UniProt ID, 유전자 이름, 무겁고 가벼운 피크 영역을 표시된 열에 붙여 넣습니다. 그런 다음 Analysis라는 네 번째 시트를 열고 G 열과 H 열이 표본이 범위를 벗어났음을 나타내는 행을 제거하고 범위 내에서 읽은 행을 유지합니다.노화 표현형을 노화 관련 베타-갈락토시다제 활성 및 RT-qPCR 분석을 사용하여 검증하였다. 베타-갈락토시다제 활성의 경우, 노화 세포는 파란색으로 나타난 반면, 정지 대조군 세포는 전혀 또는 최소의 색을 가졌다. RT-qPCR 분석에서, 노화 세포는 정지 세포에 비해 더 높은 인터루킨-6, CXCL8 및 CDKN1A-P21 mRNA를 나타냈다.반대로, 증식 마커에 대한 라민 B1 인코딩의 수준은 노인성 세포에서 낮거나 결석하였다. 펩티드의 추출된 이온 크로마토그램은 무겁고 가벼운 펩티드 신호의 상대적 비율을 밝혀냈다. 경노화 세포에 비해 무거운 펩티드 신호의 낮은 비율은 더 느린 단백질 턴오버 속도를 나타냈고, 빛에 비해 더 높은 무거운 펩티드 신호는 더 빠른 단백질 턴오버 속도를 나타냈다.표지되지 않은 샘플은 무거운 펩티드 시그널을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 질량 분광분석으로부터 확인된 695개의 단백질에 대한 반감기가 계산되었다. 반감기는 정지 세포에 대한 노화의 로그 두 비율로보고되고 화산 플롯에 플롯됩니다.노화 세포에서 단백질 턴오버 속도의 계산에 이어서, 하류 분석은 프로테오스타시스 메카니즘에 의해 조절되는 후보 생물학적 경로를 밝혀낼 수 있다. Pulse SILAC는 연구자들이 전례 없는 세분성과 처리량으로 단백질 역학을 연구할 수 있는 길을 열었으며, 이를 통해 우리는 많은 개별 단백질에서 단백질 항상성의 변화를 연구할 수 있었습니다.

measurement-protein-turnover-rates-senescent-non-dividing-cultured

Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

이 비디오는 이중 노화 마커로 치료 유도 노화 암세포를 정량화하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 보여줍니다. 노화 세포의 검출 및 정량화에는 β-갈락토시다아제 기질을 사용하는 것이 포함됩니다. 기질은 노화 세포 내에서 활성 리소좀 β-갈락토시다아제에 의해 절단되어 자가형광 리포푸신 과립과 함께 노화 암세포를 표시하는 형광 생성물을 생성합니다.

therapy-induced senescent cancer cells의 유세포 분석 기반 정량화

노화가 방지하거나 종양 논란이 계속 추진할지 여부를 지정합니다. chemotherapeutical 마약 senesce하는 암 세포를 유도 할 수 있기 때문에, 노화를 연구하는 새로운 치료법을 제안 필수적이다. 그러나, 표준 및 널리 사용되는 β-갈 락토시다 분석은 주요 단점을 제공합니다. 우리는 여기에서 노화를 정량화 할 수있는 신속하고 민감한 유동 세포 계측법 기반 분석을 제안한다.

노화 암 세포를 정량화하는 민감한 방법

여기에서 우리는 완전히 15 N 표시 애기 장대 세포 배양 레이블의 혼합물에 따라 세제 저항하고 세제 용해 막에 식물 세포막의 분별과 생체 내에서 강력한 방법을 설명합니다. 절차는 시그널링 프로세스를 이해하기 위해, 비교 단백체 연구에 적용된다.

비교 단백체 분석을위한 신진 대사 라벨링 및 막 분별<em&gt; 애기 장대</em&gt; 서스펜션 세포 배양

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세포 노화, 세포주기 정지의 비가역적인 상태는 다양한 세포 스트레스에 의해 유도 될 수있다. 여기, 우리는 노화의 마커를 평가하기 위해 세포 노화 및 방법을 유도 프로토콜을 설명합니다.

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이 프로토콜에서는 단백질 반감기 하나의 살아있는 부착 세포, 펄스 라벨 및 스냅인 태그 융해 단백질의 형광 시간 경과 이미징 사용 하 여 결정 하는 방법을 설명 합니다.

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인간 섬유아세포의 세포 노화 정량 평가를 위한 LysoTracker를 이용한 리소좀 프로파일링

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