Name: 산호 식민지에서 폴립 구제 금융을 유도하여 실험실 실험 사용을위한 개별화 된 미세 전파를 얻습니다. (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 배우세요 산호 폴립 구제 유도를 통한 미세전파 기법으로, 고염분 및 무칼슘 해수 처리를 활용하여 개별 폴립을 분리하고 생존율을 극대화하는 방법을 익히세요. 이 프로토콜은 산호 생리학 및 환경 스트레스 연구에 활용됩니다.

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우리는 산호 폴립의 실험과 모니터링에 대한 지원에 대한 Adam Barno와 Francisca Garcia에게 감사드립니다. 또한 수족관 유지 보수 및 인프라에 관한 도움을 주신 KAUST Coastal & Marine Resources Core Lab에 감사드립니다. 이 연구는 KAUST 보조금 번호 BAS / 1 / 1095-01-01에 의해 자금을 지원했습니다.

본 연구를 위해, Pocillopora verrucosa 산호 종에 속하는 콜로니를 망치와 끌을 사용하여 다이빙함으로써 SCUBA에 의해 Al Fahal 암초 (22.305118 N; 38.964568 E)로부터 수집하였다. 식민지의 속은 형태학적으로 확인되었으며, 그 종은 홍해의 Pocillopora를 포함하여 이전에 발표 된 연구에 따라 P. verrucosa로 분류되었으며, 유전 적 관점에서 볼 때이 지역에 존재하는 종은 P. verrucosa39,40임을 나타냅니다. 알 파할 암초는 보호 된 환경 지역의 일부가 아니며 산호 수집을 위해 특별한 허가가 필요하지 않았습니다. 식민지는 파편화되고 폴립이 "구제 금융"되기 전에 한 달 동안 300 L 수족관에 보관되었습니다. 수족관을 두 개의 수족관 히터, 세 개의 펌프 및 두 개의 광원(재료 표 참조)으로 26°C에서 유지시키고, 12시간 광 사이클을 유지하였다. 수족관의 온도는 두 히터 각각을 온도 컨트롤러에 연결하여 유지되었습니다. 발광은 오전 6시에 시작하여 오후 6시에 끝나도록 프로그래밍되었으며, 230 μmol 광자 m-2 s-1로 오후 12시에 정점에 달하는 조도 곡선을 생성하였다.
1. 물 증발 후 높은 염분에 의한 폴립 구제 금융
참고 :이 방법은 Shapiro et al.25에서 채택되었습니다. Pocillopora verrucosa와 다른 종을 사용하는 경우, 절단 할 단편의 크기를 결정하기 전에 폴립의 크기를 고려해야합니다.
<ol><li>대각선 절단 펜치를 사용하여 산호 식민지에서 작은 조각 (길이 1cm 미만)을 자릅 니다 (재료 표 참조). 참고 : 사용중인 산호 종에 따라 절삭 공구를 조정하십시오. 대각선 펜치는 슬림 한 가지로 산호를 절단하는 데 유용합니다. 현재 연구에서, 각각의 치료에 대해 하나의 단편이 절단되었지만, 단편의 수와 크기는 원하는 폴립의 수에 따라 달라질 수 있다. 절단 된 조각의 크기는 증발 후 물의 깊이를 초과해서는 안되므로 산호는 과정이 완료된 후 물 속에 완전히 머물러 있어야합니다.</li>
	<li>절단 된 조각을 산호 식민지가 적응 된 바닷물 12 mL로 채워진 작은 페트리 접시에 넣으십시오. 이는 인공 해수(표 표 참조) 또는 여과된 바닷물을 단편화 전에 삽입된 산호 콜로니와 동일한 염분으로 여과할 수 있다. 참고 : 조각을 물로 완전히 덮는 것이 중요합니다. 페트리 접시에 담긴 12mL가 절단된 조각을 덮기에 충분하지 않은 경우, 용기와 부피를 적절하게 최적화하십시오. 본 연구에서, 이용된 물은 홍해로부터 수집되었고, 그것의 염도는 다중 파라미터 미터에 의해 측정된 40 PSU였다( 물질의 표 참조).</li>
	<li>물이 증발하고 염도가 점차 증가 할 수 있도록 주위 온도에서 ~ 24 시간 동안 플레이트를 열어 두십시오. 폴립 사이에서 조직 소화가 관찰 될 때, 단계 1.4로 진행하십시오. 참고 : 인큐베이션 시간이 지난 후에는 물의 염도가 처음보다 약 40 % 높아야하며 폴립은 골격에서 분리 될 준비가되어 있어야합니다.</li>
	<li>1 mL 전사 피펫을 사용하여 산호 조직에 가까운 부드러운 흐름을 만듭니다. 흐름은 골격에서 이미 주변 조직을 소화 한 폴립의 완전한 분리를 천천히 도울 것입니다. 참고: 피펫으로 물의 흐름이 생성될 때, 별도의 폴립 또는 폴립 그룹이 골격에서 플레이크로 떨어져 나와야 합니다. 흐린 물질이 대신 떨어지면 조직의 죽음이나 붕괴를 나타내며, 이는 산호가 너무 오래 또는 너무 스트레스가 많은 상태 (이 경우 높은 염분)에서 배양되었음을 의미합니다. 폴립을 분리하기 위해 부드러운 물의 흐름을 만드는 것이 매우 중요합니다.더 강한 흐름은 폴립에 물리적 손상을 줄 수 있습니다.</li>
	<li>페트리 접시의 물을 피펫을 사용하여 이소모틱 워터(단계 1.2와 동일한 물을 사용)로 천천히 교환한다. 10 분 동안 50 %의 물 교환은 폴립을 스트레스가없는 염분 상태로 다시 적응시키기에 충분합니다. 참고 : 홍해의 pocilloporid 종 Pocillopora verrucosa 의 산호 식민지가 사용됨에 따라이 독특한 환경의 산호가 구제 될 특정 조건을 결정하기 위해 테스트가 수행되었습니다. 대부분의 다른 암초 환경과 비교할 때 홍해의 높은 염분을 강조하는 것이 중요합니다.</li>
</ol>2. 높은 염분 바닷물 공급에 의한 폴립 구제 금융
참고 :이 방법은 Chuang et al.27에서 채택되었습니다.
<ol><li>염도 프로브로 측정하여 염도가 85 % 증가 할 때까지 해수에 NaCl을 첨가하여 염도가 높은 해수 3 L를 준비하십시오. 참고 : 현재 연구에서 홍해의 40 PSU 바닷물에서 74 PSU 고 염분 바닷물이 준비되었습니다.</li>
	<li>단계 1.1에 설명 된대로 산호의 작은 조각을 자릅니다.</li>
	<li>절단된 단편을 3 L의 등모성 해수(이 경우, 산호에 대한 비응력성 염도를 갖는 바닷물, 단계 1.2에서 사용된 것과 같음)로 채워진 10 L 용기에 넣고 연동 펌프에 연결한다( 재료 표 참조). 참고 : 산호 건강을보다 잘 유지하기 위해 온도 컨트롤러, 에어 펌프 및 조명을 추가하여 식민지가 이전에 노출 된 것과 동일한 수족관 조건을 시뮬레이션 할 수 있습니다. 본 작업에서의 인큐베이션 동안, 산호 단편을 26°C에서, 매일 12시간 광 사이클 하에 용기에 보관하였다. 물의 이동 및 온도의 균질화는 공기 펌프에 의해 유지되었다.</li>
	<li>산호 파편이 들어있는 용기에 2.1 단계에서 준비된 고 염분 해수로 연동 펌프를 사용하여 126 mL / h 속도로 24 시간 동안 채 웁니다. 약 40 %의 염분으로 총 3L의 물을 첨가하십시오. 참고 : 염도가 높은 물은 의도 한 염분에 도달 할 때까지 바닷물에 NaCl을 첨가하여 간단히 생성 할 수 있습니다.</li>
	<li>골격에서 폴립을 방출하기 위해 피펫으로 부드러운 물 흐름을 만듭니다 (1.4 단계).</li>
	<li>폴립이 함유되어 있는 물을 이소모틱 워터로 천천히 교환한다(단계 1.5.). 그런 다음 4 단계 또는 5 단계로 진행하십시오.</li>
</ol>3. 칼슘이없는 바닷물 배양에 의한 폴립 구제 금융
참고 :이 방법은 Pang et al.24에서 채택되었습니다.
<ol><li>탈이온수 1 L에 26.29 g의 NaCl, 0.872 g의 KCl, 2.16 g의 MgSO4, 11.94 g의 MgCl2,3.42 g의Na2SO4, 및 0.286 g의 NaHCO3 (물질표 참조)를 첨가하여 칼슘이 없는 인공 해수 (CaFSW) 용액을 준비한다. 참고 :이 솔루션은 40 PSU의 염분에 적응 된 산호에 더 적합하도록 이전 프로토콜에서 조정되었습니다. 다른 염분 조건에 적응 된 산호의 경우 동일한 비율의 소금을 사용하지만 사용중인 산호에 더 적합한 염분을 얻기 위해 용질의 총 질량을 조정하십시오.</li>
	<li>단계 1.1에 설명된 대로 산호의 작은 조각을 절단합니다.</li>
	<li>산호 조각을 이전에 제조된 CaFSW로 채워진 페트리 접시에 잠기고(단계 3.1.) 이를 3시간 동안 80rpm 회전 속도로 궤도 인큐베이터에서 인큐베이션한다. 참고 : 다시 말하지만, 조각을 물로 완전히 덮는 것이 중요합니다. 페트리 접시가 조각을 덮기에 충분하지 않은 경우 실험적 필요에 따라 용기와 부피를 최적화하십시오.</li>
	<li>파편을 페트리 접시 또는 40 PSU 인공 바닷물로 준비된 20 % 둘베코 변형 이글 미디어 (DMEM)와 100 mg / mL의 암피실린 용액 ( 재료 표 참조)으로 채워진 6 웰 플레이트로 옮깁니다. 단편을 26°C 및 80 rpm에서 인큐베이션하고, 폴립과 개별 폴립 사이에서 조직 소화가 관찰될 때까지 매일 배지를 교환하여 골격으로부터 분리를 시작한다. 참고 : 대부분의 경우, 조직 소화는이 배지에서 배양 후 20 시간 이내에 완료되며 교환이 필요하지 않습니다.</li>
	<li>폴립을 멸균 된 바닷물로 옮겨 피펫을 사용하여 초기 회복하십시오. 1시간 배양 후, 단계 4 또는 단계 5로 진행한다.</li>
</ol>4. 페트리 요리의 폴립 유지 보수
<ol><li>폴립이 스트레스가 없는 염분으로 여과된 바닷물로 되돌아오면, 입체현미경으로 섬모 흐름으로 인한 조직 무결성과 움직임을 관찰하여 실행 가능한 폴립을 선택하십시오.</li>
	<li>선택한 폴립을 유리 또는 플라스틱 페트리 접시에 넣고 페트리 접시를 플랑크톤 그물 (200 μm 메쉬 크기, 재료 표 참조)으로 덮어 폴립이 접시에서 멀리 떠 다니지 않도록하십시오. 참고: 메쉬 네트의 크기는 폴립의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 그물에는 폴립보다 작은 기공이 있어야하며 물 교환 및 빛 침투가 가능해야합니다.</li>
	<li>Petri 접시를 사용 된 산호 종에 적합한 조건으로 수족관 안에 넣으십시오. 참고: 본 연구에서, 조건은 26°C에서 40 PSU 여과된 바닷물 및 12 h 광 사이클이었다.</li>
	<li>적어도 일주일에 한 번 페트리 요리를 열어 물을 새롭게하고 요리를 청소하십시오. 이 단계는 독성 화합물을 국부적으로 방출하여 산호 폴립과 경쟁하거나 손상시킬 수있는 조류 과잉 성장을 제거하는 데 중요합니다.</li>
</ol>5. 인큐베이터의 폴립 유지 보수
<ol><li>단계 4.1에 설명된 대로 실행 가능한 폴립을 선택합니다.</li>
	<li>폴립을 전사 피펫을 사용하여 50 mL의 이소모틱 해수로 채워진 75cm2 표면 세포 플라스크에 넣는다. 참고 : 현재 작업에서는 홍해에서 수집 된 여과 된 바닷물이 폴립 유지 보수에 사용되었습니다. 단계 1.2에서 사용된 것과 동일한 특성을 갖는 물이 사용될 수 있다.</li>
	<li>플라스크를 닫고 인큐베이터로 옮깁니다. 인큐베이터를 26°C 및 40rpm에서 12시간 라이트 사이클로 설정합니다. 4 일마다 물 부피의 50 %를 교환하고 벽에 조류 또는 생물막이 가득 차면 내용물을 깨끗한 플라스크로 옮깁니다. 참고: 대표적인 결과를 위해 HD 카메라가 장착된 완전 아포크로마틱 줌 시스템( 자료표 참조)으로 이미지를 캡처했습니다.</li>
</ol>

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구제 금융에 제출된 후의 폴립 생존율과 공정이 완료되는 데 필요한 시간은 이전에 보고된 연구 25,33,41 사이에서 다양하며, 이는 각 연구에 적용된 상이한 실험적 접근법에 의해 설명될 수 있다. 예를 들어, 상이한 산호 종, 또는 동일한 종의 산호도 상이한 환경 조건(예를 들어, 홍해로부터의 산호)에 적응하지만, 염분 수준에 상이한 역치를 제시한다. 선별 된 구제 금융 방법과 실험실 / 수족관 조건 또한 결과에 중요한 역할을합니다. 일부 경우에, 실험실 조건 하에서의 산호 미세 전파의 유지는 azooxanthellate 3 3,41 및 zooxanthellate25 산호에서 생존의 개월에 도달함으로써 산호 세포 배양의 생존 시간을 능가했다. 폴립 구제 과정이 완료되는 시간은 또한 구제 금융을 일으키는 원인이되는 스트레스 요인에 노출 된 몇 시간 2 5,2 7,30에서 주 3 5의 배양에 이르기까지 다양한 연구에서 다양했습니다. 폴립 구제 금융을 연구 할 때 고려해야 할 또 다른 변수는 석방을 유발 한 급성 스트레스에 노출 된 후 폴립의 회복입니다. 구제 금융 후 폴립이 산호 생물학을 연구하기위한 모델로 사용되기에 충분한 상태에 있다면 여전히 논쟁의 여지가 있습니다. coenosarc의 분해 후 조직의 회복은 이러한 미세 전파를 사용할 때 우려되는 문제입니다. 그러나, 현재를 포함한 많은 연구에서 폴립은 구제 후 몇 주 동안 손상되지 않은 구강 - 복부 분극 및 촉수를 가진 조직 및 외부 형태25,27,32,36 내부에 zooxanthellae 세포를 제시 할 수있었습니다. 이전의 연구들은 또한 급성 스트레스로부터 완화된 후에, 고도로 식염수 또는 가열된 바닷물에 노출된 방출된 산호 폴립이 구제금융 이전에 발견된 것과 유사한 수준으로 아폽토시스, 단백질 분해 및 세포 분열과 같은 과정과 관련된 유전자의 발현을 회복시킬 수 있었다는 것을 발견하였다 32,36 및 심지어 조직 치유와 관련된 유전자의 발현을 증가시켰다36.
방법 간의 생존 차이와 관련하여이 시간은 동일한 기술이 사용되더라도 다른 실험마다 다를 수 있으며 사용 된 단편의 건강 및 구제 금융 과정 후 폴립의 적절한 유지와 관련 될 수 있음을 강조하는 것이 중요합니다. 칼슘이 없는 바닷물 배양을 통한 구제금융의 경우, 폴립 생존은 1일로 제한하였다. 따라서이 방법은 연구 된 종의 장기 생존에 적합하지 않거나 홍해에서 P. verrucosa 산호에 대한 기술의 더 나은 적응이 이루어져야한다고 결론 지을 수 있습니다. 보고된 결과는 염도의 점진적인 증가에 기초한 방법으로 더 긴 생존 시간을 얻었으며, 폴립이 높은 염도의 물을 떨어 뜨렸을 때 더 긴 생존 시간을 보였다. 이 방법은 증발 방법보다 염분의 조절 된 증가를 제공 할 수 있으며, 동시에 유기체에 잠재적으로 독성이있는 산호의 대사 폐기물을 포함하여 해수에서 발견되는 다른 물질의 농도 증가에 대한 책임을지지 않습니다. 이러한 모든 이유로이 방법은 건강한 폴립27을 유지하는보다 안전한 대안으로 제안되었습니다. 이 방법은 용종 건강에 더 안전하고 더 오래 사는 폴립을 생산할 수 있다고 가정되었지만,이 현재 간행물에서 입증 된 사실, 그것을 확인하기 위해서는 추가 조사가 필요합니다. 두 높은 염분 유도 구제 금융 실험은 염도가 24 h에서 59 PSU에 도달 한 후 폴립의 완전한 분리를 입증했습니다. 염분이 구제 금융이 완료된 수준을 지나서 증가하면 폴립에 더 많은 스트레스가 발생하여 급성 스트레스 치료에서 생존하고 회복 할 가능성이 줄어 듭니다. 따라서 이러한 염분 수준에서 폴립을 더 오래 유지하는 것은 권장하지 않습니다. 칼슘이 없는 바닷물에 노출시켜 구제 유인 유도 방법을 수행 할 때, 칼슘이없는 인공 해수에서 3 시간 배양하여 완전한 분리를 얻었으며,이 배지에 대한 추가 노출도 권장되지 않습니다.
실험실 / 체외 조사에서 산호 폴립 연구에 더 적합한 방법을 다루기 위해이 연구는 구제 금융 과정이 완료되기까지 24 시간에 가까운 세 가지 절차에만 초점을 맞추었고 경화 성 산호에서 산호 폴립의 장기 유지와 관련된 연구에 사용되었습니다. 이 시간보다 상당히 오래 걸리는 것으로 보고된 다른 방법들은 참여하지 않았다. 폴립을 기질에 정착시키는 것은 본 연구에서 시도되지 않았으며, 이는 일회용 피펫을 사용하여 다른 환경으로 옮겨 지거나 분석을 위해 쉽게 수집 할 수있는 폴립을 생산하는 데 중점을 두었습니다. 결과는 산호 종 P. verrucosa 의 폴립이 기질에 부착하지 않더라도 최대 8 주 동안 관련 zooxanthellae 세포, 건강한 시각 상태 및 보존 된 총 외부 해부학 적 구조와 함께 살아 있음을 보여줍니다. 이러한 결과는 본 연구에서 입증된 기술 중 일부를 사용하여 단일 산호 단편으로부터 더 많은 생물학적 반복실험이 생성될 수 있음을 나타낸다. 이러한 생물학적 복제물은 통제된 환경(예: 페트리 접시 및 세포 플라스크)에 보관될 수 있고, 한 달 동안의 실험을 위해 실험실 조건에서 유지될 수 있으며 여러 목적으로 사용될 수 있다.
폴립 구제 금융42,43에 대한 첫 번째 부수적 인 설명 이후, 폴립 방출을 유도하고 그러한 폴립을 살아있는 상태로 유지하는보다 표준화 된 방법을 찾기 위해 새로운 프로토콜이 수립되었으며, 이는 향후 연구 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 여기에는 산호 홀로비온트 생리학(44) 및 숙주-마이크로바이옴 상호작용(45), 산호 표백에 관여하는 분자 메커니즘(5,25), 산호 홀로비온트(12,13,46,47)의 건강, 탄력성 및 보호와 관련된 상이한 양태들을 조사하는 것이 포함된다. . 또한, 방출 된 산호 폴립은 연구 영역 밖의 응용 분야에 사용될 수 있으며 기질에 부착하고 성장할 수있는 프로파굴레를 만드는 데 유용 할 것으로 제안되어 구제 금융을위한 표준화 된 프로토콜이 널리 보급되면 복원 목적으로 사용할 수있는 여러 산호 개체를 잠재적으로 만들 수 있습니다28 . 전반적으로, 방법론을 표준화하기 위해 구제 금융을 사용하는 폴립을 사용하여보다 심층적 인 실험을 수행해야하지만, 폴립 구제 금융은 여러 가지 목적을 위해 산호 연구의 도구로 적용 할 수있는 재현 가능한 접근법이라는 것이 밝혀졌습니다.

Scleractinian 또는 암초 건설 산호는 탄산염 골격을 형성하고, 암초를 만들고, 깊은 곳에서 얕은 물 환경까지 발견 할 수있는 구조적으로 복잡한 생태계를 형성 할 수있는 cnidarians입니다1. 열대 산호초는 높은 생물 다양성을 보유하고 있으며 해안 보호 및 어업 유지 보수와 같은 필수 생태계 서비스를 제공합니다2. 대부분의 얕은 물 암초 건설 산호는 산호가 골격을 만드는 데 필요한 에너지를 제공하는 Symbiodiniaceae 가족의 조류와의 상호 관계에 의존합니다. 산호와 조류 사이의 공생은 환경 스트레스에 의해 깨질 수 있으며, 산호 표백 3,4,5,6을 일으킬 수 있습니다. 최근의 온도 이상은 전 세계적으로 주요 산호 표백 사건을 일으켜 대량 산호 사망률과 영구적 인 암초 저하 7,8,9,10,11로 이어졌습니다. 이러한 현상은 사멸, 자가포식 및 외세포증과 같은 사후 스트레스와 관련된 세포 메카니즘에 의한 공생물질의 배출에 기초하기 때문에, 산호 표백은 생태계규모 결과를 갖는 세포 과정으로 기술될 수 있으며, 이는 산호 세포 또는 조직의 시험관내 배양을 갖는 것을 의미하는 5,6,12 이 현상을 면밀히 연구하는데 적용될 수 있을 것이다.
산호초의 중요성과 그들이 직면 한 주요 위협, 특히 지난20 년 동안 2, 산호는 전 세계적으로 보호 및 복원 목적을위한 연구의 초점이되었습니다13. 그러나 신뢰할 수 있고 재현 가능하며 산호를 연구하기 위해 최소한의 환경 영향을 제공하는 접근법 및 실험 시스템의 개발은이 분야에서 주요 투쟁입니다.
미세증식은 조절된 혈관(14,15)에서 그의 생물학적 물질을 배양함으로써 유기체의 유전자형의 시험관내 증식으로 정의된다. 세포, 조직 및 장기의 배양은 최근 수십 년 동안 식물 및 동물 생물학에 결정적이었습니다. 그것은 실험실에서 유기체의 대량 번식, 다양한 치료법 (예 : 약물 및 의약품)의 신속한 평가, 세포 기능14,15,16,17에 대한 직접적인 연구를 가능하게합니다. 일반적으로, 시험관내 모델은 더 잘 조절된 물리적 및 화학적 조건 하에서 상이한 유기체의 연구를 보완하고 심화시키는데 유용하였다. 시험관 내 배양 기술의 장점으로 인해, 상이한 동물 세포 및 조직 배양 기술이 개발, 최적화 및 많은 연구 분야에서 중요한 도구로 사용되었으며, 다수의 세포주가 연구되고 수많은 응용을 위해 상용화되었다16,17,18.
1882 년 최초의 동물 조직 배양 이후 세포 및 조직 배양에 대한 지식의 많은 발전이 이루어졌습니다 17 년 천연 및 합성 배지의 사용, 확립 된 세포주의 발명, 더 나은 방법으로 다양한 세포 유형을 육성하기위한 3D 배지 개발16,17, 18,19년. 그러나, 세포 생물학 분야는 주로 선택된 집단의 모델 유기체에 초점을 맞추었지만, 많은 탁사는 여전히 세포, 조직 또는 기관(20)의 시험관내 배양이 잘 확립되어 있지 않다. 예를 들어, 산호 연구에서, 불멸화 된 세포주는 연구에 광범위하게 사용되지 않았으며, 산호 세포 연구를 일차 세포 배양의 사용으로 제한합니다. 이 배양물은 생존력이 21 주21 초까지 13 일 이상 모든 산호 조직에서 개별 세포의 생존을 기록한 연구는 없으며 2021년 22 초까지 제한되어 있습니다. 출판 될 지속 가능한 산호 세포주에 대한 첫 번째 보고서는 최대 6 개월까지 살았던 아크로 코라 테뉴아 세포에 관한 것이었으며 향후 연구를위한이 세포의 유용성은23 탐구 될 것입니다.
산호 세포 배양 배양의 한계를 극복하고 산호의 전반적인 조직 조직을 보존하는 실험실 배양을 유지하기 위해, 단리된 폴립의 사용은 최근 산호 생물학 연구24,25의 모델로서 제안되었다. 폴립은 산호의 해부학 적 단위이며, 각각은 구강 디스크의 중앙에 위치한 입을 가지며 복부 영역(26)의 코에노사르크에 의해 다른 폴립과 연결됩니다. 살아있는 폴립의 분리는 폴립 구제 금융의 과정에 의해 자연적으로 발생하며, 급성 스트레스는 폴립 사이의 코에노사르크의 소화를 일으켜 식민지의 골격25,27,28에서 분리 될 수 있습니다. 이러한 현상은 옥토산호 29,30,31, 검은 산호 32, 경화성 산호 25,27,28,32,33 등 다양한 탁사에서 발생하는 것으로 보고되었으며, 물 24,34, 산도 증가 35, 고삼투 조건 25,27,32,36, 고온 36,37, 기아33, 공기 노출25,30 및 살충제 오염 28,38. 폴립 구제 금융은 예를 들어, 전 세계에 널리 분포되어 산호 연구에서 모델로 일반적으로 사용되는 pocilloporid 산호19에서보고되었습니다. Pocillopora damicornis 및 Styllophora pistillata와 같은이 그룹에 속하는 종은 5mm 단편25에서 약 30-40 개의 미세 전파를 생성했습니다. 이 숫자는 산호의 작은 조각에서 많은 유전적으로 동일한 개체를 생성 할 수있는 가능성을 창출하기 때문에 산호 미세 전파를위한 방법으로 폴립 구제 금융을 사용하는 이점을 강조합니다. 연구를 위해 분리 된 폴립을 사용하는 것은 또한 플라스크 및 페트리 접시와 같은 통제 된 실험실 환경에서 배양 될 가능성에 관한 세포 배양과 동일한 이점을 가지고 있습니다. 또한, 살아있는 폴립을 유지하기위한 미세 유체 플랫폼은 이러한 미세 전파가 물 흐름, 표면 및 온도24,25를 제어하여 상대적으로 저렴하고 재현하기 쉬운 환경에서 유지 될 수 있음을 입증했습니다. 이러한 미세 유체 공학 플랫폼은 현미경으로 살아있는 산호 구조를 직접 시각화하는 데에도 사용할 수 있습니다24,25.
본 기사에서는 개별 산호 폴립을 식민지에서 분리하기 위해 개발 된 기술을 요약하고 시연하여 장기 배양을위한 실험실 조건에서 유지하는 방법을 보여줍니다. 논의 된 방법에는 증발 및 고염분 해수를 펌핑하고 칼슘이없는 바닷물에서 배양함으로써 고삼투 조건을 통한 폴립 구제 금융이 포함됩니다.

<table><tbody><tr><td>5560 전도도/온도 프로브</td><td>YSI</td><td>5560</td><td>전도도 프로브는 ProQuatro 멀티파라미터 미터</td></tr><tr><td>Ace 5 in과 함께 사용됩니다. 합금강 대각선 펜치</td><td>에이스 하드웨어</td><td>2004083</td><td>산호 조각을 자르는 데 사용</td></tr><tr><td>암피실린 나트륨 염</td><td>시그마-알드리치</td><td>A9518</td><td>DMEM 매체에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>DMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>41965-039</td><td>칼슘이 없는 폴립 구제 방법에서 산호 조각을 배양하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>Fisherbrand Petri Dish, Stackable Lid 60 mm x 15 mm Sterile, 폴리스티렌</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FB0875713A</td><td>페트리 접시 증발에 의한 구제 및 수족관 내부의 폴립을 보관하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Heizer Titanrohr Heizstab SW MW 600</td><td>Watt Schego</td><td>548</td><td>수족관에 사용되는 히터</td></tr><tr><td>Leica Application Suite 버전 4.2</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>시연 결과에서 이미지 캡처에 사용되는 소프트웨어</td></tr><tr><td>Leica IC80 HD</td><td>Leica Microsystems</td><td>12730216</td><td>카메라는 시연 결과 사진을 찍는 데 사용됩니다</td></tr>. <tr><td>Leica MDG33</td><td>Leica Microsystems</td><td>10 450 123</td><td>시연 결과 사진을 찍는 데 사용되는 입체 스코프 스탠드</td></tr><tr><td>Leica Z6 APO</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Macroscope는 시연 결과 사진을 찍는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>염화 마그네슘</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>7487-88-9</td><td>칼슘이없는 인공 해수를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>황산 마그네슘 무수</td><td>시그마 알드리치</td><td>7791-18-6</td><td>칼슘이 없는 인공 해수를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Masterflex I/P 이지로드 펌프 헤드, 정밀 튜빙용, 흰색 PPS 하우징, SS 로터</td><td>Masterflex</td><td>HV-77602-10</td><td>연동 펌프 헤드</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 정밀 모듈러 드라이브(벤치탑 컨트롤러 포함)</td><td>Masterflex</td><td>EW-07557-00</td><td>고염도 해수를 펌핑하는 데 사용되는 연동 펌프 드라이브. 프로토콜에 설명된 대로 물 흐름을 mainaining할 수 있는 모든 연동 펌프를 대체할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Masterflex L/S 정밀 펌프 튜빙, 백금 경화 실리콘, L/S 16; 연동 펌프용 25피트</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-16</td><td>튜빙.</td></tr><tr><td>Millex 33mm PVDF 0.22 &마이크로; m 멸균 RUO</td><td>시그마-알드리치</td><td>SLGVR33RS</td><td>인공 해수를 여과하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Nunc EasYFlask 75 cm2 Nunclon Delta Surface</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>156499 플라스크는 일반적으로 세포 배양에 사용되며 용종 배양에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>오비탈 쉐이커, 고급 5000, VWR</td><td>VWR</td><td>444-2916</td><td>인큐베이터 내부에 사용되는 셰이커.</td></tr><tr><td>Percival Incubator - I-22VL</td><td>Percival</td><td>NA</td><td>인큐베이터는 세포 플라스크에 보관된 산호를 유지하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>플랑크톤 그물 200 &micro; m 메쉬 크기</td><td>KC 덴마크</td><td>NA</td><td>산호 폴립을 포함하는 페트리 접시를 덮는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>VWR 화학 물질</td><td>7447-40-7</td><td>칼슘이없는 인공 해수를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>ProQuatro 다중 매개 변수 측정기</td><td>YSI</td><td>606950</td><td>프로토콜</td></tr><tr><td>RADION XR15 G5 PRO</td><td>Ecotech</td><td>NA</td><td>수족관에서 사용되는</td></tr> 조명 <tr><td>홍해 소금 프리미엄 등급, 중간 알칼리성</td><td>홍해</td><td>NA</td><td>40 PSU 인공 해수를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>144-55-8</td><td>칼슘이없는 인공 해수를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>칼슘이 없는 인공 해수를 준비하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>황산나트륨 무수</td><td>VWR 화학물질</td><td>7757-82-6</td><td>칼슘이 없는 인공적인 바닷물을 준비해서 사용하는.</td></tr><tr><td>TRD 112 온도 조절기</td><td>Schego</td><td>NA</td><td>수족관에 사용되는 온도 조절기</td></tr><tr><td>Turbelle Nanostream 6025</td><td>Tunze</td><td>6025 000</td><td>수족관에 사용되는 펌프</td></tr></tbody></table>

산호 식민지에서 폴립 구제 금융을 유도하여 실험실 실험 사용을위한 개별화 된 미세 전파를 얻습니다.

Inducing Polyp Bail-out in Coral Colonies to Obtain Individualized Micropropagates for Laboratory Experimental Use

산호는 폴립이라고 불리는 모듈 단위에 의해 형성된 식민지 동물입니다. 산호 폴립은 생리적으로 연결되어 조직에 의해 연결됩니다. 폴립 구제 금융의 현상은 급성 스트레스에 의해 유발되는 과정으로, 산호 폴립은 콜로니의 나머지 부분과 연결되는 조직을 소화하고 궁극적으로 골격에서 분리되어 별도의 개체로 계속 생활합니다. 산호 생물학자들은 수년 동안 폴립 구제 금융의 과정을 인정해 왔지만, 최근에야 이 과정에 의해 생성된 미세전파가 산호 생물학 연구의 모델 시스템으로 인식되고 있다. 폴립 구제 금융의 사용은 단일 산호 단편에서 많은 수의 클론 단위를 만들 수 있습니다. 또 다른 이점은 폴립의 단일 폴립 또는 패치가 현미경으로 쉽게 시각화 될 수 있고 페트리 접시, 플라스크 및 미세 유체 칩과 같은 고도로 표준화 된 저비용 환경에서 유지 될 수 있다는 것입니다. 본 프로토콜은 산호 미세 전파를 유도 할 수있는 재현 가능한 방법과 단일 폴립을 장기간에 걸쳐 살아 유지하기위한 다양한 접근법을 보여줍니다. 이 방법론은 구제 금융 후 최대 8 주 동안 산호 종 Pocillopora verrucosa 의 폴립을 성공적으로 재배 할 수 있었으며 산호 연구를 위해 개별 산호 폴립을 사용하는 실용성을 보여주었습니다.

폴립 구제금융은 세 가지 상이한 방법에 따라 P. verrucosa 종의 단일 콜로니에 속하는 산호 단편에서 유도되었다(도 1). 물 증발 후 높은 염도에 의해 유도된 구제금융은 페트리 접시에서 산호 파편을 40 PSU에서 초기에 물로 채워진 주위 온도에서 24시간 인큐베이션한 후에 완료되었고, 그 후 공정이 끝나면 59 PSU의 최종 염도에 도달하였다(도 2A-C, I). 바닷물 공급에 의한 구제금융은 또한 40 PSU에서 초기에 물에서 24 시간의 인큐베이션 후에 도달하였고, 그 후 공정의 끝에서 12 h 및 59 PSU의 염도에 도달한 후, 24 h 후에 도달하였다 (도 2D-F, I). 두 실험 모두에서, 염분의 증가는 폴립에 의한 조직 소화의 유도를 담당하였다. 12 시간 후, 높은 염분 조건은 코에노사르크의 점진적인 엷어짐과 함께 폴립의 수축을 일으켜 궁극적으로 24 시간 후에 폴립의 최종 분리를 일으켰습니다. 칼슘이 없는 해수에서의 인큐베이션을 통한 구제bail-out 유도는 CaFSW에서 3h 인큐베이션한 후 20% DMEM 배지에서 20h 인큐베이션한 후에 완료되었다(도 2G-H). 조직은 개별화된 산호 폴립(도 3A-C)과 "조직 공"이 생성될 때까지 피펫으로 밀어낸 후 세 가지 방법 모두에서 골격으로부터 분리되었다.
분리 후, 세 가지 방법 모두에서 폴립을 수집하고 그물 또는 세포 플라스크로 덮인 페트리 접시에 할당하기 전에 바닷물에서 회수하도록 허용했습니다. 증발 및 급수 방법으로부터 얻은 폴립은 수족관 내부의 페트리 접시에서 유지되었고 각각 6 주 및 8 주 동안 생존했다 (그림 3D 및 그림 3F). 이러한 미세 전파는 폴립의 일반적인 해부학을 유지하여 촉수, 기저 디스크 및 입1을 제시했습니다. 칼슘이 없는 바닷물에서의 배양을 통해 얻은 폴립은 수명이 짧았고, 1일까지 생존했으며, 그 후 조직이 해리되었다. 해수 증발 방법으로부터 얻은 폴립은 배양기 내부의 세포 배양 플라스크에 보관되어 조직의 해리 없이 최대 3주 동안 생존하였다(도 3F). 모든 경우에, 폴립이 기질에 부착 할 수 없더라도, 그들은 시각적으로 건강했고 그들의 색깔을 유지했으며, zooxanthellae 세포는 여전히 조직 내에서 볼 수 있습니다1.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig01v2.jpg"> 그림 1 : 폴립 구제 유도에 대한 세 가지 다른 테스트 방법론의 개략적 표현 (왼쪽) 다음에 실험실 조건에서 획득 된 폴립을 유지하는 두 가지 방법의 그림 (오른쪽). (A) 물 증발에 의한 폴립 구제 방법에 대한 방법론의 표현. (B) 높은 염분 해수 공급에 의한 폴립 구제 수단에 대한 방법론의 표현. (C) 칼슘이 없는 바닷물 배양에 의한 폴립 구제 방법론의 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig01largev2.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig02.jpg"> 그림 2: 산호 종 P. verrucosa의 단편을 사용하는 세 가지 다른 방법론에 의해 유도된 폴립 구제 과정의 이미지. (A-C) 산호 절편을 0 h, 12 h 및 24 h에서 각각 배양한 후, 물 증발 방법을 이용하여 페트리 접시에 보관하였다. (D-F) 산호 절편을 각각 0 h, 12 h, 및 24 h에서 배양한 후, 염도가 높은 해수 공급 방법을 사용한다. (G, H) 칼슘이 없는 해수 배양 방법 전후에 각각 노출된 산호 파편. 칼슘이 없는 인공 해수에서의 인큐베이션은 3시간 동안 그리고 21시간 동안 20% DMEM에서 배양되었다. (I) 물 증발 및 고염분 해수 공급 구제 유도 방법 동안 시간에 따른 해수의 PSU에서의 염도 값의 그래픽 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63840/63840fig03.jpg"> 도 3: 입증된 3개의 구제금융 유도 절차로부터 수득된 P. verrucosa 폴립의 이미지. (A-C) 증발, 바닷물 공급 및 칼슘이 없는 바닷물 방법으로부터 수득된 폴립의 이미지는 각각 골격으로부터 분리된 직후에 캡처되었다. (d) 페트리 접시에서 6주간 생존한 후 증발법으로부터 얻은 산호 폴립의 이미지. (e) 페트리 접시에서 8주간 생존한 후 바닷물 공급 방법으로부터 얻은 산호 폴립의 이미지. (f) 세포 배양 플라스크에서 3주간 생존한 후 증발법으로부터 얻은 산호 폴립의 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63840/63840fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

폴립 구제 금융은 급성 스트레스에 의해 유발되는 과정으로, 산호 폴립이 콜로니에 연결된 조직을 소화하고 개인으로 살기 위해 분리됩니다. 본 프로토콜은 고식염수 또는 칼슘이 없는 해수 처리를 사용하여 구제금융에 의해 산호 미세전파를 유도하는 방법을 기술한다.

Corals are colonial animals formed by modular units called polyps. Coral polyps are physiologically linked and connected by tissue. The phenomenon of ...

산호 미세 전파는 아직 초기 단계에 있습니다. 폴립 구제 금융을위한 프로토콜을 최적화하는 것은 과학자들이 폴립을 실험실 환경에서 산호를 연구하기위한 모델로 사용할 수 있도록이 격차를 메우는 열쇠입니다. Polyp bail-out은 작은 산호 조각에서 여러 전파를 만들 수있게합니다.폴립은 예를 들어 산호에서 미세한 과정의 관찰을 용이하게하는 다른 실험에 사용될 수 있습니다. 산호초가 위협받고 있습니다. 우리의 목표는이 복제 가능한 모델을 사용하여 효율적이고 비 침습적 인 방법으로 표백 및 기타 환경 위협으로부터 산호를 보호하기위한 전략을 개발하는 것입니다.이 방법은 산호 생리학, 숙주 미생물 상호 작용 및 표백과 관련된 메커니즘의 조사를 도울 수 있습니다. 이러한 발견은 예를 들어 산호 프로바이오틱스의 최적화에 기여할 수 있습니다. 적절한 염분으로 바닷물을 사용하는 것이 중요합니다.염분은 산호의 자연 환경 수준에서 시작하여 스트레스가 과도하게 해롭지 않도록 천천히 증가해야합니다. 정확한 순간에 폴립을 수집하고 가장 손상되지 않은 폴립을 선택하는 것은 생존에 매우 중요합니다. 시각적 데모는 이러한 단서를 이해하는 데 필수적 일 수 있습니다.첫째, 대각선 절단 펜치를 사용하여 산호 식민지에서 작은 조각을 자른 다음 산호 식민지가 순응 된 12 밀리리터의 바닷물로 채워진 작은 페트리 접시에 넣으십시오. 플레이트를 주변 온도에서 약 24 시간 동안 열어 두어 물이 증발하고 염도가 점차 증가하도록하십시오. 폴립 사이에서 조직 소화가 관찰 될 때, 1 밀리리터 전달 피펫을 사용하여 산호 조직에 가까운 부드러운 흐름을 만듭니다.흐름은 골격에서 이미 주변 조직을 소화 한 폴립의 분리를 천천히 완료 한 다음 피펫으로 페트리 접시의 물을 등압 수와 천천히 교환하는 데 도움이됩니다. 염분이 높은 바닷물을 준비하려면 일반 바닷물을 가져 와서 염도가 85 % 증가 할 때까지 염분이 높은 해수 3 리터를 준비하기 위해 염화나트륨을 첨가하십시오 이전에 입증 된 것처럼 산호의 작은 조각을 절단 한 후 연동 펌프에 연결된 등변성 해수 3 리터가있는 10 리터 용기에 넣으십시오. 이 용기에 이전에 준비된 염분 해수 세 리터를 시간당 126 밀리리터의 속도로 24 시간 동안 채우고 염분을 약 40 % 증가시킵니다 피펫을 사용하여 부드러운 물의 흐름을 만들어 골격에서 폴립을 방출하십시오.컨테이너의 물을 이소 모틱 바닷물과 천천히 교환하십시오. 26.29 그램의 염화나트륨, 0.872 그램의 염화칼륨, 2.16 그램의 황산마그네슘, 11.94 그램의 염화마그네슘, 3.42 그램의 황산나트륨 및 0.26 그램의 중탄산나트륨을 탈이온수 1 리터에 첨가하여 칼슘이없는 바닷물을 준비한 다음이 칼슘이없는 바닷물로 페트리 접시를 채 웁니다. 작은 산호 조각을 자른 후 페트리 접시의 칼슘이없는 바닷물에 담그십시오.접시를 80rpm의 회전 속도로 세 시간 동안 궤도 인큐베이터에 넣은 다음 조각을 40 개의 실용적인 염분 단위의 인공 바닷물로 준비하고 암피실린 리터 당 100 밀리그램을 함유 한 20 % DMEM으로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 단편을 섭씨 26도 및 80rpm에서 인큐베이션한다. 폴립과 개별 폴립 사이에서 조직 소화가 관찰 될 때까지 매일 배지를 교환 한 다음 폴립을 멸균 된 바닷물로 옮기고 한 시간 동안 배양하십시오.폴립이 스트레스가 없는 염분으로 여과된 바닷물로 되돌아오면, 스테레오 현미경으로 섬모 흐름으로 인한 조직 무결성과 움직임을 관찰하여 실행 가능한 폴립을 선택하십시오. 선택한 폴립을 페트리 접시에 넣고 폴립이 접시에서 멀리 떠 다니지 않도록 200 마이크로 미터 메쉬 크기의 플랑크톤 그물로 페트리 접시를 덮으십시오. Petri 접시를 사용 된 산호 종에 적합한 조건의 수족관 안에 넣으십시오.조류 과증식을 방지하려면 적어도 일주일에 한 번 페트리 접시를 열어 물을 재생하고 접시를 청소하십시오. 앞과 같이 폴립을 선택한 후, 전사 피펫을 사용하여, 50 밀리리터의 등모성 해수로 채워진 75 평방 센티미터 표면 셀 플라스크에 넣은 다음, 플라스크를 닫고 12시간 광주기, 섭씨 26도 및 40 rpm으로 설정된 인큐베이터에 넣는다. 플라스크에 조류 또는 생물막이 채워지면 내용물을 깨끗한 플라스크로 옮기십시오.본 연구에서, 폴립 구제금융은 세 가지 다른 방법에 의해 유도되었다. 물 증발 방법은 배양 후 24 시간 이내에 완전한 구제 금융을 초래했으며, 염분은 24 시간 후에 40에서 59 실용적인 염분 단위로 증가했습니다. 염수 공급 방법은 또한 인큐베이션 24 시간 후에 폴립 구제 금융을 초래했다.여기서, 염도는 12시간 배양 후 40개에서 52개의 실용적인 염분 단위로 증가하였고, 그 후 24시간 후에 59개의 실용적인 염분 단위로 증가하였다. 칼슘이 없는 바닷물에서의 인큐베이션을 통한 구제금융 유도는 그 안에서 폴립을 세 시간 동안 배양한 후 완료하였고, 이어서 20%DMEM 배지에서 20시간 인큐베이션한 후, 세 가지 방법 모두에서, 개별화된 산호 폴립이 생성될 수 있었다. 증발 방법에 의해 생성 된 산호 폴립은 육 주 동안 생존 할 수있는 반면, 염분이 높은 해수 공급 방법으로 생성 된 폴립은 수족관 내부의 페트리 접시에서 여덟 주 동안 생존 할 수 있습니다.인큐베이터 내부의 세포 배양 플라스크에 보관된 해수 증발 방법으로부터 얻은 폴립은 조직의 완전한 해리 없이 최대 삼주 동안 생존하였다. 해골에서 폴립을 분리 할 때, 온화한 것이 중요합니다. 그들이 완전히 분리되지 않은 경우, 강하게 피펫팅 된 물에 의한 분리를 강요하면 손상이 발생하고 생존율이 낮아집니다.이러한 방법을 사용하여 폴립의 정착을 유도 할 수 있습니다. 폴립 정착은 석회화 및 성장 과정에 대한 질문에 대답 할 수 있습니다. 폴립 구제 유인자의 개발 후, 연구자들은 산호 골격의 초기 형성을 연구하고 폴립 스케일에서 산호 표백을 직접 시각화 할 수있었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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