Name: 마이크로단백질 동정 및 서열 분석을 위한 통합 접근법 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
Description: 배우세요 UCSC Genome Browser에서 PhyloCSF를 활용하여 마이크로단백질 코딩 가능성을 분석하는 생물정보학 프로토콜입니다. 비전문가도 쉽게 활용할 수 있는 이 방법은 보존된 짧은 개독서틀을 식별하여 유전체 연구를 확장합니다.

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이 연구는 국립 보건원 (HL-141630 및 HL-160569)과 신시내티 아동 연구 재단 (수탁자 상)의 보조금으로 지원되었습니다.

아래에 설명 된 프로토콜은 UCSC 게놈 브라우저에서 PhyloCSF 브라우저 트랙을로드하고 탐색하는 단계를 자세히 설명합니다 (Mudge et al.49에 의해 생성됨). UCSC 게놈 브라우저에 관한 일반적인 질문은 광범위한 게놈 브라우저 사용자 안내서가 여기에서 찾을 수 있습니다 : <a href="https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html">https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html</a>.
1. PhyloCSF 트랙 허브를 UCSC 게놈 브라우저에 로드
<ol><li>인터넷 브라우저 창을 열고 UCSC 게놈 브라우저(<a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a>)로 이동합니다.</li>
	<li>도구 제목 아래에서 트랙 허브 옵션을 선택합니다. 참고: 트랙 허브 옵션은 내 데이터 탭에서도 찾을 수 있습니다.</li>
	<li>공용 허브 탭에서 검색 용어 상자에 PhyloCSF를 입력합니다. 공용 허브 검색 단추를 클릭합니다.</li>
	<li>허브 이름 PhyloCSF에 대한 연결 버튼을 클릭하여 PhyloCSF에 연결합니다 (설명 : PhyloCSF 로 측정 된 진화 단백질 코딩 잠재력). 참고: 이 트랙 허브는 사람(hg19 및 hg38) 및 마우스(mm10 및 mm39)를 포함한 수많은 어셈블리에 로드됩니다.</li>
	<li>연결을 클릭 한 후 UCSC 게놈 브라우저 게이트웨이 페이지 (<a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway</a>)로 리디렉션 될 때까지 기다립니다.</li>
</ol>2. 유전자 식별자를 사용하여 관심있는 유전자로 이동
<ol><li>쿼리할 종과 게놈 어셈블리를 선택합니다. 다른 종(예: 마우스)을 쿼리하려면 해당 아이콘을 클릭하여 찾아보기/ 종 선택 제목 아래에서 관심 종을 선택하거나 "종 , 일반 이름 또는 어셈블리 ID 입력"이라는 텍스트 상자에 종을 입력합니다. 참고: 어셈블리는 위치 찾기 제목 바로 아래에 나열됩니다. 전형적으로, 디폴트는 휴먼 어셈블리(예를 들어, Dec. 2009 [GRCh37/hg19])이다.</li>
	<li>드롭다운 메뉴를 사용하여 위치 찾기 제목 아래에서 검색할 어셈블리를 선택합니다.</li>
	<li>위치/검색어 상자에 위치, 유전자 기호 또는 검색어를 입력하고 이동 을 클릭하여 게놈 브라우저에서 관심 있는 유전자로 이동합니다.</li>
	<li>검색으로 인해 여러 개의 일치 항목이 발생한 경우 관심 위치를 선택해야 하는 페이지로 리디렉션될 때까지 기다립니다. 관심있는 적절한 유전자를 클릭하십시오.</li>
</ol>3. 서열 정보를 사용하여 관심있는 게놈 영역으로 이동
<ol><li>UCSC 게놈 브라우저(<a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a>)로 이동하여 도구 제목 아래에서 BLAT와 유사한 정렬 도구(BLAT)를 선택하여 특정 DNA 또는 단백질 서열을 쿼리합니다. 또는 도구 탭 위에 커서를 놓고 Blat 옵션을 선택하거나 다음 링크를 따르십시오<a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat">: https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat</a>.</li>
	<li>드롭다운 메뉴를 사용하여 종(게놈)과 관심 어셈블리 를 선택합니다.</li>
	<li>드롭다운 메뉴를 사용하여 쿼리 유형을 정의합니다.</li>
	<li>BLAT 검색 게놈 텍스트 상자에 관심 있는 시퀀스를 붙여넣고 제출을 클릭합니다.</li>
	<li>ACTIONS 제목 아래의 브라우저 링크를 클릭하여 관심있는 게놈 영역으로 이동하십시오.</li>
</ol>4. PhyloCSF 트랙 데이터를 사용하여 보존된 sORF 식별
<ol><li>PhyloCSF 영역을 긍정적으로 스코어링하기 위해 관심있는 게놈 영역을 시각적으로 스캔합니다 (그림 1). 참고: UCSC 게놈 브라우저에서 PhyloCSF 점수를 시각적으로 해석하는 방법에 대한 자세한 설명은 아래의 대표적인 결과 섹션을 참조하십시오.</li>
	<li>확대/축소 기능을 사용하여 관심 영역을 확대하여 시퀀스 특성을 검사하고 시작/정지 코돈을 검색합니다. 수동으로 확대하려면 Shift 키를 누른 채 마우스 버튼을 누른 채 관심 영역을 따라 드래그합니다. 또는 페이지 위쪽에 있는 확대 및 축소 단추를 사용하여 탐색합니다(1.5x, 3x, 10x 또는 기본 확대/축소 옵션 사용 가능). 참고: 확대/축소 버튼을 사용하기 전에 관심 영역이 화면 중간에 있도록 유전자의 위치를 변경해야 합니다. 이 작업을 수행하려면 이미지를 클릭하고 왼쪽 또는 오른쪽으로 드래그하여 게놈 영역을 원하는 대로 수평으로 이동하거나 페이지 상단의 이동 화살표를 사용합니다.</li>
	<li>뉴클레오티드(염기) 서열이 보일 때까지 확대합니다. 참고: 뉴클레오티드 서열은 +1 평활화된 PhyloCSF 점수 바로 위에 나타날 것이다.</li>
	<li>양성 스코어링된 PhyloCSF 영역의 시작과 끝 근처의 뉴클레오티드 서열을 육안으로 스캔하여 추정적 시작(ATG) 및 정지(TGA/TAA/TAG) 코돈을 확인한다. 참고: 관심있는 유전자가 DNA의 마이너스 가닥에 있다면, 시작 및 정지 코돈은 역보체가 될 것이다 (즉, 시작 코돈의 경우 CAT, 정지 코돈의 경우 TCA/TTA/CTA).</li>
</ol>5. 다른 게놈에서 상동성 영역 보기
<ol><li>페이지 상단의 보기 제목 위에 마우스를 놓고 다른 게놈 입력(변환) 옵션을 클릭합니다.</li>
	<li>새 게놈 제목 아래의 드롭다운 메뉴를 사용하여 관심 있는 게놈을 정의합니다.</li>
	<li>새 어셈블리 제목 아래의 드롭다운 메뉴를 사용하여 원하는 게놈 어셈블리 를 선택한 다음 제출 단추를 클릭합니다.</li>
	<li>브라우저가 유사성을 가진 새 어셈블리의 영역 목록을 반환하면 염색체 위치 링크를 클릭하여 관심 있는 상동 영역으로 이동합니다. 참고: 전체 염기(뉴클레오티드)의 백분율과 해당 영역에 의해 커버되는 스팬은 나열된 각 영역에 대해 정의될 것이다. 일치하는 염기의 비율이 높을수록 관심 영역에 대한 보존이 높아집니다.</li>
	<li>섹션 4에 설명된 것과 동일한 탐색 전략을 따라 시퀀스를 분석합니다.</li>
</ol>6. 관심있는 미세 단백질에 대한 다종 서열 정렬 생성
<ol><li>UCSC 게놈 브라우저에서 GENCODE 트랙에 관심 있는 유전자를 클릭하고(파란색 상자로 그림 1A에 표시됨) 유전자 설명 페이지로 이동합니다.</li>
	<li>도구 및 데이터베이스에 대한 시퀀스 및 링크 제목에서 다른 종 FASTA를 읽는 테이블의 링크를 클릭하십시오.</li>
	<li>관심있는 종과 관련된 상자를 클릭하여 선택하십시오. 제출을 클릭합니다. 페이지 하단에 나타나는 시퀀스를 FASTA 형식으로 복사하여 워드 프로세싱 문서에 붙여넣습니다.</li>
	<li>두 번째 브라우저 창을 열고 유럽 생물 정보학 연구소 (EMBL-EBI) 웹 사이트 53,54 : <a href="https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/">https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/</a> 에서 Clustal Omega 다중 시퀀스 정렬 도구52로 이동하십시오.</li>
	<li>클립보드에 아직 남아 있는 시퀀스 파일을 지원되는 형식으로 시퀀스를 읽는 1단계의 상자에 붙여넣습니다. 페이지 하단으로 스크롤하여 제출을 클릭하십시오. 각 아미노산의 보존 정도를 나타내는 기호에 대해 정렬된 결과(검은색 글꼴)를 아래에서 살펴봅니다(기호는 표 1에 정의되어 있음). 참고: 정렬을 생성하는 데 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다.</li>
	<li>아미노산 특성을 색상으로 보려면 서열 바로 위에 있는 색상 표시 링크를 클릭하여 해당 특성에 따라 아미노산을 채색합니다( 표 2에 정의됨).</li>
	<li>시퀀스 정렬을 복사하여 워드 프로세싱 또는 슬라이드쇼 프로그램에 붙여넣어 그림 또는 그림 파일을 생성합니다(예: 그림 2). 참고: Courier와 같은 정렬을 위해 모노스페이스 글꼴을 사용하십시오.</li>
	<li>Clustal Omega 결과 페이지에서 다른 출력을 보려면 해당 탭(예: 가이드 트리 또는 계통 발생 트리)을 클릭합니다.</li>
	<li>결과 뷰어 탭을 클릭하여 다중 시퀀스 정렬 편집, 시각화 및 분석(55)을 전문으로 하는 무료 프로그램인 Jalview를 사용하여 시퀀스 정보를 보거나 MView 및 Simple Phylogeny56에 대한 직접 링크에 액세스할 수 있는 옵션을 확인하십시오.</li>
</ol>

저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기에 제시된 프로토콜은 사용자 친화적 인 UCSC 게놈 브라우저 48,49,50,51에서 PhyloCSF를 사용하여 마이크로 단백질 코딩 잠재력에 대한 관심있는 게놈 영역을 조사하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 위에서 설명한 바와 같이, PhyloCSF는 계통발생 모델과 코돈 치환 빈도를 통합하여 단백질 코딩 유전자48,49의 전형적인 진화적 시그니처를 확인하는 강력한 비교 유전체학 알고리즘이다. PhyloCSF는 이전에 비코딩으로 주석이 달린 게놈 영역에서 기능적 마이크로단백질을 확인하기 위해 널리 사용되어 왔으며 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47<sup clas...

게놈에서 코딩 요소의 완전한 세트의 확인은 인간 게놈 프로젝트의 개시 이후 주요 목표였으며, 생물학적 시스템에 대한 이해와 유전 기반 질병의 병인학을 향한 핵심 목표로 남아 있습니다 1,2,3,4. NGS 기술의 발전은 척추동물, 무척추동물, 효모 및 식물5을 포함한 광범위한 수의 유기체에 대한 전체 게놈 서열의 생산으로 이어졌다. 추가적으로, 고처리량 전사 시퀀싱 방법은 세포 전사체의 복잡성을 더욱 밝혀냈고, 단백질 코딩 및 비코딩 기능 모두를 갖는 수천 개의 새로운 RNA 분자를 확인하였다6,7. 이러한 방대한 양의 서열 정보를 해독하는 것은 진행중인 과정이며, 포괄적 인 유전자 주석 노력8에 대한 과제가 남아 있습니다.
리 보솜 프로파일링9,10 및 폴리리보솜 시퀀싱 11을 포함한 번역 프로파일링 방법의 최근 개발은 수백 개의 비정규 번역 사건이 게놈 전체에 걸쳐 현재 주석이 없는 sORF에 매핑된다는 증거를 제공했으며, 마이크로단백질 또는 마이크로펩티드12,13,14,15,16이라고 불리는 작은 단백질을 생성할 가능성이 있으며, 17. 마이크로 단백질은 작은 크기 (<100 아미노산)와 고전적인 단백질 코딩 유전자 특성 8,12,18,19,20의 부족으로 인해 표준 유전자 주석 방법에 의해 간과 된 다목적 단백질의 새로운 클래스로 부상했습니다. 미세단백질 은 효모21,22, 파리 17,23,24, 포유류25,26,27,28을 포함한 거의 모든 유기체에서 기술되었으며, 발달, 대사 및 스트레스 신호 전달 19,20,29를 포함한 다양한 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 나타났습니다. 30,31,32,33,34. 따라서, 오랫동안 간과되어 온 기능적 작은 단백질 클래스의 추가 구성원을 위해 게놈을 계속 채굴하는 것이 필수적입니다.
마이크로 단백질의 생물학적 중요성에 대한 광범위한 인식에도 불구하고,이 부류의 유전자는 게놈 주석에서 크게 과소 대표되고 있으며, 정확한 식별은 현장에서 진전을 방해하는 지속적인 도전으로 계속되고 있습니다. 마이크로단백질 코딩 서열을 확인하는 것과 관련된 어려움을 극복하기 위해 다양한 전산 도구 및 실험 방법이 최근에 개발되었다(몇몇 포괄적인 리뷰 8,35,36,37에서 광범위하게 논의됨). 최근의 많은 미세단백질 동정 연구 38,39,40,41,42,43,44,45,46,47 은 PhyloCSF 48,49라고 불리는 알고리즘 중 하나의 사용에 크게 의존해 왔다. , 게놈의 보존된 단백질 코딩 영역과 비코딩되는 영역을 구별하기 위해 활용될 수 있는 강력한 비교 유전체학 접근법.
PhyloCSF는 단백질 코딩 유전자의 진화적 시그니처를 검출하기 위해 다종 뉴클레오티드 정렬과 계통발생 모델을 사용하는 코돈 치환 빈도(CSF)를 비교한다. 이러한 경험적 모델-기반 접근법은 단백질이 뉴클레오티드 서열보다는 아미노산 수준에서 주로 보존된다는 전제에 의존한다. 따라서, 동일한 아미노산을 인코딩하는 동의어 코돈 치환, 또는 보존된 특성(즉, 전하, 소수성, 극성)을 갖는 아미노산에 대한 코돈 치환은 긍정적으로 점수가 매겨지는 반면, 오센스 및 넌센스 치환을 포함하는 비동의어 치환은 부정적으로 점수가 매겨진다. PhyloCSF는 전체 게놈 데이터에 대해 훈련되고 표준 단백질 코딩 유전자48,49의 미세 단백질 또는 개별 엑손을 분석 할 때 필요한 전체 서열로부터 분리 된 코딩 서열 (CDS)의 짧은 부분을 채점하는 데 효과적이라는 것이 입증되었습니다.
특히, 캘리포니아 산타크루즈 대학(UCSC) 게놈 브라우저(49,50,51)에 PhyloCSF 트랙 허브의 최근 통합은 모든 배경의 조사관이 단백질 코딩 잠재력에 대한 관심 게놈 영역을 쿼리하기 위해 사용자 친화적인 인터페이스에 쉽게 액세스할 수 있게 한다. 아래에 요약된 프로토콜은 UCSC 게놈 브라우저에 PhyloCSF 트랙 허브를 로드하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공하며, 이어서 관심 게놈 영역을 조사하여 고신뢰도 단백질 코딩 영역(또는 그 부족)을 조사합니다. 추가적으로, 양성 PhyloCSF 스코어가 관찰되는 경우에, 마이크로단백질 코딩 잠재력을 추가로 분석하고 종간 서열 보존을 예시하기 위해 확인된 아미노산 서열의 다중 종 정렬을 효율적으로 생성하기 위한 단계들이 기술된다. 마지막으로, 예측된 도메인 구조 및 추정적 마이크로단백질 기능에 대한 통찰력을 포함하여 확인된 마이크로단백질 특성을 조사하기 위해 논의에 몇 가지 추가적인 공개적으로 이용 가능한 자원 및 도구가 도입된다.

<table><tbody><tr><td>웹사이트</td><td>웹사이트 주소</td><td>요구 사항</td><td></td></tr><tr><td>Clustal Omega 다중 시퀀스 정렬 도구</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/">https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/</a></td><td>웹 브라우저</td><td>FASTA 염기서열의 효율적인 정렬을 위한 다중 염기서열 정렬 프로그램(즉, 식별된 미세단백질의 종간 비교)</td></tr><tr><td>COXPRESSdb</td><td><a href="https://coxpresdb.jp">https://coxpresdb.jp</a></td><td>웹 브라우저</td><td>유전자 기능을 추정하기 위한 공동 조절된 유전자 관계 제공</td></tr><tr><td>EMBL-EBI 생물정보학 도구 FAQ</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ">https://www.ebi.ac.uk/seqdb/confluence/display/JDSAT/Bioinformatics+Tools+FAQ</a></td><td></td><td>EMBL-EBI 도구에 대한 웹 브라우저 자주 묻는 질문(FAQ). 단백질 염기서열 정렬을 위한 색상 코딩 키 포함</td></tr><tr><td>European Bioinformatics Institute(EMBL-EBI), Tools and Data Resources</td><td><a href="https://www.ebi.ac.uk/services/all">https://www.ebi.ac.uk/services/all</a></td><td>Web 브라우저</td><td>무료로 사용할 수 있는 웹사이트, 도구 및 데이터 리소스의 포괄적인 목록</td></tr><tr><td>Expasy - Swiss Bioinformatics Resource Portal</td><td><a href="https://www.expasy.org">https://www.expasy.org</a></td><td>웹 브라우저</td><td>단백질 염기서열 분석을 위한 생물정보학 도구 및 리소스 제품군 스위스 생물정보학회(SIB)</td></tr><tr><td>국립생명공학정보센터(NCBI) 보존된 도메인 검색</td><td><a href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi</a></td><td>웹 브라우저</td><td>단백질 내에서 보존된 도메인을 식별하거나 뉴클레오티드 염기서열을 코딩하는 검색 도구</td></tr><tr><td>Pfam 35</td><td><a href="http://pfam.xfam.org">http://pfam.xfam.org</a></td><td>웹 브라우저</td><td>단백질 계열(Pfam) 데이터베이스는 정렬 및 분류를 제공합니다. 단백질 패밀리 및 도메인</td></tr><tr><td>PhyloCSF 트랙 허브 설명</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5QedaCd4ir8aZ65ryaD&amp; db=mm10& c=chr2& g=hub_109801_PhyloCSF_smooth"> https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTrackUi?hgsid=1267045267_TEc99h2oW5Q edaCd4ir8aZ65ryaD&db=mm10 &c=chr2&g=hub_109801_ PhyloCSF_smooth</a></td><td>웹 브라우저</td><td>Smoothed PhyloCSF 트랙 및 PhyloCSF 트랙 허브에 대한 자세한 설명 &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td>SignalP 6.0</td><td><a href="https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-6.0">https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? SignalP-6.0</a></td><td>웹 브라우저</td><td>신호 펩타이드의 존재 및 분열 부위의 위치를 예측</td></tr>합니다 <tr><td>TMHMM - 2.0</td><td><a href="https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0">https://services.healthtech.dtu.dk/service.php? TMHMM-2.0</a></td><td>웹 브라우저</td><td>단백질의 막관통 나선 예측</td></tr><tr><td>UCSC 게놈 브라우저 BLAT Search</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat</a></td><td>웹 브라우저</td><td>DNA 또는 단백질 염기서열 정보를 사용하여 게놈 영역을 찾는 데 사용되는 도구</td></tr><tr><td>UCSC 게놈 브라우저 게이트웨이</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway</a></td><td>웹 브라우저</td><td>UCSC 게놈 브라우저 게이트웨이에 대한 직접 링크</td></tr><tr><td>UCSC 게놈 브라우저 홈</td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/">https://genome.ucsc.edu/</a></td><td>웹 브라우저</td><td>UCSC 게놈</td></tr><tr><td>브라우저 트랙 데이터 허브</td> <td>홈 웹 사이트<a href="https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs">https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgHubConnect#publicHubs</a></td><td>웹 브라우저</td> PhyloCSF Tracks UCSC Genome Browser User Guide를 <td>검색하고 로드하기 위한 Track Data Hubs/Public Hubs 데이터베이스에 대한 직접 링크</td></tr><tr><td></td><td><a href="https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html">https://genome.ucsc.edu/goldenPath/help/hgTracksHelp.html</ a></td><td>웹 브라우저</td> UCSC Genome Browser WoLF PSORT<a href="https://wolfpsort.hgc.jp">https://wolfpsort.hgc.jp</a>Web browser 단백질 세포 내 국소화 예측 도구 <td>탐색 방법을 자세히 설명하는 포괄적인 사용자 가이드</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

마이크로단백질 동정 및 서열 분석을 위한 통합 접근법

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

차세대 염기서열 분석(NGS)은 유전체학 분야를 발전시키고 수많은 동물 종 및 모델 유기체에 대한 전체 게놈 서열을 생산했습니다. 그러나 이러한 풍부한 서열 정보에도 불구하고 포괄적 인 유전자 주석 노력은 특히 작은 단백질의 경우 도전적인 것으로 입증되었습니다. 주목할 만하게, 종래의 단백질 주석 방법은 게놈 전체에 걸쳐 기하급수적으로 더 많은 수의 스퓨리어스 비코딩 sORF를 걸러내기 위해 길이가 300개 미만인 짧은 오픈 리딩 프레임(sORFs)에 의해 코딩되는 추정 단백질을 의도적으로 배제하도록 설계되었다. 그 결과, 마이크로단백질(<100개 아미노산 길이)이라고 불리는 수백 개의 기능적 작은 단백질이 비코딩 RNA로 잘못 분류되거나 완전히 간과되었다.
여기서 우리는 진화적 보존에 기초한 마이크로단백질 코딩 잠재력에 대한 게놈 영역을 쿼리하기 위해 공개적으로 이용 가능한 자유롭고 공개적으로 이용 가능한 생물정보학 도구를 활용하는 상세한 프로토콜을 제공한다. 특히, 우리는 사용자 친화적 인 캘리포니아 산타 크루즈 대학 (UCSC) 게놈 브라우저에서 계통 발생 코돈 치환 주파수 (PhyloCSF)를 사용하여 서열 보존 및 코딩 가능성을 검사하는 방법에 대한 단계별 지침을 제공합니다. 또한, 우리는 아미노산 서열 보존을 시각화하고 예측 된 도메인 구조를 포함하여 마이크로 단백질 특성을 분석하기위한 자원을 권장하기 위해 확인 된 마이크로 단백질 서열의 여러 종 정렬을 효율적으로 생성하는 단계를 자세히 설명합니다. 이러한 강력한 도구는 비정준 게놈 영역에서 추정적 마이크로단백질 코딩 서열을 확인하거나 관심있는 비코딩 전사체에서 번역 잠재력을 갖는 보존된 코딩 서열의 존재를 배제하는 데 사용될 수 있다.

여기서는 검증된 마이크로단백질 미토레귤린(Mtln)을 예로 들어 보존된 sORF가 UCSC 게놈 브라우저에서 쉽게 시각화 및 분석할 수 있는 양성 PhyloCSF 점수를 생성하는 방법을 시연합니다. 미토레귤린은 이전에 비코딩 RNA (이전의 인간 유전자 ID LINC00116 및 마우스 유전자 ID 1500011K16Rik)로서 주석을 달았다. 비교 유전체학 및 서열 보존 분석 방법은 초기 발견 40,57,58,59,60,61에서 중요한 역할을했으며, 이러한 방법의 강도를 강조했습니다. 이 예에서는 마우스 GRCm38/mm10(2011년 12월)...

여기에 설명 된 프로토콜은 사용자 친화적 인 UCSC 게놈 브라우저에서 PhyloCSF를 사용하여 마이크로 단백질 코딩 잠재력에 대한 게놈 영역을 분석하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. 또한, 그들의 추정 기능에 대한 통찰력을 얻기 위해 확인 된 마이크로 단백질의 서열 특성을 더 조사하기 위해 몇 가지 도구와 자원이 권장됩니다.

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...

여기에 설명된 프로토콜은 사용자 친화적인 UCSC 게놈 브라우저에서 phyloCSF를 사용하여 단백질 코딩 잠재력에 대한 관심 게놈 영역을 분석하는 방법에 대한 자세한 지침을 제공합니다. PhloCSF는 현재 비코딩으로 주석이 달린 게놈 영역에서 마이크로단백질 코딩 잠재력을 갖는 보존된 짧은 개방 판독 프레임을 효과적으로 식별할 수 있다. 여기에 설명 된 방법은 쉽게 사용되며 생물 형성학 또는 비교 유전체학에 대한 사전 교육이나 전문 지식없이 모든 배경의 연구자가 구현할 수 있습니다.시작하려면 인터넷 브라우저 창을 열고 University of California Santa Cruz 또는 UCSC 게놈 브라우저로 이동하십시오. 도구 제목 아래에서 트랙 허브 옵션을 선택합니다. 공용 허브 탭에서 검색어 상자에 phyloCSF를 입력합니다.그런 다음 공개 허브 검색 버튼을 클릭하십시오. 허브 이름 phyloCSF에 대한 연결 버튼을 클릭하여 phyloCSF에 연결합니다. 연결을 클릭 한 후 UCSC 게놈 브라우저 게이트웨이 페이지로 리디렉션 될 때까지 기다립니다.다른 종을 쿼리하려면 찾아보기 아래에서 원하는 종을 선택하거나 해당 아이콘을 클릭하여 종 제목을 선택하거나 텍스트 상자에 종을 입력하고 종 공통 이름 또는 어셈블리 ID를 입력합니다.드롭다운 메뉴를 사용하여 정의된 위치 제목 아래에서 검색할 어셈블리를 선택한 다음 위치 또는 검색어 상자에 위치 유전자 기호 또는 검색어를 입력하고 이동을 클릭하여 탐색합니다. 게놈 브라우저에 관심있는 유전자에. 검색 결과 여러 일치 항목이 관심 위치를 선택해야하는 페이지로 리디렉션되기를 기다렸다면 관심있는 적절한 유전자를 클릭하십시오. UCSC 게놈 브라우저로 이동 한 후 특정 DNA 또는 단백질 서열을 쿼리하기 위해 도구 제목 아래에서 폭발과 같은 정렬 도구 또는 블랫을 선택하십시오.또는 도구 탭 위에 커서를 올려 놓고 blat 옵션을 선택하거나 주어진 링크를 따르십시오. 드롭 다운 메뉴를 사용하여 관심있는 종, 게놈 및 어셈블리를 선택하십시오. 그런 다음 쿼리 유형을 정의하고 관심있는 시퀀스를 blat 검색 게놈 텍스트 상자에 붙여 넣은 다음 제출을 클릭하십시오.그런 다음 작업 제목 아래의 브라우저 링크를 클릭하여 관심있는 게놈 영역으로 이동하십시오. 관심 게놈 영역을 시각적으로 스캔하여 필로CSF 영역을 긍정적으로 스코어링한다. 확대/축소 기능을 사용하여 관심 영역을 확대하여 시퀀스 특성을 검사하고 시작 및 정지 코돈을 검색합니다.수동으로 확대하려면 Shift 키를 누른 채 마우스 버튼을 누른 채 관심 영역을 따라 드래그합니다. 또는 페이지 위쪽에 있는 확대 및 축소 단추를 사용하여 탐색합니다. 뉴클레오티드 또는 염기서열이 보일 때까지 확대한다.양성 스코어링된 phyloCSF 영역의 시작과 끝 근처의 핵 조류 서열을 시각적으로 스캔하여 징벌적 시작 및 정지 코돈을 동정한다. 페이지 상단의 보기 제목 위에 마우스 커서를 놓고 다른 게놈 변환 옵션을 클릭한 다음 새 게놈 제목 아래의 드롭다운 메뉴를 사용하여 관심 있는 게놈을 정의합니다. 새 어셈블리 제목 아래에서 원하는 게놈 어셈블리를 선택하고 제출 버튼을 클릭합니다.브라우저가 유사성이있는 새 어셈블리의 지역 목록을 반환하면. 염색체 위치 링크를 클릭하여 관심 있는 상동 영역으로 이동합니다. 앞에서 설명한 탐색 전략에 따라 시퀀스를 분석합니다.유전자 설명 페이지로 이동하려면 UCSC 게놈 브라우저에서 gen 코드 트랙에서 관심있는 유전자를 클릭하십시오. 순서와 도구 및 데이터베이스 제목 링크에서 다른 종을 더 빨리 읽는 테이블의 링크를 클릭하십시오. 관심있는 종과 관련된 상자를 클릭하여 선택하십시오.그런 다음 제출을 클릭하십시오. 페이지 아래쪽에 나타나는 시퀀스를 복사하여 더 빠른 형식으로 워드 프로세싱 문서에 붙여넣습니다. 그런 다음 두 번째 브라우저 창을 열고 유럽 생물 정보학 연구소 웹 사이트에서 clustal omega 다중 시퀀스 정렬 도구로 이동하십시오.클립보드의 시퀀스 파일을 지원되는 형식으로 시퀀스를 읽는 단계 중 하나의 상자에 붙여넣습니다. 페이지 하단으로 스크롤하여 제출을 클릭하십시오. 각 아미노산의 보존 정도를 나타내는 기호에 대해 정렬 된 결과를 아래에서 관찰하십시오.아미노산 특성과 색상을 보려면 서열 바로 위에 표시된 색상 링크를 클릭하여 아미노산의 특성에 따라 색상을 지정합니다. 그런 다음 시퀀스 정렬을 복사하여 워드 프로세싱 또는 슬라이드 쇼 프로그램에 붙여 넣어 그림 또는 그림 파일을 생성합니다. clustal 오메가 결과 페이지에서 다른 출력을 보려면 탭 가이드 트리 또는 계통 유전 나무를 클릭하십시오.마지막으로 결과 뷰어의 탭을 클릭하여 jalview를 사용하여 시퀀스 정보를 보거나 mview 및 간단한 계통에 대한 직접 링크에 액세스 할 수있는 옵션을 확인하십시오. 미토레귤린 유전자의 대표적인 필로CSF 분석은 검증된 마이크로단백질에 상응하는 고서열 보존의 영역을 나타낸다. 완전한 미토레귤린 코딩 서열은 엑손 하나 내에 포함되어 있으며 필로CSF에서 하나의 트랙을 뺀 점수가 매우 높습니다.보존된 시작 코돈은 phyloCSF에서 하나의 트랙을 뺀 양의 스코어링 영역의 시작에서 관찰될 수 있다. 미토레귤린의 첫 번째 엑손에서 양성 점수 영역은 시작 코돈에 걸쳐 직접 시작되고 정지 코돈에서 종료된다. 여덟 개의 상이한 종에 대한 마이크로단백질 미토레귤린의 다중 서열 정렬이 여기에 제시되어 있다.긴 비코딩 RNA의 열풍 분석은 여섯 트랙 모두에 걸쳐 전체 유전자에 걸쳐 음성 스코어를 나타냈으며, 이는 서열 보존의 결여를 나타내고 열풍이 비코딩 RNA로서 정확하게 주석이 달린다는 것을 뒷받침한다. 마우스 하나, 여덟, 하나, 제로, 제로, 다섯, 여덟, I 24 리케 유전자의 PhyloCSF 분석은 보존된 개방 판독 프레임이 세 엑손에 걸쳐 있고 양성 필loCSF 스코어가 엑손 하나의 플러스 두 트랙에서 엑손 2의 플러스 세 트랙으로 점프한 다음, 엑손 셋에서 플러스 두 트랙으로 다시 점프한다는 것을 보여주었다. 하나의 유전자 유전자좌를 만나는 PhyloCSF 분석은 또한 단일 RNA 분자 내의 다수의 별개의 코딩 개방 판독 프레임을 확인하기 위해 효과적으로 사용되었다.긍정적 인 phyloCSF 점수는 마이크로 단백질 코딩 능력을 매우 암시하지만이 증거 라인은 단독으로 설 수 없으며 실험적으로 검증되어야한다는 점에 유의해야합니다. 일단 마이크로단백질의 기간이 확인되면, 아미노산 서열은 그의 기능에 대한 통찰력을 제공하기 위해 보존된 도메인 또는 서열 특성에 대해 분석될 수 있다. PhyloCSF는 이전에 비코딩으로 생각되었던 게놈 영역에서 새로운 마이크로 단백질을 확인하는데 효과적으로 사용되어 왔으며 앞으로의 마이크로 단백질 동정 연구에 계속 유용한 도구가 될 것입니다.

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Biology

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전기 분야의 응용 프로그램에 의해 전극의 배열에 - 디지털 Microfluidics는 개별 방울 (ML ~ NL)의 조작에 의해 특징 기법입니다. 그것은 빠른 속도, 순차, 소형 자동 생화학 assays을 수행에 적합합니다. 여기서 우리는 몇 가지 proteomic 처리 단계를 자동화 할 수있는 플랫폼을보고합니다.

자동 Proteomic 처리를위한 디지털 Microfluidics

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이 프로토콜은 바닷물에서 수집한 미생물 바이오매스에서 단백질과 DNA를 추출 및 농축한 후 탠덤 질량 분석 기반 단백질체 분석에 적합한 트립틱 펩타이드를 생성하기 위한 것입니다.

수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

여기에서 우리는 라벨 무료 양적 질량 분석을 사용하여 단백질 상관 프로파일 다음에 친 화성이 단백질 복합체의 정화 및 파란색 기본 페이지에서 자신의 분리를위한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 서로 다른 단백질 복합체에 상호 작용 체를 해결하는 데 유용합니다.

블루 기본 페이지와 단백질 상관 관계 프로파일 링에 의한 선호도 정제 단백질 복합체 해결

단백질 복합물의 건축은 그들의 기능을 위해 필수적입니다. 다양 한 대량 spectrometric 기법을 결합 하 여 그들의 어셈블리를 공부 하는 강력한 입증. 우리 화학 cross-linking 및 네이티브 질량 분석에 대 한 프로토콜을 제공 하 고 어떻게 이러한 상호 보완적인 기술을 다 소 단위 단백질 어셈블리의 구조를 명료 하 게 도움이 보여.

화학 Cross-linking 및 여러 소 단위 단백질 어셈블리의 건축을 그대로 단백질 복합물의 질량 분석

우리는 분할-BioID, 근접 라벨 기술 BioID에 따라 단백질 조각-보완성 분석 결과 대 한 단계별 프로토콜을 제공 합니다. 두 주어진된 단백질의 상호 작용 활성화, 그것은 그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 맞는 단백질 복합물의 proteomics 분석을 수 있습니다. 간단 하 고 비용 효율적인 메서드와 표준 실험실 장비에만 필요 합니다.

그들의 네이티브 셀룰러 환경에서 상황에 맞는 단백질 복합물의 분할-BioID-Proteomic 분석

여기에서는 질량 분석용 시료 를 제조하기 위한 온막 소화 기법을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술은 단백질-단백질 상호 작용의 편리한 분석을 용이하.

온-막 소화 기술을 사용한 단백질-단백질 상호 작용의 평가

마이크로톰을 이용한 다목적 저온 분석 BN-MS 프로토콜이 고분해능 복합체 프로파일링을 위해 제시된다.

BN-MS 분석에 의한 고분해능 컴플렉스 프로파일링

여기서 우리는 MALDI-TOF-TOF 탠덤 질량 분광법 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 사내에서 개발된 단백질을 신속히 서열화한 병원성 박테리아에 의해 생성되는 단백질의 신속한 식별을 위한 프로토콜을 제시합니다. 메타안정 단백질 이온 단편 때문에 아파르트산 효과 및 이러한 특이성은 단백질 식별을 위해 이용된다.

MALDI-TOF-TOF-MS/MS 및 하향식 프로테오믹 분석을 사용하여 대장균에 있는 항균 면역 단백질의 식별

임상 메타단백질체학(Clinical metaproteomics)은 인간 마이크로바이옴과 질병에 대한 기여에 대한 통찰력을 제공합니다. 당사는 Galaxy 플랫폼의 컴퓨팅 파워를 활용하여 복잡한 질량 분석 기반 메타단백질체 분석 및 질병 연구와 관련된 다양한 임상 샘플 유형의 특성화를 용이하게 하는 모듈식 생물정보학 워크플로우를 개발했습니다.

인간 질병의 기저에 있는 숙주-마이크로바이옴 상호작용을 분석하기 위해 Galaxy Bioinformatics 플랫폼 내에서 구현된 임상 메타단백질체학 워크플로우

배우세요 UCSC Genome Browser에서 PhyloCSF를 활용하여 마이크로단백질 코딩 가능성을 분석하는 생물정보학 프로토콜입니다. 비전문가도 쉽게 활용할 수 있는 이 방법은 보존된 짧은 개독서틀을 식별하여 유전체 연구를 확장합니다.

마이크로단백질 동정 및 서열 분석을 위한 통합 접근법

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