Name: 육계 병아리 배아에서 지방전구세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: 배우세요 육계 병아리 배아에서 지방전구세포를 분리하고 배양하는 방법을. Oil Red O 염색으로 지방분화 능력을 평가하여 조기 지방 성장과 대사 연구에 활용할 수 있습니다.

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저자는이 프로토콜을 지원하고 최적화 한 UT AgResearch와 동물 과학부에 감사드립니다. 이 작품은 USDA 보조금으로 지원되었습니다.

<ol><li>Fryar, C. D., Carroll, M. D., Ogden, C. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFryar%2C+CD+%22Prevalence+of+overweight%2C+obesity%2C+and+severe+obesity+among+children+and+adolescents+aged+2-19+years%3A+United+States%2C+1963-1965+through+2015-2016%22">Prevalence of overweight, obesity, and severe obesity among children and adolescents aged 2-19 years: United States, 1963-1965 through 2015-2016</a>. , (2018).</li>
<li>Siegel, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+the+modern+broiler+and+feed+efficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Animal+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Evolution of the modern broiler and feed efficiency.</a> Annual Review of Animal Biosciences. 2 (1), 375-385 (2014).</li>
<li>Zuidhof, M. J., Schneider, B. L., Carney, V. L., Korver, D., Robinson, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth%2C+efficiency%2C+and+yield+of+commercial+broilers+from+1957%2C+1978%2C+and+2005%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Growth, efficiency, and yield of commercial broilers from 1957, 1978, and 2005.</a> Poultry Science. 93 (12), 2970-2982 (2014).</li>
<li>Poulos, S. P., Dodson, M. V., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+models+for+differentiation%3A+preadipocytes+and+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell line models for differentiation: preadipocytes and adipocytes.</a> Experimental Biology and Medicine. 235 (10), 1185-1193 (2010).</li>
<li>Vilaboa, S. D. -A., Navarro-Palou, M., Llull, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age+influence+on+stromal+vascular+fraction+cell+yield+obtained+from+human+lipoaspirates%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Age influence on stromal vascular fraction cell yield obtained from human lipoaspirates.</a> Cytotherapy. 16 (8), 1092-1097 (2014).</li>
<li>Speake, B. K., Noble, R. C., McCartney, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+changes+in+lipid+composition+and+lipoprotein+lipase+activity+during+the+development+of+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29-Lipids+and+Lipid+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific changes in lipid composition and lipoprotein lipase activity during the development of the chick embryo.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Lipids and Lipid Metabolism. 1165 (3), 263-270 (1993).</li>
<li>Chen, P., Suh, Y., Choi, Y. M., Shin, S., Lee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+adipose+tissue+growth+through+hyperplasia+and+hypertrophy+in+the+embryonic+Leghorn+and+broiler%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of adipose tissue growth through hyperplasia and hypertrophy in the embryonic Leghorn and broiler.</a> Poultry Science. 93 (7), 1809-1817 (2014).</li>
<li>Farkas, K., Ratchford, I. A., Noble, R. C., Speake, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+size+and+docosahexaenoic+acid+content+of+adipocytes+during+chick+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Lipids%22%5BJournal%5D)">Changes in the size and docosahexaenoic acid content of adipocytes during chick embryo development.</a> Lipids. 31 (3), 313-321 (1996).</li>
<li>Claver, J. A., Quaglia, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+morphology%2C+development%2C+and+function+of+blood+cells+in+nonmammalian+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Exotic+Pet+Medicine%22%5BJournal%5D)">Comparative morphology, development, and function of blood cells in nonmammalian vertebrates.</a> Journal of Exotic Pet Medicine. 18 (2), 87-97 (2009).</li>
<li>Corning Cell Counter Demo Video. , Available from: 
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<li>Nema, R., Khare, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+animal+cell+culture%3A+Advance+technology+for+modern+research%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Bioscience+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">An animal cell culture: Advance technology for modern research.</a> Advances in Bioscience and Biotechnology. 3 (3), 219-226 (2012).</li>
<li>Regassa, A., Kim, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+oleic+acid+and+chicken+serum+on+the+expression+of+adipogenic+transcription+factors+and+adipogenic+differentiation+in+hen+preadipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biology+International%22%5BJournal%5D)">Effects of oleic acid and chicken serum on the expression of adipogenic transcription factors and adipogenic differentiation in hen preadipocytes.</a> Cell Biology International. 37 (9), 961-971 (2013).</li>
<li>Temkin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+crude+oil%2Fdispersant+mixture+and+dispersant+components+on+PPAR+%CE%B3+activity+in+vitro+and+in+vivo%3A+identification+of+dioctyl+sodium+sulfosuccinate+%28DOSS%3B+CAS%23+577-11-7%29+as+a+probable+obesogen%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Health+Perspectives%22%5BJournal%5D)">Effects of crude oil/dispersant mixture and dispersant components on PPAR γ activity in vitro and in vivo: identification of dioctyl sodium sulfosuccinate (DOSS; CAS# 577-11-7) as a probable obesogen.</a> Environmental Health Perspectives. 124, 112-119 (2016).</li>
<li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHausman%2C+DB+%22Adipose+Tissue+Protocols%22">Adipose Tissue Protocols</a>. , Springer. 201-219 (2008).</li>
<li>Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+protocol+to+maximize+differentiation+of+human+preadipocytes+and+improve+metabolic+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity%22%5BJournal%5D)">A modified protocol to maximize differentiation of human preadipocytes and improve metabolic phenotypes.</a> Obesity. 20 (12), 2334-2340 (2012).</li>
<li>Church, C. D., Berry, R., Rodeheffer, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+study+of+adipocyte+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Isolation and study of adipocyte precursors.</a> Methods in Enzymology. 537, 31-46 (2014).</li>
<li>Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+adipocyte-derived+extracellular+vesicles+using+filtration+and+ultracentrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation.</a> Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).</li>
<li>Perlman, D., Giuffre, N. A., Brindle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Fungizone+in+control+of+fungi+and+yeasts+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Society+for+Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Use of Fungizone in control of fungi and yeasts in tissue culture.</a> Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 106 (4), 880-883 (1961).</li>
<li>Kuhlmann, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+prophylactic+use+of+antibiotics+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">The prophylactic use of antibiotics in cell culture.</a> Cytotechnology. 19 (2), 95-105 (1995).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Black+swimming+dots+in+cell+culture%3A+the+identity%2C+detection+method+and+judging+criteria%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Black swimming dots in cell culture: the identity, detection method and judging criteria.</a> bioRxiv. , 366906(2018).</li>
<li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+animal+cells%3A+a+manual+of+basic+technique+and+specialized+applications%22">Culture of animal cells: a manual of basic technique and specialized applications</a>. , John Wiley & Sons. 163-186 (2015).</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

몇몇 잘 기술된 프로토콜이 지방전구세포14,15,16,17의 단리를 보고했지만, 배아 지방전구세포에 대한 단리가 최적화되었으며, 이는 육계 병아리의 초기 생활 지방 성장 및 발달의 기능적 분석에 사용될 수 있다. 이 프로토콜은 높은 분화 잠재력을 가진 높은 생존력 배아 지방세포 전구 인자를 산출한다. 또한, 지방전구세포를 분리하기 위한 제시된 절차는 배아에 한정되지 않고 부화 후 병아리에 사용될 수 있다. 그러나 E16 배아와 함께 사용하도록 최적화되었으며 부화 후 병아리의 수확량은 상당히 낮으며 (표 1), 병아리가 빠르게 성장함에 따라 결합 조직의 상대적 양이 증가하기 때문일 수 있습니다.
세포 분리의 성공은 궁극적으로...

비만은 성인과 어린이 모두에게 세계적인 건강 위협입니다. 과체중 또는 비만 인 어린이는 성인보다 비만 할 확률이 약 다섯 배 더 높기 때문에 심혈관 질환, 당뇨병 및 기타 많은 합병증에 걸릴 위험이 크게 증가합니다. 2-5 세 미국 어린이의 약 13.4 %가 비만1을 앓고 있으며, 과도한 체지방을 축적하는 경향이 매우 일찍 시작될 수 있음을 보여줍니다. 매우 다른 이유로, 과도한 지방 조직의 축적은 육계 (고기 유형) 닭에 대한 우려입니다. 현대 육계는 믿을 수 없을만큼 효율적이지만 생리적으로 필요한 것보다 더 많은 지질을 축적합니다 2,3. 이러한 경향은 부화 직후에 시작되어 가장 비싼 생산 구성 요소 인 사료를 근육 성장에서 멀리 할당하여 효과적으로 낭비합니다. 따라서 어린이와 육계 닭 모두에게 매우 다른 이유로 인해 지방 조직 발달에 영향을 미치는 요인을 이해하고 조기에 지방 확장을 제한하는 방법을 찾아야합니다.
지방세포는 지방전구세포로부터 형성되며, 분화를 겪는 지방조직 유래 줄기세포는 성숙하고 지질을 저장하는 지방세포를 발달시킨다. 따라서, 시험관 내 지방전구세포는 비만 연구를 위한 귀중한 실험 모델이다. 지방 데포의 기질 혈관 분획으로부터 분리 된이 세포는 지방 세포 분화 및 신진 대사 4,5를 조절하는 분자 경로에 대한 근본적인 이해를 제공 할 수 있습니다. 병아리 배아는 원하는 일정에 따라 난자를 배양하면 배아의 일련의 발달 단계를 관찰하기 위해 어머니의 희생없이 배아를 얻을 수 있기 때문에 실험 조작이 더 쉬워지기 때문에 발달 연구에서 유리한 실험 모델입니다. 또한, 복잡한 수술 절차와 긴 기간은 더 큰 동물 모델에 비해 배아를 얻을 필요가 없습니다. 따라서 병아리 배아는 지방 조직 발달의 초기 단계에서 지방세포를 얻을 수있는 기회를 제공합니다. 피하 지방 조직은 허벅지 주위에 위치한 명확하게 정의된 데포로서 배아 12일째(E12) 주위의 병아리에서 보이게 된다. 이 디포는 성숙한 지방세포를 형성하기 위해 발달 단서 하에서 분화를 활발히 겪는 고도로 증식성 전지방세포에서 풍부해진다 6,7. 아디포겐 분화 과정은 닭과 인간 사이에서 비교할 수 있습니다. 따라서, 병아리 배아로부터 분리된 지방전구세포는 인간 및 가금류와 관련된 연구를 위한 이중 목적 모델로서 사용될 수 있다. 그러나, 지방전구세포의 수율은 세포가 성숙한 지방세포로 성장함에 따라 노화에 따라 감소한다5.
본 프로토콜은 아디포겐 분화 및 지방세포 비대증이 육계 병아리 배아8에서 피크에 있는 단계(E16-E18) 동안 지방 조직으로부터 지방전구세포의 분리를 최적화한다. 이 절차는 암탉 식단과 같은 난소 식단과 같은 난소 발달 배아가 오보에 노출되는 요인이 지방세포 발달 및 아디포겐 잠재력 ex 생체에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 또한, 다양한 조작(예를 들어, 저산소증, 영양소 첨가, 약리학적 작용제 및 길항제)이 지방세포 전구물질의 지방발생 또는 다양한 '옴(예를 들어, 전사체, 대사체, 메틸롬)'에 미치는 영향을 시험할 수 있다. 지방 형성의 초기 단계를 나타내는 것으로,이 프로토콜을 사용하여 얻은 세포는 가금류 및 인간과 관련된 연구를위한 귀중한 모델입니다.

<table><tbody><tr><td>1 mL 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>Z683825</td><td>싱글 채널 피펫, 100 - 1000 &마이크로; L</td></tr><tr><td>1 mL 피펫 팁</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-402</td><td></td></tr><tr><td>100% 이소프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426P4</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>25 mL 플라스크</td><td>Pyrex</td><td>4980-25</td><td></td></tr><tr><td>37% 포름알데히드</td><td>Fisher Scientific</td><td>F75P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 플레이트</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>조직 배양 처리</td></tr><tr><td>96-웰 분석 플레이트</td><td>Costar</td><td>3632</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 플레이트, 블랙 하단</td><td>Costar</td><td>3603</td><td>조직 배양 처리</td></tr><tr><td>AdipoRed</td><td>Lonza</td><td>PT-7009</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Gibco 15290026</td><td></td><td></td></tr><tr><td>벤치 탑 와이퍼(Kimtechwiper)</td><td>킴벌리-클라크</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>베타딘</td><td>위로 & 최대</td><td>NDC 1167300334</td><td>20% 작동 용액</td></tr><tr><td>세포 계수기</td><td>Corning</td><td>6749</td><td></td></tr><tr><td>세포 여과기, 40 &마이크로; m</td><td>SPL</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugaton</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Chicken Serum</td><td>Gibco 16110082</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Conical Centrifuge Tubes, 15 mL</td><td>VWR</td><td>10025-690</td><td></td></tr><tr><td>Conical Centrifuge Tubes, 50 mL</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial</td><td>Nunc</td><td>343958</td><td></td></tr><tr><td>Curved Forceps, 100 mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5137</td><td></td></tr><tr><td>곡선형 수술용 가위, 115mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6839</td><td></td></tr><tr><td>증류수</td><td>Millipore</td><td>SYNSV0000</td><td>필요에 따라 분배</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>HyClone</td><td>SH30023.01</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td></td><td>Sigma D2650</td><td></td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td>70% 작동 솔루션</td></tr><tr><td>소 태아 혈청 (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>형광 현미경</td><td>EVOS</td><td>M7000</td><td></td></tr><tr><td>형광판 판독기</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>호일</td><td>Reynolds</td><td></td><td>Reynolds 랩 헤비 듀티 알루미늄 호일, 125 평방 피트.</td></tr><tr><td>냉동 용기</td><td>Thermo Scientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>Millipore</td><td>4055</td><td>2% 작업 용액</td></tr><tr><td>혈구분석기(계수 챔버)</td><td>Corning</td><td>480200</td><td>0.1mm 깊이</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>Fisher Scientific</td><td>6845</td><td></td></tr><tr><td>기기 살균기</td><td>VWR</td><td>B1205</td><td></td></tr><tr><td>리놀레산-올레산 산 알부민</td><td>Sigma</td><td>L9655</td><td>1x 작업 솔루션</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Evos</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>멀티 채널 피펫</td><td>Thermo Scientific</td><td>4661070</td><td>12채널 피펫, 30 - 300 &마이크로; L</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-7907</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma</td><td>S-3139</td><td></td></tr><tr><td>NucBlue</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td></td></tr><tr><td>오일 레드 O</td><td>시그마</td><td>O-0625</td><td></td></tr><tr><td>오비탈 셰이커</td><td>IKA</td><td>KS130BS1</td><td></td></tr><tr><td>종이 타월</td><td>Tork</td><td>RK8002</td><td></td></tr><tr><td>파라필름</td><td>파라필름 M</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스텝토마이신(P/S)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>1x 작업 용액</td></tr><tr><td>페트리 접시, 100mm</td><td>팔콘</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시, 60mm</td><td>팔콘</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>플레이트 셰이커</td><td>VWR</td><td>200</td><td></td></tr><tr><td>RBC 용해 버퍼</td><td>Roche</td><td>11814389001</td><td></td></tr><tr><td>시약 Reservior</td><td>VWR</td><td>89094-680</td><td></td></tr><tr><td>소형 비커, 100mL</td><td>Pyrex</td><td>1000-100</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계 플레이트 리더</td><td>Biotek</td><td>Synergy H1</td><td></td></tr><tr><td>멸균 거즈</td><td>McKesson 762703</td><td></td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 펜셋, 120mm</td><td>Roboz 수술</td><td>RS-4960</td><td></td></tr><tr><td>스트레이트 가위, 140mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-6762</td><td></td></tr><tr><td>T-25 플라스크</td><td>코닝</td><td>430639</td><td>조직 배양 처리</td></tr><tr><td>조직 배양 인큐베이터</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>조직 스트레이너, 250 &마이크로; m</td><td>Pierce</td><td>87791</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td>0.1% 작업 용액</td></tr><tr><td>핀셋, 110mm</td><td>Roboz Surgical</td><td>RS-5035</td><td></td></tr><tr><td>Type 1 Collagenase</td><td>Gibco</td><td>17100017</td><td></td></tr><tr><td>수조</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-462-10</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 급료 1 여과지</td><td>Whatman</td><td>1001-110</td><td></td></tr></tbody></table>년

육계 병아리 배아에서 지방전구세포의 분리

Isolation of Preadipocytes from Broiler Chick Embryos

일차 지방전구세포는 지방세포 분화 및 신진대사를 조절하는 분자 경로를 이해하는 데 유용한 실험 시스템이다. 닭 배아는 지방 발달의 초기 단계에서 지방 전구세포를 분리 할 수있는 기회를 제공합니다. 이 일차 세포는 지방세포 증식 및 아디포제닉 분화에 영향을 미치는 인자를 확인하는 데 사용될 수 있으며, 이는 어린 시절의 비만 및 가금류의 과도한 지방 침착 조절과 관련된 연구에 유용한 모델이 될 수 있습니다. 산후 지방 조직의 급속한 성장은 육계 닭의 근육 성장에서 멀리 할당함으로써 사료를 효과적으로 낭비합니다. 따라서 지방 조직 발달의 초기 단계를 이해하는 방법은 이러한 경향을 조절하고 삶의 초기에 지방 확장을 제한하는 방법을 식별하는 단서를 제공 할 수 있습니다. 본 연구는 상업적 육계(육류형) 병아리 배아의 지방조직 개발로부터 분리된 지방전구세포의 분리, 일차 배양 및 아디포제닉 분화를 위한 효율적인 방법을 개발하기 위해 고안되었다. 이 절차는 높은 생존력 (~ 98 %)을 가진 세포를 산출하고 성숙한 지방세포로 분화 할 수있는 능력을 증가시키도록 최적화되었습니다. 배아 지방세포 분리, 배양 및 분화의 이 간단한 방법은 초기 생활에서 지방 성장과 발달의 기능적 분석을 지원합니다.

일차 지방전구세포는 형태학적으로 섬유아세포와 유사하며, 불규칙하고 별과 같은 모양과 중심 핵을 가지고 있다(도 2A-C). 세포는 조직 배양 플라스틱에 쉽게 부착되고 부착 직후에 증식하기 시작합니다. 그들은 신속하게 분화하고 배지에 지방산이 제공 될 때 지질 방울을 축적합니다 (그림 3D). 여기에 제시된 단리에서 보고된 생존력(98%, 염료 배제에 기초함)이 전형적이다. 세포는 상당히 견고하지만, 분리 중에 공격적인 취급은 세포 손상을 초래하며(그림 3E), 제대로 부착되지 않고 증식에 실패하는 세포를 산출합니다. 미생물 오염을 방지하기 위해 혼입된 절차에도 불구하고, 비멸균 물질의 이송이 발생할 수 있다(도 3F). 그들의 급속한 성장 속도 때문에, 병아...

본 프로토콜은 육계 배아에서 지방 조직으로부터 지방전구세포를 단리하는 간단한 방법을 기술한다. 이 방법은 고수율, 일차 배양 및 지방전구세포의 아디포제닉 분화로 단리를 가능하게 한다. Oil Red O 염색 및 지질/DNA 염색은 분화 배지로 유도된 분리된 세포의 아디포겐 능력을 측정했습니다.

Primary preadipocytes are a valuable experimental system for understanding the molecular pathways that control adipocyte differentiation and metabolism. ...

일차 지방전구세포는 지방세포 대사를 조절하는 분자 경로를 이해하는 데 유용한 실험 시스템이다. 닭 배아는 지방세포 발달의 초기 단계에서 지방세포를 분리할 수 있는 기회를 제공한다. 이 방법은 높은 생존력과 성숙한 지방세포로 분화 할 수있는 능력을 가진 세포를 산출하도록 최적화되었으며, 이는 병아리의 초기 생활 지방 성장 및 발달 배아의 기능적 분석에 사용될 수 있습니다.아디포제닉 분화 과정은 닭과 인간 사이에서 매우 비슷합니다. 따라서, 단리된 지방전구세포는 인간 및 가금류와 관련된 연구를 위한 이중 제안 모델로서 사용될 수 있다. 배아 몸을 70 % 에탄올로 면봉하기 시작하십시오.그런 다음 소화 후 이후 단계에서 여과 중 간섭을 방지하기 위해 멸균 거즈로 피부 표면을 부드럽게 문질러 깃털을 제거했습니다. 그런 다음 다리와 복부 사이의 피부를 잘라 대퇴골 지방 창고 쌍을 드러냅니다. 한 손으로 구부러진 포셉을 사용하여 다리 주위의 피부를 잡고 대퇴골 피하 지방을 부드럽게 제거하십시오.다른 한편으로는. 나중에 구부러진 포셉을 사용하여 디포를 다리에서 부드럽게 당깁니다. 조직을 5 밀리리터의 수집 매체가 들어있는 15 밀리리터 튜브로 옮기고 지방 패드의 다른쪽에 대해 해부를 반복하십시오.이제 수집 된 지방 패드를 살균 용액이 들어있는 60 밀리미터 페트리 접시에 옮기고 접시를 몇 번 소용돌이 치면서 간단히 헹구십시오. 그런 다음 지방 패드를 PBS가 들어있는 60 밀리미터 페트리 접시로 옮겨 멸균 용액을 헹구십시오. 플레이트를 부드럽게 소용돌이 치며 다시 PBS로 씻으십시오.지방 조직의 소화를 위해, 미리 따뜻한 효소 용액을 함유 한 15 밀리미터 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브에 한 쌍의 긴 직선 가위를 담그고 마지막으로 용액의 지방 조직을 가능한 한 작은 조각으로 다듬습니다. 다진 조직과 효소 용액을 25 밀리리터 오토클레이브 플라스크에 옮깁니다.플라스크를 파라핀 필름으로 감싸고 플라스크를 소화를 위해 섭씨 37도의 궤도 쉐이커 인큐베이터에 놓습니다. 소화 후, 부드럽게 위아래로 피펫을 부드럽게 섞어 잘 섞는다. 그런 다음 250 마이크로 미터 조직 스트레이너를 통해 피펫팅하여 15 밀리리터 튜브로 여과하여 소화되지 않은 조직과 파편을 제거하십시오.이제 플라스크를 네 밀리리터의 성장 배지로 헹구어 플라스크에 부착된 세포를 제거하고 세포 현탁액을 동일한 15밀리리터 튜브로 여과합니다. 다음으로 성장 배지를 다시 피펫팅하여 스트레이너를 헹구어 필터에 갇힌 세포를 제거하십시오. 실온에서 5분 동안 300배 G에서 원심분리하여 세포 분획을 펠릿화하고 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 흡인한다.펠렛을 한 밀리리터의 적혈구 용해 완충액에 부드럽게 재현탁시키고, 피펫팅에 의해 잘 혼합하고, 실온에서 다섯 분 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 세포를 포함하는 튜브에 다섯 밀리리터의 성장 배지를 첨가하여 세포를 희석하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합하십시오. 이제 세포를 40 마이크로 미터 셀 스트레이너 위에 피펫하고 새로운 50 밀리리터 튜브로 여과하십시오.그런 다음 추가로 다섯 밀리리터의 성장 배지로 스트레이너를 헹구고 실온에서 7분 동안 300배 G에서 원심분리하여 세포를 펠릿화한다. 조심스럽게 상청액을 흡인하십시오. 나머지 세포 펠릿을 피펫팅에 의해 1 밀리리터의 성장 배지에 재현탁시켜 세포 밀도 및 생존력을 결정하기 위해, 피펫팅에 의해 트리판 블루에 각 샘플의 10 마이크로리터를 혼합한다.혼합물 10 마이크로리터를 혈구측정기에 로딩하고 세포를 계수한다. 24, 48, 및 72시간 후의 지방전구세포의 분석은 정상 세포 형태 및 수를 나타내었다. 지방전구세포의 아디포겐 유도는 지질 방울의 빠른 분화 및 축적을 보였다.분리 동안 지방전구세포의 공격적인 취급은 세포 손상과 낮은 세포 수를 초래했다. 미생물 오염은 예방 조치를 취함에도 불구하고 관찰 될 수 있습니다. 오일 레드 O를 사용한 지질 염색은 지방전구세포가 24, 48, 및 72시간에서 관찰된 바와 같이 시간에 따라 아디포겐 유도하에 지질 방울을 빠르게 발달시키기 시작하고 축적이 진행됨을 나타내었다.세포 수에 대한 지질 축적을 지질 및 DNA 염색을 사용하여 정량화하였다. 지질 축적과 세포 증식 둘 다 시간이 지남에 따라 증가하였다. 낮은 세포 수 또는 손상된 세포는 조직 분획이 너무 오래 소화될 때 관찰될 수 있다.따라서 소화 시간이 한 시간 반 이상 지속되지 않는 것이 좋습니다. 단리된 지방전구세포는 유전자 발현 연구에 사용될 수 있다. cDNA 합성 및 후속 qPCR 또는 RNAseq에 사용하기 위해 충분한 RNA를 수득할 수 있다.

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연구

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육계 병아리 배아에서 지방전구세포의 분리

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