Name: In Situ 표면 강화 라만 분광법 특성화를 위한 플라즈몬 나노입자의 광학 트래핑 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T12:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 19 s
Description: 배우세요 광학 트래핑과 SERS를 결합한 플라즈몬 나노입자 조립법을 통해 생리학적 조건에서 민감한 바이오마커 검출을 수행하는 방법을 익히세요. 이 기술은 응집제 없이 50배 향상된 신호를 제공합니다.

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1. 광학 설정
<ol><li>532nm 레이저 빔(라만 여기 소스)을 광학 핀셋 현미경의 플렉스 포트로 향하게 합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>532nm 레이저 빔을 750nm 장편 다이크로익 미러를 사용하여 광학 핀셋 현미경의 스테레오 이중층 경로에 정렬하여 원래의 트래핑 레이저 빔과 결합하여 샘플 챔버에 초점을 맞춥니다.</li>
	<li>750nm 장편 다이크로익 미러를 사용하여 샘플 챔버에서 후방 산란광을 수집하고 액체-질소 냉각 전하 결합 장치(CCD) 카메라가 포함된 분광계로 리디렉션합니다( 재료 표 참조). 스펙트럼 획득 전에 분광계의 입구 슬릿 앞에 532nm 노치 필터를 배치합니다. 알림: 레이저를 켤 때는 보안경을 사용해야 하며 레이저 빔은 안전한 장소에 있어야 합니다.</li>
</ol>2. AgNP의 제조
<ol><li>둥근 바닥 플라스크에서 1mMAgNO3 수용액 50mL를 가열하면서 가열합니다.</li>
	<li>끓인AgNO3 수용액에 0.1 M 시트르산삼나트륨 용액 1.0 mL를 적가한다.</li>
	<li>혼합물을 일정한 교반하에 16 분 동안 끓여있다.</li>
	<li>혼합물을 실온으로 식힌다. 황색이 관찰됩니다.</li>
	<li>AgNP 콜로이드를 실온에서 5 분 동안 2000×g으로 원심분리한 다음 피펫을 사용하여 상층액을 제거한다.</li>
	<li>AgNP 콜로이드를 1mL의 탈이온수(저항률 18.2MΩCM)로 재현탁합니다.</li>
	<li>2.5단계와 2.6단계를 세 번 반복하여 잔류 환원제를 제거합니다.</li>
	<li>주사전자현미경(SEM) 및 동적 광산란(DLS)33 을 사용하여 AgNP의 크기 분포를 특성화하여 AgNP의 균일성을 확인합니다(그림 2). AgNP 농도는 UV 흡광도34에 의해 0.1 nM로 추정되었다. 참고: 농도가 낮기 때문에 AgNP 스톡 용액은 2-3주 동안 클러스터링 없이 유지될 수 있습니다. 안정화제가 필요하지 않습니다. AgNP 스톡 용액에서 침전물이 관찰되면, 상기 프로토콜에 따라 새로운 AgNP 용액을 제조하였다.</li>
</ol>3. DSNB 분석물 분자와 AgNP의 상호작용
<ol><li>1mL의 AgNP 콜로이드에 200μL의 2mM DSNB ( 재료 표 참조)를 첨가하고 실온에서 3 시간 동안 배양하여 AgNP와 DSNB35 사이의 Ag-S 결합 형성에 의해 AgNP 표면 상에 DSNB 층을 코팅한다. 이 상호 작용의 도식적 표현이 그림 3에 나와 있습니다.</li>
	<li>AgNP를 실온에서 5 분 동안 2,000×g으로 원심분리하고 상층액을 제거한다.</li>
	<li>AgNP-DSNB를 1mL의 탈이온수로 재현탁시킨다.</li>
	<li>3.2단계와 3.3단계를 세 번 반복하여 과도한 DSNB를 제거합니다.</li>
	<li>AgNP 콜로이드 및 AgNP-DSNB 용액의 UV 가시광선 스펙트럼을 기록한다. 참고: 이 스펙트럼은 약 420nm에서 450nm로의 흡수 피크 이동을 보여 AgNP 표면에 DSNB가 성공적으로 코팅되었음을 나타냅니다(그림 3).</li>
</ol>4. SERS 측정을 위한 시료 챔버 준비 및 AgNP 어셈블리 생성
<ol><li>유리 슬라이드와 커버슬립을 물과 에탄올로 청소합니다.</li>
	<li>프레임 테이프(두께 0.25mm, 재료 표 참조)를 유리 슬라이드에 부착하여 챔버(길이 1.0cm, 너비 1.0cm× 높이 0.25mm×)를 만듭니다.</li>
	<li>AgNP-DSNB 용액 몇 방울 (약 25 μL)을 프레임에 추가합니다.</li>
	<li>커버슬립을 프레임 테이프에 놓고 밀봉합니다(그림 4).</li>
	<li>온도가 -120 ° C에 도달 할 때까지 액체 질소 냉각 CCD 카메라의 용기에 액체 질소를 추가합니다.</li>
	<li>자기 레이저 안전 스크린( 재료 표 참조)을 사용하여 라만 프로브 빔 경로를 차단한 다음 532nm 라만 여기 소스 레이저를 켭니다.</li>
	<li>AgNP-DSNB 용액으로 샘플 챔버를 챔버 홀더에 고정합니다. 그림 1과 같이 물에 잠긴 대물렌즈(60x 배율, 1.2 개구 A 1.2)에 물을 추가합니다. 그런 다음 챔버 홀더를 대물렌즈 위의 마이크로 스테이지에 즉시 놓습니다.</li>
	<li>커버슬립 위에 이멀젼 오일을 떨어뜨리고 오일 액침 콘덴서를 배치하여 현미경 카메라에서 입자를 시각화합니다.</li>
	<li>현미경 카메라에 흰색 점이 표시될 때까지 532nm 라만 프로브 빔이 챔버의 바닥 유리 표면에 초점을 맞출 때까지 현미경 손잡이를 돌려 대물렌즈의 Z 위치를 조정합니다(그림 5).<ol><li>마이크로 스테이지의 X 및 Y 위치를 조정하여 챔버의 중앙 영역을 흰색 지점에 배치하도록 챔버를 이동합니다. 광학 핀셋 제어 소프트웨어( 재료 표 참조)를 열고 장착된 조이스틱 컨트롤을 사용하여 1064nm 트래핑 레이저(광학 핀셋 시스템에서 빨간색 원으로 표시됨)를 흰색 점과 겹치도록 이동합니다(그림 5).</li>
		<li>그런 다음 현미경의 손잡이를 조정하여 대물렌즈의 Z 위치를 위로 이동합니다. 참고: 현미경 카메라 이미지에서 흰색 점이 사라지면 532nm 라만 프로브 빔이 챔버 내부에 초점을 맞추고 있음을 나타냅니다.</li>
	</ol></li>
	<li>1064nm 트래핑 레이저를 켜서 샘플 챔버에서 AgNP를 끌어당기고 플라즈몬 AgNP 어셈블리를 생성합니다. 참고: AgNP가 모이면 샘플 챔버에 어두운 점이 생깁니다(그림 6B).<ol><li>필요한 경우 과열 또는 기포 형성을 방지하기 위해 트래핑 레이저 빔을 낮추십시오. 알림: AgNP 어셈블리의 명백한 형성이 없는 경우 트래핑 레이저 출력과 조사 시간을 늘리십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>분광 측정을 위해 플라즈몬 AgNP 어셈블리의 다크 스팟을 532nm 라만 프로브 빔의 초점 아래에 배치하도록 샘플 마이크로스테이지의 위치를 조정합니다.</li>
	<li>중성 밀도(ND) 필터를 532nm 라만 레이저 배출구 앞에 배치하여 전력을 10mW로 조정합니다. 스펙트럼 소프트웨어(재료 표 참조)의 설정 패널에 획득 시간(본 연구의 경우 10초, 그림 6)을 입력하고 획득 버튼을 클릭하여 스펙트럼 획득을 시작합니다. 참고: 이것은 분석물 분자의 SERS 스펙트럼을 생성합니다(대표 결과의 DSNB 및 그림 6).</li>
</ol>

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본 연구는 현장 분자 특성화를 위해 광학 트래핑과 SERS 검출을 결합한 분석 플랫폼을 보고합니다. 532nm 라만 프로브 빔을 스테레오 이중층 경로를 통해 1064nm 트래핑 레이저 빔과 결합하여 후방 산란 형상에서 추가 분광 측정을 위해 초점을 결합하고 수집했습니다. 트래핑 레이저 빔은 AgNP를 조립하여 플라즈몬 핫스팟을 형성한 다음 라만 프로브 레이저 빔을 여기시켜 용액 내 분석물 분자의 SERS 신호를 생성합니다. 개념 증명으로 DSNB의 검출이 시연되었으며, 이는 AgNP의 표면에 코팅되었습니다. 트래핑 레이저 빔에 의해 제어되는 AgNP 어셈블리 영역에서, 주변의 분산된 AgNPs에 비해 DSNB의 신호가 약 50배 향상되었다. 제시된 플랫폼 상의 용액상 SERS 측정에서 분석물 분자의 유사한 고신호 증폭이 재현 가능하게 얻어졌다.
SERS 신호 증폭에 영향을 미치는 중요한 단계는 광학 트래핑 유도 AgNP 어셈블리를 형성하는 것입니다. 분석물 분자의 SERS 신호는 트래핑 레이저 출력, 조사 시간 및 AgNP 농도와 같은 실험 파라미터를 미세 조정하여 최적화할 수 있습니다. 도 8에 도시된 바와 같이, 더 높은 트래핑 레이저 파워를 사용하면 AgNP 어셈블리 형성의 효율을 높일 수 있다. 재현 가능한 AgNP 어셈블리는 트래핑 레이저의 출력을 450mW에서 700mW로 증가시켜 얻었습니다. 그러나, 950 mW보다 높은 트래핑 레이저 출력은 과열 및 버블 생성을 유도할 수 있다(38). 따라서 동적 AgNP 어셈블리를 만들기 위해 적당한 트래핑 레이저 출력이 권장됩니다. 유사하게, 더 긴 조사 시간은 AgNP 어셈블리의 형성을 촉진하는 데 유용합니다. 도 8B 는 조사 시간이 5-20초에서 증가하였을 때 투명한 구형 AgNP 조립체가 형성되었음을 보여준다. 그러나, AgNP 어셈블리는 60 초 조사 후에 왜곡되었다. 또한, AgNP 어셈블리의 형성은 도 8C에 도시된 바와 같이, 0.25nM에서 빠르게 과열된 반면, 0.01nM에서 0.05nM로 더 높은 AgNP 농도에서 가속화되었다. 명백한 AgNP 어셈블리 형성이 없는 경우 트래핑 레이저 출력과 조사 시간을 늘리는 것이 좋습니다. 안정적인 AgNP 어셈블리가 생성되면 잠재적인 열 손상을 방지하기 위해 트래핑 레이저를 낮추어야 합니다.
광학 트래핑-유도된 AgNP 어셈블리의 SERS 활성은 도 6B에서 다크 스팟인 트래핑 레이저 조사 영역에서의 국소 AgNP 농도의 증가에 기인하였다. 유체 AgNP 용액에서 광학 트랩은 AgNP를 지속적으로 끌어 당겨 입자 간 접합의 제한된 공간에 플라즈몬 핫스팟을 축적하고 형성 할 수 있습니다. 이것은 SERS 효과를 향상시키는 향상된 전기장을 생성합니다. 도 6E에 도시된 바와 같이, 트래핑 레이저 없이 더 낮은 AgNP 농도(0.05nM)에서 획득된 약한 SERS 신호와 비교하여 더 높은 AgNP 농도(1.00nM)에서 얻어진 더 강한 SERS 신호에 의해 추가로 검증되었다.
또한, 광학 트래핑에 의한 브라운 운동에 대한 용액 내 플라즈몬 AgNP 어셈블리의 위치 제어는 SERS 측정의 효율성과 안정성을 크게 향상 시켰습니다. 고처리량 감지는 미세유체 시스템에 연결될 때 수행될 수 있습니다. SERS 활성 기질을 생성하기 위해 나노 입자의 전통적인 염 유도 응집과 비교할 때, 당사의 플랫폼은 설계된 위치와 순간에서 높은 유연성26,28로 플라즈몬 AgNP 어셈블리의 동적 형성을 허용합니다. 또한 나노몰 AgNP 농도에서 효율적으로 작동하며 용액의 현장 분광 측정을 위해 SERS 활성 핫스팟의 공간-시간 조작을 가능하게 합니다. 이 동적 AgNP 어셈블리는 트래핑 레이저가 꺼지면 몇 분 안에 점차적으로 분해됩니다. 트래핑 레이저가 없으면 추가 그림 1과 같이 AgNP 어셈블리가 20분 만에 거의 사라졌습니다. 이는 검출 시스템에 미치는 영향을 최소화할 수 있으며 다양한 생체 응용 분야, 특히 생리학적 및 생체 내 조건에서 생체 분자(DNA, RNA 및 단백질)의 검출에 큰 잠재력을 나타냅니다. 그러나, 이러한 동적 AgNP 어셈블리는 염-유도된 AgNP 응집체2보다 더 작은 강화 인자를 제공하므로, 추가의 변형 및 개발이 요구된다.
결론적으로, 광학 트래핑과 SERS 검출의 통합은 플라즈몬 나노입자를 제어하고 재현 가능한 SERS 신호 향상을 달성하여 고효율, 안정성 및 생체 적합성을 가진 용액에서 분석물 분자를 검출하는 편리한 방법을 제공합니다.

표면 강화 라만 분광법(SERS)은 초저 농도 또는 단일 분자 수준 1,2,3,4에서 표적 분자의 화학 구조를 직접 검출하기 위한 민감한 분석 기술입니다. 레이저 조사는 표적 분자의 라만 신호를 증폭하기 위해 SERS 기질로 사용되는 금속 나노 구조에서 국부적 인 표면 플라즈몬 공명을 유도합니다. 염-유도된 나노입자 응집체는 널리 사용되는 SERS 기질이며, 이는 콜로이드 현탁액 5,6에서 자발적으로 브라운 운동을 겪는다. 추가 건조로 안정적인 SERS 측정이 가능합니다. 그러나, 불순물 농도가 발생할 수 있으며, 이는 배경 소음을 발생시키고생물학적 샘플에 돌이킬 수 없는 손상을 일으킨다7. 따라서 무염 나노 입자 응집체를 개발하고 용액에서의 움직임을 제어하며 측정 효율성을 유지하면서 생체 적합성을 개선하는 것이 적절합니다.
광학 트래핑은 다양한 금속 기판을 제어하고 SERS 검출 8,9,10,11,12,13,14를 용이하게하기 위해 채택되었습니다. 광학 트랩은 레이저 빔을 단단히 집중시켜 광학 힘장을 생성함으로써 생성되며, 이는 초점(15,16) 주위의 가장 높은 강도 영역으로 작은 물체를 끌어당깁니다. 최근에, 광학 트랩은 다양한 응용 분야를위한 재현 가능하고 민감한 플라즈몬 감지 플랫폼을 개발하는 데 사용되어 용액 17,18,19,20,21,22,23,24에서 SERS 활성 금속 나노 구조의 위치를 찾고 제어하는 데있어 고유 한 이점을 보여줍니다. . 본 프로토콜은 광학 핀셋과 라만 분광-현미경을 결합하여 은 나노입자(AgNP)를 동적으로 조립하고 효율적인 SERS 측정을 위해 용액에서 브라운 운동에 대해 안정화하는 접근 방식을 도입합니다. AgNP 조립 영역에서, AgNP의 표면에 코팅 된 분석 물 분자 인 3,3'- 디티 오비스 [6- 니트로 벤조산] 비스 (숙신이 미드) 에스테르 (DSNB)의 신호는 약 50 배 향상 될 수있다. 이 접근법은 화학적 캡핑 제25,26,27과 호환되지 않는 민감한 생체 분자를 분석하는데 적합하다. 또한 SERS 활성 AgNP 어셈블리를 생성하기 위한 공간 및 시간 제어를 제공합니다. 이를 통해 수성 환경에서 현장 검출이 가능하여 AgNP의 사용량을 줄이고 생체 내 분석28,29,30의 섭동을 최소화할 수 있습니다. 또한, 광학 트래핑-유도된 AgNP 어셈블리는 안정하고, 재현가능하며, 가역적이다(31,32). 따라서 용액 및 염으로 인한 응집이 적용되지 않는 생리학적 조건에서 분석물 분자를 검출하기 위한 유망한 플랫폼입니다.
본 연구에서는 입자의 광학 조작 및 시각화를 위해 1064nm 트래핑 레이저, 힘 감지 모듈 및 명시야 조명 소스가 광학 핀셋 현미경 시스템에 통합됩니다. 532nm 라만 프로브 레이저도 현미경에 통합되어 샘플 챔버의 트래핑 레이저와 정렬되었습니다. 스펙트럼 획득을 위해 후방 산란광을 수집하여 분광계로 방향을 바꿨습니다(그림 1).

<table><tbody><tr><td>1064 nm 트래핑 레이저</td><td>IPG Photonics, 미국</td><td>1064 nm CW Yb 섬유 레이저, 10W</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-Dithiobis[6-니트로벤조산] bis(succinimide) 에스테르&nbsp;</td><td>Biosynth Carbosynth</td><td>FD15467</td><td></td></tr><tr><td>532nm 라만 여기 소스</td><td>CNI, 중국</td><td>MLL-III-532</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake 소프트웨어</td><td>LUMICKS, 네덜란드</td><td>버전 1.6.12</td><td>광학 핀셋 제어 소프트웨어</td></tr><tr><td>프레임 테이프</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc</td><td>AB-0576</td><td></td></tr><tr><td>침지 오일</td><td>Cargille Laboratories, Inc</td><td>16482</td><td></td></tr><tr><td>액체 질소 냉각 전하 결합 소자(CCD) 카메라</td><td>Teledyn Princeton Instrument, 미국</td><td>400B eXcelon</td><td></td></tr><tr><td>Long-pass dichroic mirror</td><td>AHF, 독일</td><td>F48-801</td><td></td></tr><tr><td>자기 레이저 안전 스크린</td><td>ThorLabs</td><td>TPSM2</td><td></td></tr><tr><td>광학 핀셋 현미경</td><td>LUMICKS, 네덜란드</td><td>m-trap</td><td></td></tr><tr><td>질산은</td><td>Sigma-Aldrich 중국주식회사</td><td>S8157</td><td></td></tr><tr><td>분광계</td><td>Teledyn 프린스턴 기기, 미국</td><td>IsoPlane SCT-320</td><td></td></tr><tr><td>구연산 삼나트륨</td><td>시그마 - Aldrich China, Inc.</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>WinSpec 소프트웨어</td><td>Teledyn Princeton Instrument, 미국</td><td>버전 2.6.24.0</td><td>스펙트럼 소프트웨어</td></tr></tbody></table>

in situ 표면 강화 라만 분광법 특성화를 위한 플라즈몬 나노입자의 광학 트래핑

Optical Trapping of Plasmonic Nanoparticles for In Situ Surface-Enhanced Raman Spectroscopy Characterizations

표면 강화 라만 분광법(SERS)은 금속 나노구조의 향상된 전기장으로 인해 다양한 응용 분야에서 분석물 분자의 초고감도 검출을 가능하게 합니다. 염 유도은 나노 입자 응집은 SERS 활성 기질을 생성하는 가장 보편적 인 방법입니다. 그러나 재현성, 안정성 및 생체 적합성이 좋지 않아 제한됩니다. 본 프로토콜은 광학 조작과 SERS 검출을 통합하여 이를 해결하기 위한 효율적인 분석 플랫폼을 개발합니다. 1064nm 트래핑 레이저와 532nm 라만 프로브 레이저를 현미경으로 결합하여 은 나노입자를 조립하여 수성 환경에서 현장 SERS 측정을 위한 플라즈몬 핫스팟을 생성합니다. 응집제 없이, 이 동적 플라즈몬 은 나노입자 어셈블리는 분석물 분자 신호의 약 50배 향상을 가능하게 합니다. 또한 공간 및 시간 제어를 제공하여 0.05nM의 낮은 분석물 코팅된 은 나노입자 용액에서 SERS 활성 어셈블리를 형성하여 생체 내 분석을 위한 잠재적인 섭동을 최소화합니다. 따라서 이 광학 트래핑 통합 SERS 플랫폼은 액체, 특히 수성 생리학적 환경에서 효율적이고 재현 가능하며 안정적인 분자 분석을 위한 큰 잠재력을 가지고 있습니다.

개념 증명으로 DSNB를 분석 물 분자로 선택하고 AgNP 표면에 코팅했습니다. 플라즈몬 AgNP 어셈블리 및 분산 AgNP에 의해 강화된 DSNB의 전형적인 SERS 스펙트럼이 도 6에 도시되어 있다. 트래핑 레이저가 없으면 샘플 챔버에 분산된 AgNP가 Raman 프로브 레이저에 의한 여기 시 블랙 스펙트럼(그림 6A)을 생성했습니다. 약하고 넓은 SERS 신호가 대략 1380-1450 cm에서 관찰되었습니다.-1, 그의 대칭 NO2 스트레치로부터 DSNB의 특징적인 피크, 이는 문헌보고서 35,36과 일치한다. 분산된 AgNP가 브라운 운동 하에 있었기 때문에, 입자 간 접합은 도 6C에 도시된 바와 같이, 크고 불안정하였다. 따라서, 분산된 AgNPs에 대해 DSNB의 SERS 신호 증폭은 낮았다.
AgNP는 트래핑 레이저가 켜져있을 때 플라즈몬 AgNP 어셈블리를 형성하기 위해 수집됩니다. 트래핑 레이저의 출력을 높이고 조사 시간을 연장하면 그림 6B와 같이 더 많은 AgNP를 끌어 당기고 어두운 점을 생성 할 수 있습니다. 여기에서 700mM의 트래핑 레이저 출력과 20초의 조사 시간을 적용하여 지정된 위치와 순간에 0.05nM DSNB 코팅 AgNP 용액에서 플라즈몬 AgNP 어셈블리를 생성했습니다. DSNB의 SERS 스펙트럼은 플라즈몬 AgNP 어셈블리의 영역에서 얻어졌다(도 6A, 적색). 930cm-1의 강한 라만 밴드는 니트로 가위 진동에 할당되고 1078cm-1, 1152cm-1 및 1191cm-1의 큰 밴드는 DSNB35,37의 방향족 고리 모드와 겹치는 숙신이미딜 N-C-O 스트레치에 해당할 가능성이 높습니다. 1385cm-1 및 1444cm-1의 특징 밴드는 DSNB의 대칭 니트로 스트레치에서 발생하며 AgNP 35,37 표면과의 반응으로 인해 크게 향상되고 약간 이동합니다. DSNB35,36,37의 이전에 보고된 SERS 지문에 기초하여, 1579cm-1에서의 밴드는 DSNB의 방향족 링 모드에 할당되었다. 플라즈몬 AgNP 어셈블리에서 DSNB의 전체 강도는 분산 된 AgNP의 강도보다 높았다. 1444cm-1에서의 특성 피크의 강도를 고려할 때, 플라즈몬 AgNP 어셈블리는 분산된 AgNP의 것과 비교하여 DSNB의 SERS 신호의 대략 50배 향상을 제공할 수 있다. 도 7에 도시된 바와 같이, DSNB의 SERS 스펙트럼은 실험에서 AgNP 어셈블리에 대해 반복적으로(20회) 기록되어, 동일한 진동 특징을 입증하였다. 이 20 개의 SERS 스펙트럼에 걸쳐 1152 cm-1, 1444 cm-1 및 1579 cm-1에서 DSNB의 특성 피크의 강도는 각각 6.88 %, 6.59 % 및 5.48 %의 상대 표준 편차 (RSD)를 갖는 히스토그램으로 플롯되었습니다. 이를 통해 재현성과 안정성을 추가로 검증했습니다. 따라서 이 접근법은 플라즈몬 나노입자를 조작하고 용액에서 분석물 분자의 SERS 검출을 위해 신뢰할 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig01.jpg"> 그림 1: 광학 핀셋 결합 Raman 분광 플랫폼의 개략도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig02.jpg"> 도 2: SERS 측정을 위한 AgNP의 준비 . (A) AgNP의 SEM 이미지. (B) DLS에 의한 AgNP의 크기 분포. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig03.jpg"> 그림 3: AgNP와 DSNB의 상호작용. (A) AgNP의 표면에 DSNB의 코팅의 개략도. (b) AgNP 및 AgNP-DSNB의 UV-가시광선 스펙트럼. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig04.jpg"> 그림 4: 샘플 챔버 준비의 개략도. (A) 샘플 챔버 준비 공정. (B) 준비된 샘플 챔버. 스케일 바 = 1cm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig05.jpg"> 그림 5: 532nm 라만 레이저와 1064nm 트래핑 레이저의 위치 중첩. (A) 532nm 라만 레이저의 위치는 흰색 점으로 표시됩니다. (B) 빨간색 원으로 표시된 1064nm 트래핑 레이저의 위치. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig06.jpg"> 그림 6: 플라즈몬 AgNP 어셈블리에 의해 강화된 분석물 분자의 일반적인 SERS 스펙트럼. (A) 플라즈몬 AgNP 어셈블리(빨간색) 및 분산된 AgNP(검은색)에서의 DSNB의 SERS 스펙트럼. (B) 트래핑 레이저가 켜져있을 때 플라즈몬 AgNP 어셈블리는 현미경 시각화에서 어두운 점을 보여줍니다. (C) 트래핑 레이저가 꺼졌을 때 분산된 AgNP. (D) AgNP 어셈블리 형성 메커니즘의 그림. (E) 트래핑 레이저가없는 경우의 농도 의존적 SERS 강도. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig07.jpg"> 도 7: DSNB의 SERS 신호의 재현성. (A) 플라즈몬 AgNP 어셈블리에서의 DSNB의 20 SERS 스펙트럼을 실험에서 반복적으로 기록하였다. (B) 특성 DSNB 피크의 강도에 대한 히스토그램은 1152 cm-1 (RSD = 6.88 %), 1444 cm-1 (RSD = 6.59 %) 및 1579 cm-1 (RSD = 5.48 %). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63862/63862fig08.jpg"> 그림 8: 다양한 실험 매개변수에서 생성된 AgNP 어셈블리. (A) 다른 트래핑 레이저 출력; 조사 시간 20 초 및 AgNP 농도 0.05 nM. (B) 다른 조사 시간; 트래핑 레이저 출력 700 mW 및 AgNP 농도 0.05 nM. (c) 상이한 AgNP 농도; 조사 시간 20 초 및 트래핑 레이저 출력 700mW. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/63862fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 그림 1: 트래핑 레이저가 꺼졌을 때 시계열로 AgNP 어셈블리의 현미경 카메라 이미지. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63862/Figure%20S1.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

본 프로토콜은 민감한 분자 검출을 위해 플라즈몬 나노입자를 조작하기 위해 광학 트래핑 및 표면 강화 라만 분광법(SERS)을 통합하는 편리한 접근 방식을 설명합니다. 응집제 없이 트래핑 레이저는 플라즈몬 나노입자를 조립하여 현장 분광 측정을 위한 표적 분석물의 SERS 신호를 향상시킵니다.

In Situ 표면 강화 라만 분광법 특성화를 위한 플라즈몬 나노입자의 광학 트래핑

Surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) enables the ultrasensitive detection of analyte molecules in various applications due to the enhanced electric ...

이 프로토콜은 응집제가 없는 상태에서 SERS 활성 나노입자 어셈블리에 대한 공간 및 시간 제어를 제공하여 표적 분석물의 민감한 검출을 달성합니다. 우리 방법의 주요 장점은 SERS 활성 나노 입자 어셈블리를 생성하는 데 응집제가 사용되지 않으므로 생리 학적 조건에서 민감한 생체 분자를 분석하는 데 적합하다는 것입니다. 이는 용액 내 및 미세유체 시스템의 생리학적 조건에서 질병 바이오마커와 같은 분석물 분자를 검출하기 위한 유망한 플랫폼입니다.이 방법을 처음 사용하는 경우 연구원은 최상의 성능을 얻기 위해 트래핑 레이저 출력, 조사 시간 및은 나노 입자 농도를 미세 조정해야 할 수 있습니다. 시작하려면 532나노미터 레이저 빔을 광학 핀셋 현미경의 플렉스 포트로 향하게 합니다. 532나노미터 레이저 빔을 750나노미터 장편 다이크로익 미러를 사용하여 광학 핀셋 현미경의 스테레오 이중층 경로에 정렬하여 원래의 트래핑 레이저 빔과 결합하여 샘플 챔버에 초점을 맞춥니다.750나노미터 장편 이색성 거울을 사용하여 샘플 챔버에서 후방 산란광을 수집하고 액체-질소 냉각 전하 결합 장치 카메라가 포함된 분광계로 리디렉션합니다. 스펙트럼 획득 전에 분광계의 입구 슬릿 앞에 532 나노 미터 노치 필터를 배치하십시오. 유리 슬라이드를 청소하고 물과 에탄올로 슬립을 덮으십시오.프레임 테이프를 유리 슬라이드에 부착하여 챔버를 만듭니다. 은 나노 입자 DSNB 용액 몇 방울을 프레임에 첨가하십시오. 커버 슬립을 프레임 테이프에 놓고 밀봉하십시오.온도가 섭씨 영하 120도에 도달할 때까지 액체 질소 냉각 전하 결합 장치 카메라의 용기에 액체 질소를 추가합니다. 자기 레이저 안전 스크린을 사용하여 라만 프로브 빔 경로를 차단한 다음 532나노미터 라만 여기 소스 레이저를 켭니다. 은 나노 입자 DSNB 용액으로 샘플 챔버를 챔버 홀더에 고정합니다.물에 잠긴 대물렌즈에 물을 넣은 다음 챔버 홀더를 대물렌즈 위의 마이크로 스테이지에 즉시 놓습니다. 커버 슬립 위에 이멀젼 오일을 떨어뜨리고 오일 액침 콘덴서를 배치하여 현미경 카메라에서 입자를 시각화합니다. 532나노미터 라만 프로브 빔이 챔버의 바닥 유리 표면에 초점을 맞출 때까지 현미경 손잡이를 돌려 대물렌즈의 Z 위치를 조정하여 현미경 카메라에 흰색 점이 표시됩니다.마이크로 스테이지의 X 및 Y 위치를 조정하여 챔버의 중앙 영역을 흰색 지점에 배치하도록 챔버를 이동합니다. 광학 핀셋 제어 소프트웨어를 열고 장착된 조이스틱 컨트롤을 사용하여 1, 064나노미터 트래핑 레이저를 흰색 점과 겹치도록 이동합니다. 그런 다음 현미경의 손잡이를 조정하여 대물렌즈의 Z 위치를 위로 이동합니다.1, 064 나노 미터 트래핑 레이저를 켜서 샘플 챔버에서은 나노 입자를 끌어 당기고 플라즈몬은 나노 입자 어셈블리를 만듭니다. 필요한 경우 과열 또는 기포 형성을 방지하기 위해 트래핑 레이저 빔을 낮추십시오. 분광 측정을 위해 532나노미터 라만 프로브 빔의 초점 아래에 플라즈몬은 나노입자 어셈블리의 어두운 점을 배치하도록 샘플 마이크로스테이지의 위치를 조정합니다.532나노미터 라만 레이저 배출구 앞에 중성 밀도 필터를 배치하여 전력을 10메가와트로 조정합니다. 스펙트럼 소프트웨어의 설정 패널에 획득 시간을 입력하고 획득 버튼을 클릭하여 스펙트럼 수집을 시작합니다. 트래핑 레이저가 없으면 샘플 챔버에 분산 된은 나노 입자가 블랙 스펙트럼을 생성했습니다.트래핑 레이저의 출력을 높이고 조사 시간을 연장하면 더 많은은 나노 입자를 끌어 당겨 어두운 점을 생성 할 수 있습니다. 분산 된은 나노 입자는 브라운 운동 중이었기 때문에 입자 간 접합은 크고 불안정했습니다. 플라즈몬은 나노 입자 어셈블리에서 DSNB의 전체 강도는 분산 된은 나노 입자의 강도보다 높았다.1, 444 센티미터 역에서의 특성 피크의 강도를 고려할 때, 플라즈몬은 나노 입자 어셈블리는 분산 된은 나노 입자의 것과 비교하여 DSNB의 표면 강화 라만 분광 신호의 약 50 배 향상을 제공 할 수있다. 이 20 개의 표면 강화 라만 스펙트럼에 걸쳐 1, 152, 1, 444 및 1, 579 센티미터 역전에서 DSNB의 특성 피크의 강도는 상대 표준 편차가 각각 6.88, 6.59 및 5.48 % 인 히스토그램으로 표시되었습니다. 이 절차에서 가장 중요한 것은 532 나노 미터 라만 프로브 레이저의 위치를 찾아 1, 064 나노 미터 트래핑 레이저와 겹치는 것입니다.이 기술은 연구자들이 미래의 생체 내 분석을 위해 생리적 조건에서 공간 및 시간 제어로 분석물 분자를 검출할 수 있는 길을 열어줍니다.

optical-trapping-plasmonic-nanoparticles-for-situ-surface-enhanced

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Plasmonic 핀셋 및 광자 크리스탈 nanostructures는 광학 트래핑 마이크로 및 나노 입자의 효율성과 방향 제어에 유용 향상을 생산하기 위해 표시됩니다.

향상된 마이크로 및 Nanoparticle 조작에 대한 Plasmonic 및 광자 크리스탈 Nanostructures 활용

유전체의 저전력 광학 트래핑 다음 설치 방법 세부 금속 필름에 두 번 nanohole를 사용하여 나노 입자.

나노 입자의 광학 트래핑

이 비디오는 단일 세포에서 단백질 분비물을 감지하기 위한 국소 표면 플라즈몬 공명 영상을 보여줍니다. 미세유체 설정과 펩타이드 결합 플라즈몬 나노구조 칩을 사용하여 공명 각도에서 반사광 강도의 변화는 단일 세포에서 분비된 단백질과의 상호 작용을 보여줍니다.

단일 세포에서 단백질 분비물을 감지하기 위한 국소 표면 플라즈몬 공명 이미징

우리는 수생 생물의 주파수의 움직임을 조사하고 특성을 플라즈몬 나노 입자의 광학 추적을 사용합니다.

&#39;Nauplius의 움직임을 분석<em&gt; 아테 살리나</em&gt; &#39;플라즈몬 나노 입자의 광학 추적하여

우리는 나노 구조 기질과 고정화된 단백질 및 압타머와 인터페이스하는 나노 생물학적 시스템의 제조 및 특성화를 설명합니다. 나노 구조 기판의 리소그래피 제작, 생체 기능화 및 표면 강화 라만 분광법(SERS) 특성화와 관련된 관련 실험 단계가 보고됩니다. 표면 고정 단백질의 SERS 검출 및 단백질-리간드 및 압타머-리간드 결합의 프로빙이 입증되었습니다.

표면 EBL 날조 된 나노 구조 기판을 사용하여 생체 분자의 라만 분광학 감지 강화

플라즈몬 핀셋을 통합 마이크로 칩 제조 공정은 여기에 표시됩니다. 마이크로 칩은 최대 트래핑 힘을 측정하기 위해 갇힌 입자의 영상을 가능하게한다.

모니터링 환경에서 플라즈몬 트랩 및 나노 입자의 릴리스

우리 nanoplasmonic 광학 격자에 마이크로 입자를 광학 트랩을 절차를 설명 합니다.

Nanoplasmonic 광학 격자에 마이크로 입자의 트래핑

이 프로토콜에는 여기를 확인 하 고 결합 빛 방출 및 정기적인 배열에서 발생 블로흐와 같은 표면 플라스몬 polaritons 사이 요금 계측을 설명 합니다.

여기 및 빛 방출 및 표면 플라스몬 Polaritons 사이 요금 커플링

이 프로토콜은 공국소화 원자력 현미경(AFM) 및 라만 측정과 결합된 DNA 종이접기 나노안테나(DONA)를 사용한 단일 분자 표면 강화 라만 산란(SERS) 측정을 보여줍니다.

플라즈몬 DNA 종이접기 나노안테나로 구현되는 단일 분자 표면 강화 라만 산란 측정

이 프로토콜은 표면 강화 라만 산란 분광법 및 이미징을 사용하여 단일 나노 입자의 전기화학적 이벤트를 모니터링하는 방법을 설명합니다.

Surface-Enhanced Raman Scattering Spectroscopy and Microscopy를 사용한 단일 나노입자의 전기화학 추적

플라즈몬 나노핀셋은 금 나노 구조에서 국부적인 표면 플라즈몬 공명을 사용하여 나노미터 규모의 광학 필드 내에서 단백질을 포함한 단일 나노 입자를 가둡니다. 산란 신호의 변화는 단백질의 존재와 구조적 역학을 드러내므로 형광단 변형이나 표면 테더링 없이 모니터링할 수 있습니다.

플라즈모닉 나노핀셋을 사용한 단일 비변형 단백질의 구조적 역학 모니터링

배우세요 광학 트래핑과 SERS를 결합한 플라즈몬 나노입자 조립법을 통해 생리학적 조건에서 민감한 바이오마커 검출을 수행하는 방법을 익히세요. 이 기술은 응집제 없이 50배 향상된 신호를 제공합니다.

In Situ 표면 강화 라만 분광법 특성화를 위한 플라즈몬 나노입자의 광학 트래핑

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