Name: 디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 15 s
Description: 배우세요 디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정 방법을 통해 정확한 세포 수준 분석을 수행하는 기술을 익히세요.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

액적 생성 PCR 데이터의 통계 분석에 대한 조언을 해주신 L Bozhilova 박사에게 감사드립니다. 그림 3C 및 그림 4B에서 데이터를 생성하는 데 사용되는 난모세포를 제공한 H Zhang 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 캠브리지 대학의 의학 연구위원회 미토콘드리아 생물학 단위 (MC_UU_00015 / 9)의 SPB에 의해 수행되었으며 PFC (212219 / Z / 18 / Z)가 보유한 Wellcome Trust Principal Research Fellowship의 자금 지원을 받았습니다.

<ol><li>Taanman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+genome%3A+structure%2C+transcription%2C+translation+and+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial genome: structure, transcription, translation and replication.</a> Biochimica Biophysica Acta. 1410 (2), 103-123 (1999).</li>
<li>Wai, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+mammalian+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondrial DNA copy number in mammalian fertility.</a> Biology of Reproduction. 83 (1), 52-62 (2010).</li>
<li>D'Erchia, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-specific+mtDNA+abundance+from+exome+data+and+its+correlation+with+mitochondrial+transcription%2C+mass+and+respiratory+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity.</a> Mitochondrion. 20, 13-21 (2015).</li>
<li>Stewart, J. B., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamics+of+mitochondrial+DNA+heteroplasmy%3A+implications+for+human+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews%3A+Genetics%22%5BJournal%5D)">The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease.</a> Nature Reviews: Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).</li>
<li>Durham, S. E., Samuels, D. C., Cree, L. M., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+levels+of+wild-type+mitochondrial+DNA+maintain+cytochrome+c+oxidase+activity+for+two+pathogenic+mitochondrial+DNA+mutations+but+not+for+m.3243A--%3EG%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Normal levels of wild-type mitochondrial DNA maintain cytochrome c oxidase activity for two pathogenic mitochondrial DNA mutations but not for m.3243A-->G.</a> American Journal of Human Genetics. 81 (1), 189-195 (2007).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+mitochondrial+DNA+copy+number+in+urinary+cells+as+a+useful+marker+for+diagnosing+severity+of+the+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Wild-type mitochondrial DNA copy number in urinary cells as a useful marker for diagnosing severity of the mitochondrial diseases.</a> PloS One. 8 (6), 67146(2013).</li>
<li>Filograna, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+mtDNA+copy+number+ameliorates+the+pathological+consequences+of+a+heteroplasmic+mtDNA+mutation+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Modulation of mtDNA copy number ameliorates the pathological consequences of a heteroplasmic mtDNA mutation in the mouse.</a> Science Advances. 5 (4), (2019).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+increase+of+mitochondrial+DNA+content+in+endometrial+adenocarcinoma+cells%3A+a+quantitative+study+using+laser-captured+microdissected+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Gynecologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">The increase of mitochondrial DNA content in endometrial adenocarcinoma cells: a quantitative study using laser-captured microdissected tissues.</a> Gynecologic Oncology. 98 (1), 104-110 (2005).</li>
<li>Boulet, L., Karpati, G., Shoubridge, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+and+threshold+expression+of+the+tRNA%28Lys%29+mutation+in+skeletal+muscle+of+patients+with+myoclonic+epilepsy+and+ragged-red+fibers+%28MERRF%29%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Distribution and threshold expression of the tRNA(Lys) mutation in skeletal muscle of patients with myoclonic epilepsy and ragged-red fibers (MERRF).</a> American Journal of Human Genetics. 51 (6), 1187-1200 (1992).</li>
<li>Lee, J., Hyeon, D. Y., Hwang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+multiomics%3A+technologies+and+data+analysis+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single-cell multiomics: technologies and data analysis methods.</a> Experimental and Molecular Medicine. 52 (9), 1428-1442 (2020).</li>
<li>Taylor, S. C., Laperriere, G., Germain, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+Digital+PCR+versus+qPCR+for+gene+expression+analysis+with+low+abundant+targets%3A+from+variable+nonsense+to+publication+quality+data%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Droplet Digital PCR versus qPCR for gene expression analysis with low abundant targets: from variable nonsense to publication quality data.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2409(2017).</li>
<li>Hindson, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantification+by+droplet+digital+PCR+versus+analog+real-time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR.</a> Nature Methods. 10 (10), 1003-1005 (2013).</li>
<li>Herbst, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+quantitation+of+muscle+mitochondrial+DNA%3A+age%2C+fiber+type%2C+and+mutation-induced+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Journals+of+Gerontology.+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Digital PCR quantitation of muscle mitochondrial DNA: age, fiber type, and mutation-induced changes.</a> Journals of Gerontology. Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 72 (10), 1327-1333 (2017).</li>
<li>O'Hara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mitochondrial+DNA+copy+number+determination+using+droplet+digital+PCR+with+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution.</a> Genome Research. 29 (11), 1878-1888 (2019).</li>
<li>Diaz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mitochondrial+DNA+with+large+deletions+repopulates+organelles+faster+than+full-length+genomes+under+relaxed+copy+number+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Human mitochondrial DNA with large deletions repopulates organelles faster than full-length genomes under relaxed copy number control.</a> Nucleic Acids Research. 30 (21), 4626-4633 (2002).</li>
<li>Krishnan, K. J., Bender, A., Taylor, R. W., Turnbull, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+real-time+PCR+method+to+detect+and+quantify+mitochondrial+DNA+deletions+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A multiplex real-time PCR method to detect and quantify mitochondrial DNA deletions in individual cells.</a> Analytical Biochemistry. 370 (1), 127-129 (2007).</li>
<li>Lowes, H., Pyle, A., Duddy, M., Hudson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+mitochondrial+DNA+in+progressive+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Cell-free mitochondrial DNA in progressive multiple sclerosis.</a> Mitochondrion. 46, 307-312 (2019).</li>
<li>Perier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrial+DNA+deletions+within+dopaminergic+neurons+triggers+neuroprotective+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrial DNA deletions within dopaminergic neurons triggers neuroprotective mechanisms.</a> Brain. 136, Pt 8 2369-2378 (2013).</li>
<li>Cossarizza, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+of+flow+cytometry+and+cell+sorting+in+immunological+studies+%28second+edition%29%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition).</a> European Journal of Immunology. 49 (10), 1457(2019).</li>
<li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-capture+microdissection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Laser-capture microdissection.</a> Nature Protocols. 1 (2), 586-603 (2006).</li>
<li>Cree, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+of+mitochondrial+DNA+molecules+during+embryogenesis+explains+the+rapid+segregation+of+genotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">A reduction of mitochondrial DNA molecules during embryogenesis explains the rapid segregation of genotypes.</a> Nature Genetics. 40 (2), 249-254 (2008).</li>
<li>Belmonte, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+PCR+methods+improve+detection+sensitivity+and+measurement+precision+of+low+abundance+mtDNA+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Digital PCR methods improve detection sensitivity and measurement precision of low abundance mtDNA deletions.</a> Scientific Reports. 6, 25186(2016).</li>
<li>Samuels, D. C., Schon, E. A., Chinnery, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+direct+repeats+cause+most+human+mtDNA+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Two direct repeats cause most human mtDNA deletions.</a> Trends in Genetics. 20 (9), 393-398 (2004).</li>
<li>Nissanka, N., Minczuk, M., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+mitochondrial+DNA+deletion+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of mitochondrial DNA deletion formation.</a> Trends in Genetics. 35 (3), 235-244 (2019).</li>
<li>Macaulay, I. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+parallel+sequencing+of+the+genomes+and+transcriptomes+of+single+cells+using+G%26T-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Separation and parallel sequencing of the genomes and transcriptomes of single cells using G&T-seq.</a> Nature Protocols. 11 (11), 2081-2103 (2016).</li>
<li>Ludwig, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+tracing+in+humans+enabled+by+mitochondrial+mutations+and+single-cell+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lineage tracing in humans enabled by mitochondrial mutations and single-cell genomics.</a> Cell. 176 (6), 1325-1339 (2019).</li>
<li>Rooney, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR+based+determination+of+mitochondrial+DNA+copy+number+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">PCR based determination of mitochondrial DNA copy number in multiple species.</a> Methods in Molecular Biology. 1241, 23-38 (2015).</li>
<li>Kamitaki, N., Usher, C. L., McCarroll, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+droplet+digital+PCR+to+analyze+allele-specific+RNA+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using droplet digital PCR to analyze allele-specific RNA expression.</a> Methods in Molecular Biology. 1768, 401-422 (2018).</li>
<li>Maeda, R., Kami, D., Maeda, H., Shikuma, A., Gojo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+single+cell+analysis+of+mitochondrial+heteroplasmy+in+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High throughput single cell analysis of mitochondrial heteroplasmy in mitochondrial diseases.</a> Scientific Reports. 10 (1), 10821(2020).</li>
<li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dPCR%3A+A+Technology+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">dPCR: A Technology Review.</a> Sensors (Basel). 18 (4), (2018).</li>
<li>Lin, X., Huang, X., Urmann, K., Xie, X., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digital+loop-mediated+isothermal+amplification+on+a+commercial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sensors%22%5BJournal%5D)">Digital loop-mediated isothermal amplification on a commercial membrane.</a> ACS Sensors. 4 (1), 242-249 (2019).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+integrated+microfluidic+devices+for+qualitative%2C+quantitative+and+digital+nucleic+acids+testing+at+point+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+and+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Fully integrated microfluidic devices for qualitative, quantitative and digital nucleic acids testing at point of care.</a> Biosensors and Bioelectronics. 177, 112952(2021).</li>
</ol>

공개할 이해 상충이 없습니다.

여기에 설명된 프로토콜은 위에서 논의한 것 외에도 광범위한 세포 유형 및 종에 적용할 수 있지만, 이전에 검증된 프라이머/프로브 조합에서 벗어날 때 분석법의 정확성과 반복성이 유지되도록 하려면 새로운 분석 설계의 신중한 최적화가 중요합니다. 단일 세포로 작업할 때 샘플 수집이 가능한 한 정확하게 수행되도록 하고(예: FACS로 세포를 분류할 때 엄격한 단일 세포 파라미터 사용) 얻은 결과가 개별 세포의 결과를 진정으로 반영하는지 확인하고 오염 발생 위험을 줄이기 위해 모든 준비 작업이 깨끗한 사전 PCR 영역에서 수행되도록 하는 것이 중요합니다. 효율적인 세포 용해는 mtDNA 사본이 별도의 액적으로 성공적으로 구획화될 수 있도록 하는 데에도 중요합니다. 그러나 이것은 더 높은 농도의 세제를 사용할 때 물방울 형성을 방해할 위험과 균형을 이루어야 합니다.
분석 설계 및 용해 단계가 프로토콜에서 가장 중요하기 때문에 문제 해결이 필요할 가능성이 가장 높은 단계이기도 합니다. 초기에...

포유류 미토콘드리아(mt)DNA는 2개의 rRNA, 22개의 tRNA 및 13개의 단백질 코딩 유전자로 구성된 37개의 유전자를 암호화하는 미토콘드리아 매트릭스에 상주하는 작은(약 16.5Kb) 원형 DNA게놈입니다. 세포당 각 유전자의 사본이 하나(반수체) 또는 두 개(이배체) 복제를 포함하는 핵 게놈과 달리 mtDNA는 각 세포의 미토콘드리아에 수십 개의 사본(예: 성숙한 정자세포)에서 수십만 개의 사본(예: 난모세포)에 이르기까지 여러 사본으로 존재합니다2,3. 이러한 다중 복제 특성의 결과는 단일 염기 다형성(SNP), 결실 또는 복제로 존재할 수 있는 mtDNA 게놈의 돌연변이가 주어진 세포에서 다양한 수준으로 존재할 수 있으며 세포의 전체 mtDNA 집단의 0%에서 100%까지 구성할 수 있다는 것입니다. 동일한 세포에 야생형 및 돌연변이 mtDNA 게놈이 존재하는 것을 이형질이라고 하며, 병원성 이형질 mtDNA 돌연변이는 미토콘드리아 질환의 주요 원인이며, 몇 가지 일반적인 신경 증후군이 근본적인 이형질 mtDNA 돌연변이와관련이 있습니다4.
임상 질환을 유발하는 이형질 mtDNA 돌연변이의 가능성에 기여하는 두 가지 주요 매개 변수는 이형질 수준과 mtDNA 복제 수입니다. 많은 이형질 돌연변이는 역치 효과를 나타내며, 생화학 적 및 임상 적 표현형은 특정 이형질 수준 (일반적으로 약 80 % 5) 이상에서만 분명 해지고 이형질이 더 증가함에 따라 악화됩니다4. 그러나 세포에 존재하는 mtDNA의 사본 수를 고려하는 것도 중요한데, 이는 주어진 이형질 수준에 존재하는 야생형(즉, '건강한') mtDNA 게놈의 수에 영향을 미치기 때문입니다. 미토콘드리아 질환 환자에 대한 연구는 이형질과 복제 번호5,6 사이의 이러한 상호 작용의 중요성을 강조했으며, Filograna et al.은 최근 미토콘드리아 질환7의 마우스 모델에서 변하지 않은 이형질에도 불구하고 증상을 완화시키는 mtDNA 복제 수의 증가를보고했습니다.
최근 몇 년 동안 mtDNA 이종질로 인한 질병의 발병 기전 및 전염에 대한 이해를 향상시키기 위해 많은 작업이 수행되었지만, 이 작업의 대부분은 세포가 아닌 조직 수준에서 수행되어 평균 조직 이형질 수준과 대량 조직 생검 및 혈액 샘플에서 얻은 복제 수 측정을 비교합니다. 레이저 포획 미세 해부와 같은 일부 잘 정립 된 기술은 세포 수준 8,9에서 이러한 측정을 허용합니다. 그러나 최근 고처리량 단일 세포 분석 방법 또는 소위 "단일 세포 오믹스"10의 폭발적인 증가로 인해 단일 세포 수준에서 이러한 중요한 mtDNA 파라미터를 정확하게 측정할 수 있는 방법에 대한 요구가 생겼습니다.
액적 생성 PCR 방법은 샘플DNA 11에서 특정 표적 앰플리콘의 PCR 증폭을 통해 알려지지 않은 DNA 농도를 정량하는 기존 방법을 개선하기 위해 미세 유체 기술의 최근 발전을 이용합니다. 샘플 DNA가 단일 반응으로 증폭되는 qPCR과 달리 PCR 산물의 상대적 축적 속도가 판독값으로 작용하여 이 방법은 초기 샘플을 수천 개의 개별 방울로 분할하여 샘플 DNA 분자를 공간적으로 분리된 반응으로 구획화합니다12. 후속 PCR 반응은 각 개별 액적에서 진행되며 PCR 산물은 표적 DNA를 포함하는 액적에만 축적됩니다. 이 반응의 결과는 표적 DNA 및 증폭 된 PCR 산물의 사본을 포함하거나 표적 DNA를 포함하지 않는 물방울 풀 형태의 디지털 출력입니다. 형광 DNA 프로브 또는 이중 가닥(ds)DNA 결합 염료를 사용하여 증폭된 산물을 포함하는 액적을 계수할 수 있으며 '양성' 대 '음성' 방울의 비율을 사용하여 초기 샘플에 존재했던 DNA 사본의 절대 수를 계산할 수 있습니다. qPCR 반응에서 얻은 상대적 측정과 반대되는 이 절대 측정은 이 방법론을 단일 세포에서 mtDNA 복제 수 및 이형질의 정확한 측정에 사용할 수 있게 하는 핵심 요소이며11, 최근의 여러 연구에서 이미 이러한 목적으로 액적 생성 PCR 기술을 활용했습니다.13,14 . 이 기사는 인간과 마우스 조직 모두에서 단일 세포에서 mtDNA 복제 수와 결실 이형질을 측정하는 방법을 제시합니다.

<table><tbody><tr><td>50% Tween-20 솔루션</td><td>Novex</td><td>3005</td><td></td></tr><tr><td>자동 물방울 생성 오일&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864110</td><td>오일/액적 에멀젼을 생성하는 데 사용되는 상업용 오일 제형(프로토콜 단계 4.1에서 사용)</td></tr><tr><td>딥 웰 블록이 있는 C1000 PCR 기계</td><td>세포</td><td>용해(프로토콜 단계 2.1.2.) 및 PCR 사이클링(프로토콜 단계 5)에 사용되는 딥 웰 가열 블록이 장착된 Bio Rad 1851197 PCR 열순환기)</td><td></td></tr> <tr><td>수집 플레이트 냉각 블록</td><td>Bio Rad</td><td>12002819</td><td>물방울 생성 중 샘플을 차갑게 유지하는 냉각 블록(프로토콜 단계 4.3에서 사용됨)</td></tr><tr><td>ddPCR 96-well plates&nbsp;</td><td></td><td>QX200 AutoDG 드롭릿 생성기에서 사용하도록 설계된 Bio Rad 12001925 96-웰 플레이트 피펫 팁, 샘플 준비 (프로토콜 단계 3.4) 및 드롭릿 수집 (프로토콜 단계 4.3)에 사용됩니다</td><td></td></tr><tr><td>. ddPCR 드롭릿 리더 오일&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1863004</td><td>드롭릿 리더가 사용하는 상업용 오일 제형 (프로토콜 단계 6.1에서 사용됨)</td></tr><tr><td>프로브용 ddPCR 슈퍼믹스 (dUTP 없음)</td><td>Bio Rad</td><td>1863023</td><td>프로브를 사용하는 ddPCR 실험에 사용하기 위한 상업용 슈퍼믹스 (프로토콜 단계 3.3에서 사용됨)</td></tr><tr><td>DG32 자동 드롭릿 생성 카트리지&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864108</td><td>오일/드롭릿 에멀젼을 생성하기 위해 QX200 AutoDG 드롭릿 생성기에서 사용되는 미세유체 카트리지 (프로토콜 단계 4.3에서 사용됨)</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td>자격이 있는 태아 소 세럼</td></tr><tr><td>호일 플레이트 커버&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1814040</td><td>액적 생성 후 액적 수집 플레이트를 밀봉하는 데 사용되는 호일 플레이트 커버(프로토콜 단계 4.6에서 사용)</td></tr><tr><td>HEK 293T 세포</td><td>Takara</td><td>632180</td> SV40 Large-T 항원 HeLa 세포 ECACC 93021013 인간 자궁경부 상피 암종 세포를 <td>발현하는 형질전환된 인간 배아 신장 세포주 HEK 293의 상업용 서브클론</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>고포도당 DMEM</td><td>Gibco</td><td>13345364</td><td>4.5g/L D-글루코스, L-글루타민과 나트륨 피루브산이 있는</td></tr><tr><td>인간 사이브리드</td><td>마이애미 대학교</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 배아 섬유아세포&nbsp;</td><td>뉴캐슬 대학교</td><td>C57Bl/6 마우스</td><td></td></tr> 뉴클레아<tr><td>제가 없는 물</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>PCR 플레이트 씰</td>을 <td>Pierce</td><td>SP-0027</td><td>투명 접착 플레이트 씰, 사전 액적 생성만 사용(4.6단계에서 호일 씰을 사용해야 함)피</td></tr><tr><td>펫 팁 쓰레기통</td><td>Bio Rad</td><td>1864125</td><td>QX200 AutoDG 액적 생성기에서 버려진 팁을 수거하는 데 사용되는 일회용 수거함(프로토콜 단계 4.3에서 사용)</td></tr><tr><td>AutoDG 시스템용 피펫 팁&nbsp;</td><td>Bio Rad</td><td>1864120</td><td>QX200 AutoDG 액적 발생기(프로토콜 단계 4.3에서 사용)에 사용하도록 설계된 필터링된 피펫 팁:</td></tr> <tr><td>1차 인간 진피 섬유아세포</td><td>Newcastle Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer/Probes</td><td>IDT</td><td>N/A</td>: <td>정확한 프라이머/프로브 염기서열은 분석에 따라 다릅니다. 이 연구에 사용된 프라이머 및 프로브는 표 1에 나와</td></tr> 있습니다: <tr><td>Proteinase K 20 mg/mL 용액</td><td>Ambion</td><td>AM2546</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR 플레이트 씰러</td><td>Bio Rad</td><td>1814000</td><td>액적 생성 후 ddPCR 샘플 플레이트에 호일 씰 적용(프로토콜 단계 4.6에서 사용)QX</td></tr> <tr><td>Manager 소프트웨어</td><td>Bio Rad</td><td>12012172</td><td>액적 리더 설정 및 분석 소프트웨어(프로토콜 단계 6 및 7에서 사용)</td></tr><tr><td>QX200 AutoDG 액적 발생기</td><td>Bio Rad</td><td>1864101</td><td>자동 미세유체 액적 발생기(프로토콜 단계 4에서 사용)</td></tr><tr><td>QX200 액적 리더</td><td>Bio Rad</td><td>1864003</td><td>액적 리더(프로토콜 단계 6에서 사용)</td></tr><tr><td>Trizma 사전 설정 결정 pH 8.3</td><td>Sigma</td><td>T8943-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 dna 복제 수 및 이형질 측정

Measuring Single-Cell Mitochondrial DNA Copy Number and Heteroplasmy Using Digital Droplet Polymerase Chain Reaction

포유류 미토콘드리아 (mt) DNA는 전자 수송 사슬의 13 개 서브 유닛을 암호화하는 작고 원형의 이중 가닥 미토콘드리아 내 DNA 분자입니다. 이배체 핵 게놈과 달리 대부분의 세포에는 세포 유형에 따라 100개 미만에서 200,000개 이상의 사본에 이르는 mtDNA 사본이 더 많이 포함되어 있습니다. MtDNA 복제 수는 여러 연령 관련 퇴행성 질환 및 질병에 대한 바이오마커로 점점 더 많이 사용되고 있으며, 따라서 mtDNA 복제 수의 정확한 측정은 연구 및 진단 환경 모두에서 핵심 도구가 되고 있습니다. 종종 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 또는 결실로 발생하는 mtDNA의 돌연변이는 세포 내 mtDNA의 모든 사본 (동형 플라즘이라고 함) 또는 돌연변이 및 WT mtDNA 사본의 혼합물 (이종 플라스미라고 함)로 존재할 수 있습니다. 이종질 mtDNA 돌연변이는 희귀 질환 또는 파킨슨병과 같은 점점 더 많은 일반적인 후기 발병 질환에서 임상 미토콘드리아 병리의 주요 원인입니다. 세포에 존재하는 이형질의 수준을 결정하는 것은 희귀 미토콘드리아 질환의 진단과 미토콘드리아가 역할을 할 수있는 일반적인 후기 발병 장애를 이해하기위한 연구에서 중요한 단계입니다. MtDNA 복제 수 및 이형질은 전통적으로 정량적 (q) PCR 기반 분석 또는 심층 시퀀싱에 의해 측정되었습니다. 그러나 최근 도입된 ddPCR 기술은 두 파라미터를 모두 측정하기 위한 대체 방법을 제공했습니다. 절대 mtDNA 복제 수를 측정할 수 있는 기능과 낮은 복제 수에서도 단일 세포에서 정확한 측정을 수행할 수 있는 충분한 감도를 포함하여 기존 방법에 비해 몇 가지 이점을 제공합니다. 여기에 제시된 것은 ddPCR을 사용하여 단일 세포에서 mtDNA 복제 수의 측정을 설명하는 자세한 프로토콜이며, 이후 액적 생성 PCR이라고 하며, mtDNA가 결실된 세포에서 이형질을 동시에 측정하는 옵션이 있습니다. mtDNA SNP를 가진 세포에서 이형질을 측정하기 위해이 방법을 확장 할 가능성도 논의된다.

액적 생성 후 불투명한 액적의 투명한 층이 각 웰의 오일 상 위에 떠 있는 것을 볼 수 있습니다(그림 1B). 액적 형성은 단일 세포에 대한 실험을 수행할 때 투입 용해물에 세제가 존재함으로써 악영향을 받을 수 있습니다. 2.1.2.에 설명된 용해 프로토콜을 사용하면 최종 샘플에 소량의 TWEEN-20이 존재함에도 불구하고 권장 수준인 10,000 이상의 액적 수율이 일상적으로 달성됩니다(그림 1C). 그러나 버퍼 RLT Plus와 같은 다른 용해 버퍼를 사용하면 형성된 액적 수가 크게 감소하며(그림 1C), 이는 복제 수 측정의 정확도에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
PCR 및 액적 판독 후, 각 샘플 웰에 사용된 각 채널에서 양성 및 음성 액적의 명확하게 분리된 집단이 볼 수 있으며(<strong class="x...

여기에서는 단일 세포에서 절대 미토콘드리아(mt)DNA 복제 수와 mtDNA 결실 이형질 수준을 측정하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정

The mammalian mitochondrial (mt)DNA is a small, circular, double-stranded, intra-mitochondrial DNA molecule, encoding 13 subunits of the electron ...

이 프로토콜은 개별 세포에 존재하는 미토콘드리아 DNA의 사본 수와 특정 유형의 미토콘드리아 DNA 돌연변이 수준을 정확하게 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 이전 방법은 많은 세포를 포함하는 조직 샘플에서 이러한 측정을 정확하게 수행 할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단일 셀에서 동일한 측정을 수행 할 수 있다는 것입니다.이 방법은 특히 미토콘드리아를 연구하는 사람들에게 사용되며 이 분야에서 광범위하게 적용될 것입니다. 단일 세포의 효과적인 분리 및 용해가 이 기술의 핵심입니다. 단일 셀 정렬에 대한 이전 경험은 매우 도움이 될 것입니다.시작하려면 텍스트에 설명된 대로 얼음에 샘플 DNA가 없는 PCR을 위한 마스터 믹스를 준비합니다. 간단히 볼텍싱한 후, 제조된 마스터 믹스의 필요한 부피를 액적 생성 PCR 96-웰 플레이트의 각 웰에 분배하고, 샘플을 전체 컬럼에 배열한다. 다음으로, 마스터 믹스를 불완전한 열의 빈 우물에 추가하여 템플릿이 아닌 컨트롤로 사용합니다.그런 다음 각 웰에 입력 DNA를 추가하여 각 웰의 총 부피를 22 마이크로 리터로 만듭니다. 접착 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 2000RPM의 셰이커에 1분 동안 놓습니다. 그런 다음 접시를 섭씨 4도에서 1분 동안 1000배 G로 원심분리한 후 얼음 위에 놓습니다.액적 생성의 경우 먼저 액적 발생기의 전원이 켜져 있는지 확인하고 액적 생성 오일 병이 계기 데크의 E 위치에 로드되었는지 확인하십시오. 그런 다음 터치 스크린에서 샘플 플레이트 구성을 클릭합니다. 샘플 또는 블랭크가 포함된 샘플 플레이트의 모든 컬럼을 선택한 후 확인을 클릭하여 플레이트 구성을 확인합니다.그런 다음 액적 발생기 카트리지를 계기판 데크의 B 위치에 로드하여 모든 표시등이 녹색으로 바뀌고 빈 팁 폐기물통을 C 위치에 놓습니다.그런 다음 뚜껑을 제거한 필터 팁 상자를 계기 스테이지의 D 위치로 로드하여 모든 표시등이 녹색으로 바뀌도록 합니다. 다음으로, 표시등이 녹색으로 바뀌도록 계기판의 F 위치에 샘플 플레이트를 로드하기 전에 접착 씰을 제거합니다. 또한 빈 액적 수집 96웰 플레이트를 냉각 블록에 넣고 섭씨 영하 20도에서 미리 냉각하여 표시등이 녹색으로 바뀌도록 G 위치에 놓습니다.기기 터치 스크린에서 액적 생성 시작을 클릭하면 액적 발생기 덮개가 자동으로 닫힙니다. 액적 생성이 완료되면 샘플 수집 플레이트를 육안으로 확인하여 각 웰의 오일 상 위에 액적 에멀젼 층이 존재하는지 확인합니다. 그런 다음 플레이트 실러의 전원을 켜고 온도를 섭씨 180도로 설정하고 밀봉 시간을 5초로 설정합니다.기계가 작동 온도에 도달하도록 합니다. 그런 다음 샘플 수집 플레이트를 플레이트 실러의 플레이트 홀더에 놓고 빨간색 선이 위쪽을 향하도록 플레이트 상단에 새 호일 씰을 놓습니다. 플레이트 실러가 작동 온도에 도달하면 기기 터치 스크린에서 꺼내기를 누릅니다.플레이트 홀더를 플레이트 실러의 서랍에 넣은 후 씰을 눌러 서랍을 닫습니다. 밀봉이 완료되면 서랍이 자동으로 열립니다. 밀봉 된 판을 제거하고 콜드 블록에 놓습니다.그런 다음 플레이트 실러를 끕니다. PCR을 실행하려면 밀봉된 액적 수집 플레이트를 96 딥웰 블록이 있는 PCR 기계에 놓습니다. PCR이 완료되면 액적 판독기와 연결된 컴퓨터의 전원을 켭니다.PCR 후 샘플이 있는 플레이트를 액적 판독기 플레이트 홀더에 로드합니다. 샘플 플레이트에 호일 뚜껑을 유지하면서 덮개를 홀더 상단에 놓고 검은색 잠금 클립으로 제자리에 고정합니다. 그런 다음 액적 판독기 덮개를 열려면 열기/닫기 버튼을 누릅니다.그런 다음 샘플 플레이트와 함께 액적 판독기 플레이트 홀더를 판독기 챔버에 로드하고 마그네틱 베이스에 단단히 놓습니다. 열기/닫기 버튼을 다시 눌러 덮개를 닫습니다. 분석 소프트웨어 인터페이스를 엽니다.Add Plate(플레이트 추가) 탭을 선택하고 Add Plate(플레이트 추가)를 클릭한 다음 Plate 구성을 클릭합니다. 플레이트 정보 탭에서 플레이트 이름을 입력하고 Supermix 드롭다운 메뉴에서 프로브용 Supermix, DUTP 없음을 선택하고 웰 선택 탭 As.In 데이터 파일 저장 아래에 파일 이름을 입력하고 분석할 웰을 강조 표시한 다음 선택한 웰 포함을 클릭합니다. 그런 다음 웰 정보 탭에서 주석을 달 웰을 선택합니다.실험 유형 드롭다운 메뉴에서 직접 정량화를 선택합니다. 그런 다음 샘플 설명, 샘플 유형 및 대상 이름 상자를 채우고 필요에 따라 웰 노트 및/또는 플레이트 노트를 추가합니다. 그런 다음 적용을 클릭합니다.플레이트 구성이 완료되면 실행 시작을 클릭합니다. 결과 분석을 위해 데이터 분석 탭을 선택하고 내 데이터 파일 메뉴에서 분석할 파일을 엽니다. 그런 다음 단색 실험의 경우 1D 진폭 탭을 클릭하고 2색 실험의 경우 2D 진폭 탭을 클릭합니다.다음으로 임계 값이 필요한 우물을 선택하십시오. 임계값 선 모드 도구를 사용하여 진폭 플롯에서 양수 집단과 음수 집단 사이의 빈 공간에 임계값을 수동으로 적용하여 4개의 액적 모집단이 명확하게 분리되도록 십자선이 배치되도록 합니다. 모든 샘플에 임계값이 적용되면 데이터 테이블 탭, 가져오기/내보내기를 클릭하고 표시되는 데이터를 CSV로 내보내기를 선택하여 추가 분석을 위해 결과를 csv 파일로 내보냅니다.적절한 파일 이름을 입력하고 저장을 클릭합니다. 이 프로토콜에 사용된 PCR 및 액적 판독 절차는 fam 및 hex 채널 모두에서 양성 및 음성 비말의 명확하게 분리된 집단의 존재를 입증했습니다. 두 프로브 모두에 대해 양성인 미토콘드리아 DNA 집단은 또한 단일 세포 용해물과 구별될 수 있었다.이 방법은 또한 미토콘드리아 DNA에서 결실 된 샘플의 경우, 이중 양성 방울과 DNA의 결실되지 않은 부분에만 양성인 물방울의 혼합 집단이 존재한다는 것을 보여주었습니다. 이 방법은 마우스 난모세포 및 일차 마우스 배아 세포를 포함한 다양한 포유류 세포에서 세포당 미토콘드리아 DNA 복제 수를 계수하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 더욱이, 결실이 높은 이종질을 갖는 세포에서, 단일 프로브에 대해 양성인 집단은 이중 양성 집단보다 유의하게 더 큰 것으로 밝혀졌다.그러나, 낮은 결실 이종 plasmy를 갖는 세포에서, 두 집단은 비슷한 크기였다. 따라서 정확한 결과는 항상 액적 생성이 성공하고 1D 또는 2D 진폭 보기를 사용하여 임계값이 적절하게 적용되었는지 확인합니다. 사용되지 않은 용해물은 단일 뉴클레오티드 다형성 이형질을 측정할 수 있는 파이로시퀀싱과 같은 다른 단일 세포 분석에 사용할 수 있습니다.이 기술의 개발로 이전에는 불가능했던 개별 세포에서 미토콘드리아 DNA 복제 수와 결실 이형질을 정확하게 측정 할 수있었습니다.

measuring-single-cell-mitochondrial-dna-copy-number-heteroplasmy

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

이 비디오에서는 디지털 중합효소연쇄반응(dPCR)으로 표적 핵산을 검출하기 위해 유화된 나노 액적을 생성하는 단계별 절차를 제시합니다.

액적 디지털 중합효소 연쇄 반응: 희귀 종양 돌연변이 검출을 위한 나노액적 PCR 반응을 생성하는 방법

이 비디오에서는 두 개의 서로 다른 유전자 마커를 동시에 검출하는 데 유용한 기존 PCR 기술을 변형한 ddPCR(duplex digital PCR) 기술을 보여줍니다. 단일 PCR 반응은 독립적으로 증폭되는 나노리터 크기의 유화 액적으로 분할되며, 액적 분획에서 서로 다른 색상의 형광 증폭 신호를 검출하는 것은 표적 염기서열의 초기 농도를 계산하는 데 사용됩니다.

이중 유전자 마커의 동시 정량을 위한 Duplex Digital PCR

이 동영상은 임상 진단 및 예후를 위한 조기 바이오마커로서 서로 다른 백혈구 집단에서 메틸화된 DNA 영역을 동시에 정량화하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응 기술을 보여줍니다.

백혈구에서 DNA 메틸화를 검출하기 위한 다중 액적 중합효소 연쇄 반응

염료 기반 화학 및 액적 디지털 PCR 기술을 사용한 cell-free microRNA 정량화를 위한 민감하고 정확한 방법에 대해 설명합니다.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

여기 우리는 동시에 quantitate 의무가 메서드와 알칼리 가수분해와 후속 5´-엔드 genomic DNA의 효소 분열을 결합 하 여 단일 뉴클레오티드 해상도 높은 그대로 DNA에 게놈 넓은 지도 ribonucleotides 설명 시퀀싱.

동시 매핑 및 인간 미토 콘 드리 아 DNA에 Ribonucleotides의 정량

여기, 우리는 미토 콘 드리 아 DNA (mtDNA) 메 틸의 정확한 정량화를 허용 하는 프로토콜을 제시. 이 프로토콜에서 우리 BamHI bioinformatic 분석 파이프라인 mtDNA의 이차 구조에 의해 발생 하는 mtDNA 메 틸 화 수준의 과대평가 방지 하는 데 사용할 수 있습니다와 결합으로 DNA의 효소 소화를 설명 합니다.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

여기, 우리는 정확 하 게 계량 드롭 ddPCR 독특한 가수분해 프로브 쌍을 사용 하 여 단일 반응에서 대상 지역의 여러 유전 변경 하는 프로토콜을 제시.

하나의 물방울 디지털 연쇄 반응 핫스팟 지역에서 돌연변이의 포괄적이 고 동시 검색

후성 유전학 마커는 DNA 메틸화 패턴의 정량화를 통해 백혈구 (WBC) 과형을 위해 사용됩니다. 이 프로토콜은 WBC 차동 수의 정밀하고 멀티플렉스 메틸화 특이적 표적 정량화를 허용하는 방울 생성을 위한 열가소성 탄성동체(TPE) 기반 미세 유체 장치를 사용하여 멀티플렉스 액적 폴리머(mdPCR) 방법을 제시한다.

혈액학적 진단을 위한 폴리머 물방울 발생기 장치를 사용하여 메틸화 특정 멀티플렉스 물방울 PCR

파이로시퀀싱 분석은 이형질 세포 또는 조직에서 미토콘드리아 DNA 단일 뉴클레오티드 다형성의 강력하고 신속한 유전형 분석을 가능하게 합니다.

파이로시퀀싱에 의한 미토콘드리아 게놈의 단일 뉴클레오티드 다형성 유전자형 분석

mtDNA 합성 및 분포를 검출하고 정량화하기 위해 다중 웰 플레이트 형식 및 자동화된 면역형광 이미징을 사용하여 세포에서 미토콘드리아 DNA(mtDNA) 대사의 역학을 연구하는 절차가 설명되어 있습니다. 이것은 mtDNA 대사에 대한 다양한 억제제, 세포 스트레스 및 유전자 침묵의 효과를 조사하는 데 추가로 사용될 수 있습니다.

미토콘드리아 DNA 합성 및 분포의 고처리량 이미지 기반 정량화

본 연구는 토양 미생물 생체량과 균류-박테리아 비율을 빠르게 정량화하는 ddPCR 방법을 제시합니다. ddPCR 유래 미생물 생체량 탄소는 클로로포름 훈증 추정치와 약한 상관관계만 보이지만, 이 방법은 추가 토양 샘플링이나 강경 도구 없이 민감하고 확장 가능한 분자 접근법을 제공합니다.

디지털 액상 PCR(ddPCR)을 이용한 토양 내 미생물 바이오매스 측정

배우세요 디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정 방법을 통해 정확한 세포 수준 분석을 수행하는 기술을 익히세요.

디지털 액적 중합효소 연쇄반응을 이용한 단세포 미토콘드리아 DNA 복제 수 및 이형질 측정

더 많은 동영상 탐색