Name: 무세포 재구성을 위한 재조합 셉틴 복합체의 정제 및 품질 관리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 배우세요 세프틴 복합체 정제 프로토콜을 통해 세포 분열 및 이동 연구에 활용하는 방법을 익히세요. 고품질 단백질을 확보하여 세포골격 단백질의 상호작용을 효과적으로 분석할 수 있습니다.

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질량 측광(iSCAT) 실험에 도움을 준 Cecilia de Agrela Pinto, Tomás de Garay, Katharina Häußermann에게 감사드립니다. 아르옌 야코비와 윌 에버스가 TEM에 도움을 주었습니다. TIRF에 대한 그녀의 도움을 주신 루시아 발다우프; 파스칼 베르디에 - 피나르 (Pascal Verdier-Pinard)는 네이티브 전기 영동에 관한 조언을 해주었습니다. Agata Szuba와 Marjolein Vinkenoog는 Drosophila septin 정제 노력과 프랑스 국립 연구 인프라 France-BioImaging (ANR10-INBS-04)의 회원인 Institut Curie의 Cell and Tissue Imaging (PICT-IBiSA)을 설정하는 데 도움을 주었습니다. 이 연구는 'BaSyC-합성 세포 구축' 중력 보조금(024.003.019)을 통해 네덜란드 과학 연구 기구(NWO/OCW)와 Agence Nationale pour la Recherche(ANR 보조금 ANR-17-CE13-0014: "SEPTIMORF"; ANR-13-JSV8-0002-01: "9월"; 및 ANR-20-CE11-0014-01: "SEPTSCORT").

저자는 경쟁 또는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

여기에 설명된 방법은 사전 형성된 셉틴 헤테로올리고머의 강력한 정제 및 품질 관리를 가능하게 합니다. 이 방법의 올바른 적용을 위해 고려해야 할 몇 가지 주요 문제는 다음과 같습니다. 크로마토그래피 분리의 용리 단계 중에 셉틴 복합체의 희석을 최소화하기 위해 권장(또는 더 낮은) 유속을 사용하는 것이 중요합니다. 또한 최종 농축 단계에서 단백질 회수를 최대화하기 위해 농축기 컬럼은 용액이 필터에 밀려나지 않는 방식으로 배향됩니다(한쪽에만 필터가 있는 경우). 용액이 필터로 직접 이동하면 단백질이 필터에 훨씬 더 달라 붙어 최종 수율이 크게 감소합니다. 농축 단계가 항상 필요한 것은 아니라는 점을 고려하는 것도 중요합니다. 크로마토그램의 피크 주변의 좁은 범위에서만 분획을 선택하는 것은 일반적으로 많은 재구성 응용 분야(일반적으로 10-300nM 사이에서 작동)에 대해 충분히 높은 스톡 농도(>3,000nM)를 제공합니다. 마지막으로, 형광 현미경에 의한 셉틴 복합체의 기능성을 품질 제어하기 위해서는 셉틴 복합체가 유리에 열렬히 달라 붙기 때문에 현미경 슬라이드의 표면을 올바르게 부동 태화하는 것이 중요합니다. 유리 슬라이드의 패시베이션은 PLL-PEG 기능화 또는 중성(100% DOPC) 지지된 지질 이중층(11,32)의 형성에 의해 수행될 수 있다.
Iv et al.10에 처음 기술된 원래의 정제 프로토콜과 비교하여, 완충액 조성에 변화가 있다(표 2). MgCl2의 농도는 5mM에서 2mM로 감소하였고, Tris-HCl의 농도 및 pH는 각각 50mM에서 20mM 및 8.0에서 7.4로 감소하였다. 이러한 변경은 완충 조건을 인간 셉틴과 지질 이중층, 액틴 필라멘트 및 미세 소관10,11,32의 상호 작용에 대한 연구와 양립 할 수 있도록하기 위해 이루어졌습니다. 이는 저자들이 F- 완충액에 ATP가 존재하는 것을 제외하고는 darkSPB의 조성과 동일한 F- 완충액에서 지지된 지질 이중층과 중합 된 액틴을 형성했기 때문입니다. 완충액 변화는 원래 완충액과 비교하여 정제된 셉틴의 품질 또는 수명에 어떠한 변화도 일으키지 않았다.
이 정제 방법에는 여전히 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, 상이한 정제 시도는 정제된 셉틴 복합체의 번들 형성 능력에 의해 확인된 바와 같이 수율(2-5μM 셉틴 복합체의 0.5-1mL) 및 기능적 품질에서 다양할 수 있다. 그렇기 때문에 이 백서에 설명된 품질 검사를 일관되게 수행하는 것이 매우 중요합니다. 박테리아 배양의 발현 시간과 광학 밀도를 매우 잘 제어하면 수율 차이를 완화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 둘째, 이 정제 파이프라인은 삼량체와 헥사머 또는 사량체와 옥타머를 구별할 수 없습니다(그림 1B). 그러나, 품질 관리 실험은 셉틴 복합체의 대다수가 그들의 긴 올리고머 형태임을 증명하기 위해 사용될 수 있다. 더 좁은 올리고머 크기 분포가 필요한 경우 1.6단계 사이에 크기 배제 크로마토그래피를 삽입할 수 있습니다. 및 단계 1.7. 정제 프로토콜의. 그러나 이 선택적 단계는 수율을 크게 감소시키며 꼭 필요한 경우가 아니면 권장되지 않습니다. 마지막으로, 보다 근본적인 한계는 재조합 셉틴 복합체의 발현 시스템으로 대장균을 사용하는 것에서 비롯됩니다. 당연히이 시스템은 인산화, 아세틸 화 및 수모 일화 6,51,52,53과 같은 동물 세포에서보고 된 번역 후 변형 (PTM)을 허용하지 않습니다. 이러한 번역 후 변형은 곤충 또는 인간 세포에서 유사한 정제 전략을 구현함으로써 추가 될 수 있습니다. 또한, 이 논문은 셉틴의 재구성 자체에 대해서만 논의했지만, 세포에 대한 연구에 따르면 Borg 계열 54,55 및 아닐린24,25,56의 단백질과 같은 조절 단백질은 셉틴의 조립 및 기능에 실질적이지만 잘 이해되지 않은 영향을 미칠 수 있으므로 결국 체외에서 통합하는 것이 중요합니다. 연구. Borg 단백질 및 아닐린의 정제를 위한 프로토콜은54,57로 보고되었다.
여기에 보고된 셉틴 정제 프로토콜은 올바른 서브유닛 화학량론을 사용하여 올리고머 형태의 셉틴을 정제하는 표준화된 방법을 제공하여 단일 셉틴 서브유닛에 의존하는 많은 초기 시험관 내 연구에 비해 중요한 발전을 제공합니다. 특정 상황에서 일부 셉틴이 단일서브유닛2으로 작용할 수 있지만, 현재의 문헌은 동물 세포에서 셉틴이 대부분 복합체 9,58에서 기능한다는 것을 강력하게 시사합니다. 따라서, 이 논문 및 기타 10,11,18,32,35,36,37에 기술된 것과 같은 미리 형성된 헤테로-올리고머의 사용은 in vitro를 통해 셉틴의 구조적 및 생물물리학적 특성을 연구하는 데 매우 중요합니다. 세포에서 기능을 해부하기위한 재구성. 또한, 셉틴은 막과 세포 골격을 포함한 많은 상호 작용 파트너를 가진 자기 조립 단백질이므로 상향식 합성 생물학59,60,61 및 곡률42,62,63과 같은 막 생물 물리학 적 특성의 단백질 유도 변화에 대한 연구에 큰 관심을 끌고 있습니다.

세포 골격은 고전적으로 액틴 필라멘트, 미세 소관 및 중간 필라멘트 1로 구성된 3 성분 시스템으로 설명되었지만 최근에는 셉틴이 세포 골격1의 네 번째 구성 요소로 인정되었습니다. 셉틴은 진핵생물2에서 보존되는 GTP 결합 단백질 계열입니다. 셉틴은 세포 분열3, 세포-세포 부착4, 세포 운동성5, 형태형성6, 세포 감염7, 세포 극성의 확립 및 유지8와 같은 많은 세포 기능에 관여합니다. 중요한 기능에도 불구하고 셉틴이 그러한 과정에 어떻게 관여하는지는 잘 이해되지 않습니다.
단백질의 셉틴 계열은 단백질 서열 유사성2에 따라 여러 하위 그룹 (분류에 따라 4 개 또는 7 개)으로 세분됩니다. 상이한 서브패밀리의 구성원은 회문 헤테로-올리고머 복합체를 형성할 수 있으며, 이는 필라멘트의 빌딩 블록이며, 이는 차례로 번들, 링 및 메쉬웍스 1,9,10,11,12와 같은 고차 구조로 조립됩니다. 더 많은 분자 복잡성은 상이한 스플라이스 변이체의 존재로부터 발생하며, 예를 들어 인간 SEPT9가 있으며, 여기서 상이한 스플라이스 변이체13,14,15의 특정 기능에 대한 증거가 존재한다. 추가적으로, 헤테로올리고머의 길이는 종 및 세포 유형에 의존한다. 예를 들어, Caenorhabditis elegans septins는 사량 체16을 형성하고, Drosophila melanogaster septins는 헥사 머 17 (그림 1A), 사카로 미세스 cerevisiae 셉틴은 옥타 머 18을 형성하고, 인간 셉틴은 헥사 머 및 옥타머19 (그림 1A)를 형성합니다. 동일한 서브패밀리로부터의 셉틴 이소형, 스플라이스 변이체 및 번역 후 변형된 셉틴이 복합체에서 서로를 대체하는 능력 및 상이한 크기의 헤테로-올리고머의 (공존)존재는 상이한 헤테로-올리고머 복합체12의 세포 기능을 묘사하는 것을 어렵게 만들었다.
셉틴의 또 다른 흥미로운 능력은 세포의 많은 결합 파트너와 상호 작용하는 능력입니다. Septins는 간기 및 세포 분열20,21,22 동안 원형질막과 막 세포 소기관에 결합합니다. 분열하는 세포에서 셉틴은 세포질 분열23,24,25 및 액틴 및 미오신 26,27과 협력합니다. 세포질 분열의 후기 단계에서, 셉틴은 중체 이탈28에 대한 수송 (ESCRT) 시스템에 필요한 엔도솜 분류 복합체를 조절하는 것으로 보인다. 또한, 액틴 피질에 위치한 셉틴과 간기 세포 29,30,31에서 세포의 액틴 스트레스 섬유의 증거도 있습니다. 특정 세포 유형에서, 셉틴은 또한 미세소관 세포골격(32,33)에 결합하고 조절한다.
이러한 모든 기능으로 인해 셉틴은 연구하기에 매우 흥미로운 단백질 시스템이지만 도전적인 시스템이기도 합니다. 많은 수의 셉틴 서브 유닛 (스플 라이스 변이체를 계산하지 않고 인간의 13 개 유전자2)과 동일한 서브 패밀리의 셉틴 서브 유닛이 서로를 대체하고 다른 크기의 헤테로 올리고머를 형성 할 가능성의 조합은 유전자 조작에 의한 특정 셉틴의 세포 기능에 대한 결론을 도출하는 것을 어렵게 만든다. 또한, 셉틴의 다중 상호 작용은 세포 골격 또는 막 구성 요소를 대상으로 하는 약물34 와 같은 일반적인 연구 도구의 효과를 해석하는 것을 어려운 작업으로 만듭니다.
이러한 상황을 극복하는 방법은 셉틴의 시험관 내 (무 세포) 재구성으로 세포 연구를 보완하는 것입니다. 시험관 내 재구성은 특정 서브 유닛 조성 및 길이 18,35,36,37을 갖는 단일 유형의 셉틴 헤테로 올리고머의 분리를 허용한다. 그런 다음이 복합체는 셉틴38,39,40의 기본 구조적 및 물리 화학적 특성을 발견하기 위해 단독으로 또는 모델 생물막 11,41,42, 액틴 필라멘트 10,27 또는 미세 소관32,36과 같은 원하는 파트너와 함께 제어 된 환경에서 연구하여 특성을 해독 할 수 있습니다. 상호 작용.
따라서 다양한 셉틴 복합체를 효율적으로 정제하는 신뢰할 수 있는 방법은 셉틴 연구에 필수적입니다. 그러나 동일한 프로토콜을 사용하더라도 다른 정제는 다른 활성/기능 또는 무결성을 가진 단백질을 제공할 수 있습니다. 효소와 같은 상업적으로 이용 가능한 단백질의 경우, 기능성 및 효소 활성이 신중하게 검증된다43. 세포골격 또는 셉틴과 같은 구조 단백질에 대한 신중한 품질 관리를 구현하는 것은 어려울 수 있지만 실험실 간 실험을 비교할 수 있도록 하는 것이 중요합니다.
이 논문은 대장균 세포에서 단일 또는 이중 시스트로닉 구축물을 포함하는 두 벡터의 동시 발현(표 1)을 기반으로 고품질 재조합 셉틴을 이종 올리고머 형태로 정제하는 강력한 방법을 설명합니다. 이 방법은 그의6-태그된 셉틴과 Strep-II-태그된 셉틴을 모두 포함하는 셉틴 헤테로올리고머를 포획하기 위한 2단계 친화성 크로마토그래피 접근법으로 구성됩니다(그림 1B,C). Iv et al.10에 처음 기술된 이 프로토콜은 초파리 셉틴 헥사머 11,27,35, 인간 셉틴 헥사 머 10 및 상이한 천연(이소형 1, 3 및 5)10,32 또는 돌연변이된 SEPT9 이소폼 32를 함유하는 여러 인간 셉틴 옥타머를 정제하는 데 사용되었습니다. . 또한, 정제된 셉틴의 품질을 평가하기 위한 일련의 기술에 대한 설명이 제공된다. 먼저, 셉틴 서브 유닛의 완전성과 정확한 화학 양 론은 변성 전기 영동 및 투과 전자 현미경 (TEM)을 사용하여 확인됩니다. 그런 다음 정확한 분자량의 헤테로 올리고머의 존재와 복잡한 불안정성을 나타내는 단량체 또는 더 작은 올리고머의 존재를 간섭계 산란 현미경(iSCAT)을 통한 기본 전기영동 및 질량 광도법으로 검사합니다. 마지막으로, 마지막 단계는 형광 현미경 및 TEM을 사용하여 셉틴의 중합 활성을 평가하는 것으로 구성됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2.jpg"> 그림 1: 정제 전략 . (A) 인간(왼쪽)과 초파리 (오른쪽) 세포에 존재하는 셉틴 헤테로올리고머의 도식. 숫자는 표시된 그룹의 셉틴 하위 단위를 나타내고 P는 땅콩을 나타냅니다. 인간 SEPT9는 그의 이소형일 수 있다. 셉틴 서브 유닛은 비대칭 모양을 가지며 인간 육각 체 위에 각각 NC 및 G로 표시된대로 두 개의 별개의 인터페이스 인 NC : NC 및 G : G 인터페이스와 길이 방향으로 연결됩니다. (ᄃ,씨) (B) 인간 셉틴 헥사머 및 (C) 옥타머에 대해 표시된 2단계 크로마토그래피 전략의 개략도. H는 그의 태그를 나타내고 S는 스트렙-II 태그를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>488nm 레이저 결합기 iLAS2</td><td>Gataca</td><td></td><td>TIRF 현미경</td></tr><tr><td>488nm 사파이어 레이저 라인</td><td>코히런트</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>4k X 4k F416 CMOS 카메라</td><td>TVIPS</td><td></td><td>JEM-1400plus</td></tr><tr><td>4x 샘플 버퍼 nativePAGE</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (TROLOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>깜박임을 방지하기 위해</td></tr><tr><td>AKTA 순수 25 M1</td><td>GE 헬스케어</td><td>1680311</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-25G</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td><td>Ted pella</td><td>01813-F</td><td></td></tr><tr><td>Carbon Type-B, 300 mesh EM grid</td><td>전자 마이코스copy sciences</td><td>CF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>커버 유리 #1.5H</td><td>Thorslabs</td><td>CG15KH</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1-M1 컨포칼 유닛</td><td>요코가와</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1411-1G</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨(DTT)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>시그마-알드리치</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2-E</td><td>Nikon 기기</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>EDTA-free 프로테아제 인힙터 칵테일</td><td>Roche</td><td>481761</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5 mL</td><td>GE 헬스케어</td><td>29-0588-3</td><td></td></tr><tr><td>iLAS2 방위각 TIRF 조명 시스템&nbsp;</td><td>Gataca</td><td></td><td>TIRF 현미경</td></tr><tr><td>이미다졸</td><td>시그마-알드리치</td><td>1202-1KG</td><td></td></tr><tr><td>인스턴트블루 단백질 겔 스테인</td><td>Westburg 생명 과학</td><td>EP ab119211</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG)</td><td>Thermo Fisher 과학</td><td>10849040</td><td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 888 EMCCD 카메라</td><td>Andor</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>iXon 울트라 897 EM-CCD&nbsp;</td><td>Andor</td><td></td><td>TIRF 현미경</td></tr><tr><td>JEM-1400plus</td><td>JOEL</td><td></td><td>TEM 현미경 TUDelft</td></tr><tr><td>카파-카세인&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>LB 육수</td><td>시그마-알드리치</td><td>L3022-6X1KG</td><td></td></tr><tr><td>리조자임</td><td>시그마-알드리치</td><td>62971-10G-F</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘</td><td>시그마-알드리치</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>마그네슘 설페이</td>트 <td>시그마-알드리치</td><td>746452-1KG</td><td></td></tr><tr><td>메틸에클룰로스</td><td>시그마-알드리치</td><td>8074844</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ 시스템(일체형 10)</td><td>Merck-Millipore</td><td></td><td>I-water 디스펜서</td></tr><tr><td>Mini protean TGX 겔</td><td>BIORAD</td><td>4561086</td><td></td></tr><tr><td>NativeMark 염색되지 않은 단백질 표준물질</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>iSCAT 및 Native 겔용</td></tr><tr><td>NativePAGE 4-16% GELS</td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE Running Buffer kit</td><td>Thermo Fisher 과학</td><td>BN2007</td><td></td></tr><tr><td>니콘 Ti2-E&nbsp;</td><td>니콘 악기</td><td></td><td>TIRF 현미경</td></tr><tr><td>Nr. 1 Menzel 커버슬립</td><td>Thermo Fisher 과학</td><td>11961988</td><td></td></tr><tr><td>파라필름&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>P7668</td><td></td></tr><tr><td>계획 Apo &times; 100/1.45 NA 오일 이멀젼 대물렌즈</td><td>Nikon 기기</td><td></td><td>컨포칼 현미경</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>시그마-알드리치</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>폴리(L-라이신)-그라프트-비오틴화 PEG(PLL-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>CHF560.00</td><td></td></tr><tr><td>폴리-L-라이신 용액 0.01%</td><td>시그마-알드리치</td><td>P4832</td><td>iSCAT 유리 슬라이드용</td></tr><tr><td>포타슘 클로라이드</td><td>시그마-알드리치</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>네이티브 겔용 전원 공급 장치</td><td>CONSORT</td><td>S/N 71638</td><td></td></tr><tr><td>POWERPAC UNIVERSAL</td><td>BIORAD</td><td>042BR31206</td><td></td></tr><tr><td>프로토카테추에이트 3,4-디옥시게나제(PCD)</td><td>시그마-알드리치</td><td>P8279-25UN</td><td>산소 제거제 - 효소</td></tr><tr><td>프로토카테추산(PCA)</td><td>시그마-알드리치</td><td>03930590-50MG</td><td>산소 제거제 - 시약</td></tr><tr><td>Q500 Sonicator</td><td></td><td>Qsonica Q500-110</td><td></td></tr><tr><td>Quemesa 카메라</td><td>Tecnai Spirit</td>Refeyn OneMP Refeyn <td></td> 용 올림푸 <td></td></tr> 스 <tr><td>샘플 버퍼, laemmli 2x 농축액</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3401-10vl</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 개스킷</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL103250-10EA</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> Slide-A-Lyzer 투석 카세트 30k MWCO 3mL <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher scientific</td><td>66381</td><td></td></tr><tr><td>스펙티노마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441-1G</td><td></td></tr><tr><td>StrepTrap HP, 1mL</td><td>GE 헬스케어</td><td>28-9075-46</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit 현미경</td><td>Thermo Scientific, FEI</td><td></td><td>TEM 현미경 연구소 퀴리</td></tr><tr><td>훌륭한 국물</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0918-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris/Glyine/SDS 완충액</td><td>BIORAD</td><td>1610772</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-1KG</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척기</td><td>Branson</td><td>CPX2800H-E</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 6, 30,000 MWCO PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0622</td><td></td></tr></tbody></table>

무세포 재구성을 위한 재조합 셉틴 복합체의 정제 및 품질 관리

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

Septins는 헤테로 올리고머 복합체로부터 세포 골격 필라멘트와 고차 구조를 형성 할 수있는 보존 된 진핵 생물 GTP 결합 단백질 계열입니다. 그들은 다른 세포 골격 구성 요소 및 세포막과 상호 작용하여 이동 및 세포 분열과 같은 중요한 세포 기능에 참여합니다. 셉틴의 많은 상호 작용의 복잡성, 많은 수의 셉틴 유전자(인간의 경우 13개) 및 셉틴이 다른 서브유닛 구성을 가진 헤테로-올리고머 복합체를 형성하는 능력으로 인해 무세포 재구성은 셉틴 생물학의 기초를 이해하는 데 중요한 전략입니다. 본 논문은 먼저 2단계 친화성 크로마토그래피 접근법을 사용하여 재조합 셉틴을 그의 헤테로올리고머 형태로 정제하는 방법을 설명한다. 그런 다음 셉틴 복합체의 순도와 무결성을 확인하는 데 사용되는 품질 관리 프로세스가 자세히 설명되어 있습니다. 이 공정은 네이티브 및 변성 겔 전기 영동, 음성 염색 전자 현미경 및 간섭계 산란 현미경을 결합합니다. 마지막으로, 음성염색전자현미경과 형광현미경을 이용하여 셉틴 복합체의 중합능을 확인하는 과정에 대한 설명이 주어진다. 이것은 초파리 셉틴 헥사머뿐만 아니라 다양한 이소 형태의 septin_9 포함하는 고품질의 인간 셉틴 헥사 머 및 옥타 머를 생산할 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜에서 언급된 바와 같이, 2개의 셉틴 발현 플라스미드와 공동 형질전환된 5L의 대장균 세포를 성장시키고, IPTG를 첨가하여 셉틴의 발현을 유도하였다. 3 시간 후, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 용해 완충액에 재현탁시키고, 초음파 처리에 의해 용해시켰다. 이어서, 용해물을 원심분리에 의해 정화하고, 정제된 용액을 HisTrap 컬럼에 적용하였다(도 2A). 첫 번째 정제 후, 셉틴 함유 분획을 풀링하여 StrepTrap 컬럼에 적용했습니다(그림 2B). 이것은 일반적으로 약 3-5mL의 ~1μM 셉틴 복합체를 생성합니다. 셉틴 함유 분획을 풀링하기 전에, 변성 겔 전기영동을 사용하여 셉틴 서브유닛의 완전성 및 복합체를 형성하는 상이한 셉틴 서브유닛 사이의 등몰 화학량론적 비율을 확인할 수 있다. (그림 3A). 겔이 셉틴 서브유닛의 분자량(표 3)에 상응하는 유사하게 강렬한 밴드를 나타내면, 프로토콜은 계속될 수 있다. 그렇지 않은 경우 프로토콜을 다시 시작하는 것이 좋습니다. SEPT9_i1 가진 인간 셉틴 옥타머에 대해 도시된 예에서, 그림 3A 는 유사한 강도를 갖는 SEPT9_i1, SEPT6, SEPT7 및 SEPT2(위에서 아래 순서로)에 해당하는 대역을 명확하게 보여줍니다. 정규화된 강도의 99% 신뢰 구간은 SEPT2의 경우 1.128 ± 0.048, SEPT6의 경우 1.092 ± 0.034, SEPT7의 경우 1.108 ± 0.040, SEPT9의 경우 1.067 ± 0.029였습니다. SEPT2에 msfGFP 태그가 지정된 경우 SEPT9_i1 아래에서 매우 가깝게 이동합니다. 사용 된 전기 영동 시스템과 SEPT7에 대한 C- 말단 TEV-Strep 태그의 존재 (태그가없는 SEPT7보다 더 느리게 이동)에 따라 SEPT7 및 SEPT6 밴드는 비슷한 분자량으로 인해 때때로 병합됩니다. 다음 단계는 분획을 풀링하고 DTT로 셉틴 완충액에 대해 투석하는 것입니다. 투석 후, 농도가 너무 낮거나(&lt;2μM) 더 높은 농도가 실험에 필요한 경우, 프로토콜에 기재된 바와 같이 농축 단계가 포함될 수 있다. 1μM 미만의 농도는 일반적으로 셉틴의 나쁜 기능적 품질을 나타냅니다. 3.5 μM에서 7 μM 사이의 최종 셉틴 복합체 농도는 대부분의 시험관 내 분석에 적합합니다. 이러한 농도는 일반적으로 농도 후 부피가 0.5-1 mL에 도달 할 때 얻어집니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig02.jpg"> 그림 2: 어두운 인간 셉틴 octamers_9i1의 정제에 해당하는 크로마토그램의 예. (A) HisTrap 컬럼 크로마토그램. 셉틴 용리 피크 후, 흡광도는 0으로 돌아 가지 않는데, 이는 완충액에 이미 다졸이 존재하기 때문일 수 있습니다. 풀링된 분획은 용리 피크의 시작부터 흡광도가 약 250mL에서 안정화될 때까지 진행되었습니다. (B) 스트렙트랩 컬럼 크로마토그램. 풀링된 분획은 용리 피크의 시작부터 흡광도가 50mL에서 약 0으로 돌아올 때까지 진행되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
품질 관리를 계속하기 위해, 프로토콜에 기재된 바와 같이 천연 전기영동을 수행하였다(도 3B). 겔에서, 무손상 헤테로올리고머에 상응하는 메이저 밴드 및, 보통, 이량체에 대응하는 마이너 밴드가 관찰될 수 있다. 인간 헥사머는 242kDa 마커 밴드보다 약간 위에 있는 반면, 옥타머는 계산된 분자량보다 높은 480kDa 밴드 위에서 발견됩니다. 이들 밴드의 위치는 진핵세포 추출물32의 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인되었다. msfGFP로 태그를 지정하면 각 SEPT2가 msfGFP 단백질과 결합됩니다. 이로 인해 셉틴 복합체의 분자량이 53.4kDa(26.7kDa/msGFP 분자)로 증가합니다. 그럼에도 불구하고, 천연 전기영동 겔 상에서, msfGFP-태그된 복합체의 겉보기 분자량은 태그되지 않은 복합체의 겉보기 분자량과 구별할 수 없다.
셉틴 복합체가 손상되지 않았는지 여부를 테스트하는 보완 기술은 iSCAT 현미경에 의한 질량 측광법입니다. iSCAT은 기준광과의 간섭에 의해 증폭된 유리 슬라이드에 착륙하는 분자의 광산란(일반적으로 유리 슬라이드 바닥에 레이저가 반사됨)을 모니터링합니다. 그런 다음 배경 빼기 방식을 사용하여 입자에 대비를 제공합니다. 이러한 보정으로 인해, 신호는 입자가 유리 상에 떨어지는지 또는 유리로부터 멀어지는지에 따라 양수 및 음수 값을 나타낸다(49). 검출 된 신호는 단백질50의 분자량에 정비례합니다. 따라서 질량 표준물질을 사용한 신호 대 질량 교정은 샘플 단백질의 질량을 결정할 수 있습니다. 도 3C 는 SEPT9_i1 함유하는 인간 셉틴 옥타머의 예를 나타낸다. 검출된 단일 입자의 대부분(~50%)은 SEPT9_i1(423kDa)를 포함하는 완전한 옥타머에 대해 예상되는 분자량입니다(그림 3C). 150-300 kDa 사이의 질량을 가진 입자도 있지만 명확한 피크는 관찰되지 않아 다른 셉틴 종의 존재 가능성을 나타냅니다. 유사하게, mEGFP 태그가 부착된 초파리 헥사머에 대해 검출된 대부분의 단일 입자는 원형 헥사머(361kDa)에 대해 예상되는 분자량입니다(그림 3D). 241 kDa에서의 추가적인 명확한 피크는 2 개의 땅콩 단백질, 하나의 DSep1 및 1 개의 mEGFP-DSep2를 함유하는 안정한 사량 체의 존재를 나타낸다. 마지막으로, 인간 및 파리 셉틴 복합체는 모두 단량체와 이량 체의 혼합 일 수있는 약 80 kDa의 피크를 나타내며, 아마도 DTT 또는 응집하는 다른 소분자의 흔적에 의해 증폭되어 플롯(45)의 양성 측면에서 피크를 나타낸다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2.jpg"> 그림 3: 올리고머 품질 관리 결과 의 예. (a) 어두운 인간 셉틴 octamers_9i1의 정제로부터의 용리 피크의 상이한 분획을 나타내는 변성 겔의 예. (B) 상이한 셉틴 복합체의 천연 전기영동의 예. (씨,디) 셉틴 복합체의 12.5 nM에서의 질량 측광의 히스토그램 결과의 상이한 예: (C) 어두운 인간 셉틴 octamers_9i1 및 (D) DSep1-msfGFP 초파리 셉틴 헥사머. 선은 가우스 피팅입니다. (e) 셉틴 완충액 중 25 nM 어두운 인간 셉틴 octamers_9i1의 TEM 이미지. 스케일 바 = 200nm. (F) SEPT2-msfGFP 인간 셉틴 octamers_9i1의 클래스 평균 이미지. msfGFP 태그는 양쪽 끝에 퍼지 밀도로 표시됩니다. 스케일 바 = 10nm. 패널 (E)와 (F)는 The Company of Bioologists의 저작권이며 Iv et al.10 에서 허가를 받아 각색되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
네이티브 겔과 iSCAT 모두 앙상블 평균 정보만 제공한다는 점을 감안할 때, 단일 셉틴 올리고머의 투과 전자 현미경 이미지의 클래스 평균화를 사용하여 직접 시각화를 통해 복합체의 무결성과 순도를 확인했습니다. 셉틴 완충액에서 셉틴 복합체의 TEM 이미지에서 길이가 24nm(헥사머) 또는 32nm(옥타머)인 막대가 관찰될 수 있습니다. SEPT9_i1 함유하는 인간 셉틴 옥타머의 예는 도 3E에서 알 수 있다. 이들을 평균화할 때, 도 3F에서 SEPT9_i1 갖는 msfGFP-태그된 인간 옥타머에 대해 볼 수 있는 바와 같이, 각각의 서브유닛을 관찰하고 계수할 수 있다. 올리고머가 형광 표지된 경우 막대 끝에서 SEPT2-msfGFP에 해당하는 추가 밀도를 관찰할 수 있습니다(그림 3F).
상기 기술의 조합은 정확한 화학량론적 비율 및 고순도를 갖는 옥타머(또는 헥사머)가 설명된 프로토콜을 사용하여 정제될 수 있음을 증명한다. 마지막으로, 마지막 품질 관리 검사는 중합 능력 측면에서 셉틴 복합체의 기능에 대한 것입니다. 낮은 염 농도 (&lt;기재된 완충액9를 갖는 150 mM KCl)의 존재 하에서, 셉틴이 다른 단백질 또는 음으로 하전 된 지질 막의 존재 하에, 이들은 번들(9)로 자체 조립된다. 셉틴은 높은 (300 mM) KCl 농도를 갖는 저장 완충액에 보관함으로써 중합을 방지합니다. 그런 다음 셉틴 헤테로-올리고머를 KCl이 없는 동일한 조성의 완충액에서 1:6 부피비로 희석하여 50mM의 최종 KCl 농도를 달성합니다. 형광 이미징을 수행하기 위해 이 완충액은 광퇴색으로부터 보호하기 위한 산소 제거 시스템과 깜박이는 억제기로 보완됩니다. TIRF 현미경 검사에서 얕은 TIRF 필드 (~ 100 nm; 그림 4A, B). 컨포칼 현미경에서 필라멘트 구조의 큰 클러스터가 용액 위로 떠 있는 것을 볼 수 있습니다(그림 4C). 마지막으로, TEM을 사용하면 TIRF에 의해 관찰 된 클러스터에 해당하는 작은 셉틴 다발 (그림 4D)과 공초점 현미경으로 관찰 된 구조에 해당하는 큰 다발 (그림 4E)이 관찰 될 수있다. 그림 4D, E 의 삽입물은 두 가지 유형의 구조가 평행하게 실행되는 길고 얇은 필라멘트로 구성되어 끝이 가늘어지는 번들을 형성한다는 것을 보여줍니다. 형광 및 TEM 이미지는 함께 정제된 셉틴 복합체가 필라멘트로 중합될 수 있음을 증명하며, 필라멘트는 차례로 번들로 자체 조립됩니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig04.jpg"> 도 4: 중합능 품질 관리의 결과의 예. (A) fluoSPB 중 300nM 인간 셉틴 헥사머(10% msfGFP 표지 헥사머)의 TIRF 이미지. (B) fluoSPB 중 SEPT9_i1 (10 % msfGFP 표지 octamers9_i1)를 함유하는 300 nM 인간 셉틴 옥타머의 TIRF 이미지. (C) fluoSPB에서 300nM 인간 셉틴 octamers_9i3의 0.5μm 간격으로 ~30μm에 걸친 Z-스택의 공초점 최대 강도 투영. (A-C) 스케일 바 = 10 μm 및 반전 된 그레이 스케일. (D,E) (D) darkSPB에서 인간 셉틴 octamers_9i1의 작은 및 (E) 큰 다발의 TEM 이미지 예. 인셋은 번들 내에서 평행하게 실행되는 투명한 필라멘트가 관찰될 수 있는 영역을 보여줍니다. 스케일 바 = 500nm. 패널(C-E)은 The Company of Bioologists의 저작권이며 Iv et al.10에서 허가를 받아 각색되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 플라스미드 목록. 이 프로토콜에 따라 셉틴 올리고머를 정제하는 플라스미드. 모든 플라스미드는 Addgene (첫 번째 컬럼)에 기탁되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%201_V2.zip" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 2: 버퍼 목록. 셉틴 올리고머의 정제 및 품질 관리에 사용되는 완충액 조성물. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%202(1).xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 3: 분자량 및 흡광 계수. 복합체의 서열을 기반으로 ProtParam으로 계산된 파장 280nm에서의 분자량(MW) 및 광학 흡광 계수(ε) 목록, 셉틴 서브유닛, 상이한 셉틴 복합체 및 표 1에 나열된 플라스미드로 정제할 수 있는 고유한 셉틴 서브유닛(MW만)의 선형 융합을 가정합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%203.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

세포골격 단백질의 체외 재구성은 이러한 단백질의 기본 기능적 특성을 이해하는 데 필수적인 도구입니다. 본 논문은 세포 분열 및 이동에 중심적인 역할을 하는 재조합 셉틴 복합체의 품질을 정제하고 평가하는 프로토콜을 설명합니다.

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...

이 프로토콜은 고품질 셉틴 복합체를 정제하는 것을 가능하게 하며, 이는 세포에서 셉틴의 많은 역할을 연구하는 데 필수적입니다. 이 접근법의 가장 큰 장점은 Addgene 플라스미드를 사용하여 고품질 셉틴을 정제하는 간단한 절차를 합성하는 것입니다. Septins는 많은 상호 작용으로 인해 세포에서 연구하기가 어렵습니다.유황 재구성은 간단한 시스템에서 연구하여 이러한 복잡성을 푸는 데 도움이됩니다. 분해를 방지하기 위해 하루에 정제하는 것이 좋습니다. 우리의 경험에 따르면, 이것은 단백질의 수명과 품질을 증가시킬 것입니다.시작하려면 셰이커 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 600나노미터 파장의 광학 밀도가 표지되지 않은 셉틴의 경우 2-3, msfGFP 또는 mEGFP 표지된 셉틴의 경우 0.6-0.8에 도달할 때까지 형질전환된 박테리아 배양을 성장시킵니다. 배양 후, IPTG를 최종 농도 0.5 밀리몰로 첨가하여 단백질 발현을 유도하고, 표지되지 않은 셉틴 헤테로올리고머를 발현하는 세포를 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양하거나, msfGFP 표지된 헤테로올리고머를 발현하는 세포를 섭씨 17도에서 밤새 배양한다. 그런 다음 섭씨 4도에서 20 분 동안 4, 000 배 G에서 세포를 펠릿합니다.상청액을 버리고 펠릿을 100 밀리리터의 용해 완충액에 용해시켜 세포를 용해시킵니다. 다음으로, 30% 진폭의 팁 초음파 처리기를 사용하여 셀을 초음파 처리합니다. 섭씨 4도에서 30 분 동안 20, 000 배 G에서 원심 분리하여 세포 용해물을 명확히하고 상층액을 저장하십시오.선택적으로, 원고에 기술된대로 변성 전기 영동을위한 샘플을 채취하십시오. His-tagged septin의 친화성 크로마토그래피의 경우, 사전 충전된 니켈 세파로스 고성능 크로마토그래피 컬럼을 필요한 모든 완충액과 평형화합니다. 정화된 상청액을 컬럼에 로딩하고 크로마토그래피 시스템을 시작합니다.그런 다음 분당 1 밀리리터의 유속으로 50 % HisTrap 용리 완충액으로 셉틴 복합체를 용리시킵니다. 250 밀리몰의 이미 다졸 농도를 산출하려면 0.5 밀리리터 분획을 수집하십시오. 이제 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템으로 280나노미터에서 용리액의 광학 흡광도를 모니터링하고 셉틴 복합체가 포함된 분획을 선택합니다.Strep-II 태그된 단백질의 친화성 크로마토그래피를 위해 사전 충전된 스트렙탁틴 세파로스 고성능 크로마토그래피 컬럼을 셉틴 완충액으로 평형화합니다. 니켈 컬럼에서 회수된 셉틴 함유 분획을 분당 1밀리리터의 속도로 로드하고 크로마토그래피 시스템을 시작합니다. 그런 다음 결합 된 단백질을 세척하고 분당 1 밀리리터의 유속으로 100 % StrepTrap 용리 완충액으로 셉틴 복합체를 용리시킵니다.2.5 밀리몰 데스티오비오틴의 농도를 산출하려면 0.5 밀리리터 분획을 수집하십시오. 빠른 단백질 액체 크로마토그래피 시스템으로 온라인으로 모니터링된 280나노미터에서 용리액의 광학 흡광도로 표시된 셉틴 복합체를 포함하는 분획을 선택합니다. 투석에 의해 데스티오비오틴을 제거한 후 단백질 복합체를 원하는 분취량 크기로 분취하고, 분취량을 스냅 동결하고, 섭씨 영하 80도에서 보관한다.간섭계 산란 현미경의 경우, 유리 슬라이드 번호 1.5를 물, 이소프로판올, 그리고 다시 탈 이온수에서 각각 5 분 동안 초음파 세척기에서 초음파 처리하여 세척하십시오. 부드러운 질소 가스 흐름으로 두 개의 유리 슬라이드를 건조시킵니다. 그런 다음 슬라이드 중 하나의 중앙에 0.01 % Poly-L- 라이신 용액의 7 마이크로 리터 방울을 놓고 다른 슬라이드의 중심을 Poly-L-Lysine 방울 위에 놓고 두 슬라이드를 쉽게 분리 할 수 있도록 직각으로 향하게합니다.30초 동안 인큐베이션한 후, 탈이온수를 함유하는 비커에 한번 침지하고 직접 물 스트림을 2회 적용하여 슬라이드를 세척한다. 질소 가스 흐름으로 건조하면 이 슬라이드는 건조한 상태의 실온에서 약 6주 동안 보관할 수 있습니다. 실험 전에 2x2, 3x2 또는 3x3 개스킷 조각을 잘라 유리 슬라이드의 Poly-L-Lysine 처리 부분에 붙이고 슬라이드를 경량 와이퍼 티슈에 올려 슬라이드를 놓아 유리 슬라이드와 개스킷이 더러운 표면에 닿지 않도록 합니다.이제 피펫 팁으로 개스킷을 눌러 개스킷에있는 보호 플라스틱에 붙입니다. 다음으로 셉틴 버퍼를 실온으로 데우십시오. 손에 든 단백질을 해동하고 나중에 얼음 위에 보관하십시오.그런 다음 19 마이크로 리터의 셉틴 버퍼가 포함 된 상업용 질량 측광 시스템에 개스킷이있는 슬라이드를 놓고 자동 초점 옵션을 사용하여 현미경의 초점을 맞 춥니 다. 자동 초점 옵션을 사용하여 새 설정으로 다시 초점을 맞춥니다. 프로젝트 폴더를 만들려면 파일, 새 프로젝트 순을 차례로 클릭하고 데이터를 저장할 프로젝트 폴더를 로드하려면 파일, 프로젝트 로드를 차례로 클릭합니다.그런 다음 1 마이크로리터의 샘플을 19 마이크로리터의 격막 완충액 방울로 피펫팅합니다. 혼합하고 혼합하는 동안 슬라이드의 움직임을 방지하기 위해 아무것도 만지지 마십시오. 그런 다음 녹화를 클릭하여 6, 000 프레임 비디오를 녹화하십시오.제조업체의 소프트웨어를 사용하여 비디오를 분석하여 단백질 질량 분포를 얻습니다. 상이한 셉틴 헤테로올리고머 크기의 피크가 너무 많이 겹치거나 너무 많은 이벤트가 검출되면 최종 셉틴 농도를 감소시키고 다시 측정한다. 그리고 단일 분자의 충분한 수가 측정되지 않으면 셉틴 농도를 높이고 다시 측정하십시오.셉틴 분석을 위해 셉틴 완충액과 1 밀리몰 디티 오 트레이톨에서 원하는 최종 농도보다 6 배 높은 농도로 5X darkSPB와 100 % 다크 셉틴으로 구성된 셉틴 혼합물을 준비하십시오. 그런 다음 물, 20%5X darkSPB 및 16.67% 셉틴 혼합물을 이 특정 순서로 혼합하여 셉틴을 중합하고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 3-5 마이크로 리터의 샘플을 글로우 방전 전자 현미경 그리드에 추가하고 1 분 동안 배양하십시오.이제 darkSPB 버퍼 한 방울을 추가하여 그리드를 두 번 씻고 여과지로 액체를 흡수합니다. 물로 한 번 씻고 2 % 우라 닐 아세테이트로 30 초 동안 배양하십시오. 다음으로, 얼룩을 닦아내고 샘플을 몇 분 동안 자연 건조시킨다.그런 다음 셉틴 번들을 120 킬로 볼트로 이미지화하고 5, 000X와 60, 000X 사이의 배율을 1-2 마이크로 미터의 디 포커스로 이미지화합니다. HisTrap 및 StrepTrap 크로마토 그램은 풀링 된 분획이 용리 피크의 시작부터 흡광도가 각각 약 250 밀리리터 및 50 밀리리터에서 안정화 될 때까지 진행되었음을 보여주었습니다. 셉틴 밴드는 변성 겔 전기 영동에서 유사한 강도를 보여 셉틴이 손상되지 않았 음을 시사합니다.천연 전기영동에서, 무손상 헤테로올리고머에 상응하는 메이저 밴드 및 트리머 또는 사량체에 대응하는 마이너 밴드가 관찰되었다. msfGFP 태그된 복합체의 겉보기 분자량은 태그되지 않은 복합체의 겉보기 분자량과 구별할 수 없다. 질량 측광법은 셉틴의 온전한 옥타머와 헥사머를 검출했습니다.241 킬로달톤에서의 추가 피크는 두 개의 땅콩 단백질 인 DSep1 및 mEGFP-DSep2의 존재를 나타냅니다. 셉틴 복합체의 투과 전자 현미경 이미지는 헥사머와 옥타머의 막대를 보여주었습니다. msfGFP 태그는 셉틴 2 msfGFP 인간 셉틴 octamers_9i1의 양쪽 말단에 퍼지 밀도로 표시됩니다.단백질의 작은 클러스터는 얕은 TIRF 필드에서 관찰 될 수있다. 컨포칼 현미경 검사는 부유 필라멘트 구조의 큰 클러스터를 보여주었습니다. 투과 전자 현미경은 전체 내부 반사 형광 현미경 및 공초점 현미경으로 관찰 된 클러스터에 해당하는 작고 큰 셉틴 다발을 보여주었습니다.정제 중에 항상 얼음 위에서 작업하고 프로토콜에 지정된 신선한 시약을 추가하는 것이 좋습니다. 우리는 세포질 분열의 맥락에서 셉틴의 상호 작용에 관심이 있습니다. 우리는 현대의 막 액틴 및 미세 소관과 함께 셉틴을 재구성하여 현미경 검사와 여러 생물 물리학 적 분석으로 연구했습니다.우리는 정제된 셉틴을 사용하여 셉틴이 액틴 필라멘트, 미세소관 및 지질과 어떻게 상호 작용하는지 연구합니다. 그리고 우리는 또한 정제된 셉틴을 사용하여 셉틴이 세포 분열을 촉진하는 합성 세포를 만듭니다.

purification-quality-control-recombinant-septin-complexes-for-cell

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연구

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Biochemistry

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질량 분석법 (APMS)와 함께 태그 단백질의 친 화성 정화는 단백질 상호 작용 네트워크의 체계적인지도 및 생물학적 과정의 기계론의 기초를 조사하기위한 강력한 방법입니다. 여기, 우리는 세균 용으로 개발 된 최적화 된 연속 펩타이드 친 화성 (SPA) APMS 절차를...

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셉틴은 세포골격 단백질이다. 그들은 지질 막과 상호 작용하고 미크론 규모에서 막 곡률을 감지 할 수 있습니다. 우리는 막 변형, 곡률에 민감한 셉틴 결합 및 셉틴 필라멘트 초 구조를 분석하기위한 상향식 시험관 내 방법론을 설명합니다.

Bottom-Up In Vitro Methods to assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

이 프로토콜은 MultiBac Baculovirus 시스템을 사용하여 인간 myosin-7a holoenzyme을 재조합 생산하고 맞춤형 in vitro 필라멘트 글라이딩 분석을 사용하여 운동성을 연구하는 절차를 자세히 설명합니다.

인간 Myosin-7a의 MultiBac 시스템 기반 정제 및 생물물리학적 특성 분석

배우세요 세프틴 복합체 정제 프로토콜을 통해 세포 분열 및 이동 연구에 활용하는 방법을 익히세요. 고품질 단백질을 확보하여 세포골격 단백질의 상호작용을 효과적으로 분석할 수 있습니다.

무세포 재구성을 위한 재조합 셉틴 복합체의 정제 및 품질 관리

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