Name: 올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: 학습하세요 올리고뉴클레오티드의 5'-트리포스포릴화 화학 합성법을. 살리실 포스포로클로리디트와 피로인산을 이용하여 RNA, DNA, 비천연 L-RNA 등 다양한 서열과 골격 화학을 가진 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법을 익히세요.

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저자는 Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski 및 Katrina Tjhung에게 화학 삼인산화 반응에 대한 모범 사례에 대한 유용한 토론과 Gerald Joyce에게 유용한 의견을 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 보조금 MCB 2114588에 의해 지원되었습니다.

저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기에 설명된 트리포스포릴화 절차는 표준 포스포르아미다이트 화학을 이용한 올리고뉴클레오티드 합성과 광범위하게 양립가능하다. 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 포스파이트 상의 표준 β-시아노에틸, 및 핵염기의 외환형 아민 상의 이소부티릴, 디메틸포름아미딜, 아세틸, 페녹시아세틸 또는 4-이소프로필페녹시아세틸기를 포함하는 AMA39에서 신속한 탈보호와 양립가능한 염기-불안정한 보호기를 가져야 한다. 리보스 2'-히드록실기는 실릴 보호기, 즉 t-부틸디메틸실릴(TBDMS) 또는 트리이소프로필실릴옥시메틸(TOM)40,41에 의해 보호되어야 한다. 염기-불안정성 피발로일옥시메틸(PivOM) 그룹은 또한 화학적 트리포스포릴화30과 상용성인 것으로 보고되었다.
 합성 올리고뉴클레오티드28,29,30,31,32,33,34,35의 화학적 트리인산화에 대해 다수의 방법이 기술되었다. 우리는 Ludwig-Eckstein 시약37을 사용한 트리포스포릴화가 가장 접근하기 쉬운 것 중 하나라는 것을 발견했으며, 시약의 특수 합성과 특수 장비가 필요하지 않습니다. 이 방법에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트는 RNA 리보자임(RNABE ribozymes)의 기질로서 일상적으로 사용되어 왔으며, 효소적으로 접근이 불가능한 L-RNA 올리고뉴클레오티드 트리포스페이트를 사용하여 주형-의존적 합성 및 이 "미러-이미지" 핵산의 복제를 달성하는것을 포함하여 14,16,17,18 . 이 방법은 또한 척추동물 6,7에서 선천적 면역 반응의 강력한 활성화제인 작은 5'-트리포스포릴화된 줄기-루프 RNAs의 제조에 적합하다.
Ludwig-Eckstein 시약인 살리실 포스포로클로리다이트37은 물에 매우 반응성이 높으며, 올리고뉴클레오티드 컬럼에 로딩하기 전에 시약을 용해시킬 때 도입된 모든 물을 효과적으로 제거한다. 그러나, 이 시점 이후, 5'-포스피실화된 올리고뉴클레오티드는 피로포스페이트 위에 시스템에 도입된 임의의 물과 우선적으로 반응하여, 워크업 28,37,38 후에 5'-H-포스포네이트 부생성물을 형성할 것이다. 트리인산화 시약 및 트리인산화 반응 챔버를 조심스럽게 준비하면 이러한 부산물이 형성되지 않도록 한다. 용제 건조를 위해, 유형 4 Å 분자체는 대부분의 올리고뉴클레오티드 합성 시약 회사에 의해 다양한 상표명으로 대부분의 유기 용매와 호환되는 테프론 백에 미리 포장되어 판매됩니다. 무수 분위기 하에서 글로브 박스에서 트리포스포릴화를 수행하는 것과 같은 추가적인 예방조치는 일반적으로 필요하지 않다.
TBAP와 5'-포스피실화된 올리고뉴클레오티드의 반응은 고리형 5'-트리메타포스파이트 중간체를 형성하고, 이는 올리고뉴클레오티드 합성 산화제 용액(물/피리딘/THF의 요오드)을 사용하여 고리형 5'-트리메타포스페이트로 산화된다. 상업용 산화제 용액은 다양한 양의 요오드를 사용하며 트리포스페이트에 대한 완전한 산화를 보장하기 위해 높은 0.1M 요오드 농도를 사용하는 것이 필수적이라는 점에 유의해야합니다. 고리형 생성물은 동일한 용액(37)에서 최종 선형 5'-트리포스페이트로 가수분해되고, 물 이외의 친핵체와의 선형화가 필요한 경우 대안적인 무수 산화제 용액을 사용해야 한다(용도는 아래 참조)33. 그러나, 임의의 잔류 고리형 트리메타포스페이트는 올리고뉴클레오티드의 후속 알칼리성 탈보호 동안 선형화될 것이다. 순환 5'-트리메타포스페이트의 가수분해는 분지형 트리포스페이트37,46이 아닌 선형만을 산출한다.
올리고뉴클레오티드 탈보호는 전형적으로 5'-트리포스포릴화를 수용하기 위해 변형될 필요가 없지만, 몇 가지 예방책이 취해져야 한다. 삼인산염은 알칼리성 조건에 대한 짧은 노출로 비교적 안정하지만, 필요한 것보다 더 오래 AMA에 삼인산염을 노출시키지 않도록 주의해야 한다. 65°C에서 10분 이상 암모니아 또는 AMA에서 보다 장기간의 처리를 필요로 하는 보호기는 피해야 한다. 실온에서 암모니아에서 2h와 같은 보다 온화한 처리는 다른 포스포르아미다이트 보호기와 양립할 때 허용가능하다. 실릴-보호된 합성 RNA 올리고뉴클레오티드에 대한 일반적인, 빠른 탈보호 방법은 트리에틸아민 트리히드로플루오라이드 및 고온47을 이용한다; 그러나, RNA 5'-트리포스페이트를 제조할 때는 장기간 산성 조건이 트리포스페이트 가수분해31,32를 가속화하는 것으로 밝혀짐에 따라 이것은 피해야 한다.
제조 PAGE는 5'-트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드의 탈보호 후 정제를 위한 가장 간단하고 가장 신뢰할 수 있는 방법임이 입증되었다(도 3 및 도 4). 그러나, 제조용 역상 HPLC는 또한 트리인산화된 생성물을 정제하는데 사용될 수 있다. 5'-디포스페이트 및 5'-모노포스페이트 생성물의 존재는 질량 분광법에 의한 삼인산화를 검증할 때 일상적으로 관찰된다. 우리는 화학 합성 또는 전사에 의해 제조 된 고순도 물질로부터 질량 분광법 중에 5'-트리 포스페이트 단편화를 관찰했으며, 특히 장비가 올리고 뉴클레오티드 분석에 최적화되지 않은 경우 특히 그렇습니다. 그럼에도 불구하고, RP-LC 분석은 종종 5'-디포스페이트 부산물의 10%-20%가 더 긴 5'-트리포스포릴화 올리고뉴클레오티드에 존재한다는 것을 보여준다(도 4). 트리부틸암모늄 피로포스페이트의 상업적 제제는 20% 모노포스페이트로 오염될 수 있으며, 이는 트리포스포릴화 동안 부생성물로서 5'-디포스페이트를 산출할 것이다30,31. 이 시약을 사내에서 조심스럽게 준비하면 훨씬 더 순수한 TBAP 주식(31)을 얻을 수 있다. 그러나, 우리는 TBAP의 상업적 공급원을 사용하여 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드가 시험관내 전사에 의해 제조된 물질에 비해 효소 반응에서 기질로서 사용될 때 여전히 필적할만한 또는 더 큰 반응성을 나타낸다는 것을 발견하였다 (도 5B).
루드비히-에크슈타인 시약을 사용한 트리포스포릴화 올리고뉴클레오티드의 한 가지 주목할만한 추가의 사용은 고리형 트리메타포스파이트 중간체33을 이용한다. 후속 산화 단계가 무수 조건 하에서 올리고뉴클레오티드 산화에 자주 사용되는 헥산 중의 1 M t-부틸 퍼옥사이드로 진행되면, 포스파이트의 산화는 고리 개구 가수분해 없이 발생하여, 고리형 트리메타포스페이트를 산출한다. 이 중간체는 이어서 일차 아민 또는 알콜 친핵체와 반응하여 γ-포스페이트에서 변형된 5'-트리포스페이트를 수득할 수 있다. 이러한 변형은 포스포르아미데이트 결합에 의해 연결된 친유성 태그의 첨가를 포함하며, 이는 RP-LC에 의한 신속한 트리포스페이트 특이적 정제를 용이하게 하고, 이어서 트리포스페이트33으로부터 태그의 산성 가수분해를 수반한다. γ-포스페이트 위치에서의 형광 변형은 또한 리보자임-촉매 라이게이션 반응(15,33)을 위한 실시간 형광 리포터로서 사용하기 위해 도입될 수 있다.

RNA의 5'-트리포스포릴화된 형태는 생명의 모든 도메인에서의 RNA 전사와 많은 RNA 바이러스의 수명주기 동안 RNA 복제에 의해 생성되기 때문에 생물학에서 유비쿼터스이다. 이들 트리포스페이트는 진핵생물에서 7-메틸구아닐레이트-캡핑된 mRNA의 형성을 위한 기질로서 작용하며, 따라서, 단백질 발현1에 필수적인 역할을 한다. 대조적으로, 삼인산염은 박테리아와 바이러스에 보유된다; 따라서, RNA 5'-트리포스페이트는 진핵생물 2,3,4,5,6,7에서 선천적 면역 반응 조절자에 의해 인식된다. 생물학 밖에서, RNA 리가아제 리보자임의 숙주는 시험관내8에서 5'-트리포스페이트를 사용하도록 진화되었고, 진단 검정 9,10,11,12,13,14,15에 사용하기 위해 변형되었다. 하나의 그러한 리보자임은 작은 L-RNA 올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트16,17,18로부터의 천연 D-RNA의 비생물학적 "미러-이미지" 거울상이성질체인 L-RNA의 주형-의존성 합성에 사용될 수 있다. 다양한 서열 및 백본 조성의 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드의 일상적인 준비는 이들 시스템을 조사하는 데 필수적이다.
실험실에서 RNA 5'-트리포스페이트를 제조하는 가장 일반적이고 접근하기 쉬운 방법은 시험관내 전사에 의한 것이다. 그러나, 이러한 방법에 의해 생산된 RNA는 RNA 중합효소의 프로모터 및 기질 요건에 의해 서열 및 크기가 제한된다. T7 RNA 중합효소 및 특수 유도체는 이러한 목적을 위해 사용되는 가장 일반적인 중합효소(19,20,21,22)이다. 이들 효소로 제조된 시험관내 전사된 RNA는 5'-말단 퓨린으로 시작되어야 하며, 처음 10개 뉴클레오티드23,24에서 퓨린에 강하게 편향된다. 더욱이, 염기 또는 골격-변형된 뉴클레오티드의 효소적 혼입은 기껏해야 비효율적이며 천연 중합효소로는 더 자주 불가능하며, 천연 D-RNA 이외의 것으로 구성된 올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트를 생산할 기회를 제한한다. 또 다른 제한 인자는 시험관내 전사에 의해 생성된 RNA가 실질적인 5'- 및 3'- 이질성을 함유할 수 있고, 20 nt 23,24,25,26,27보다 짧을 때 매우 이질적인 생성물로서 생성된다는 것이다.
대조적으로, 고상 포스포르아미다이트 합성에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화28,29,30,31,32,33,34,35는 임의의 서열의 3-50 nt 길이의 올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트를 제조하는데 사용될 수 있다. 추가적으로, 포스포르아미다이트 합성에 접근할 수 있는 방대한 핵산 변형은 5'-트리포스포릴화 14,15,16,17,18,29,36 이전에 올리고뉴클레오티드에 첨가될 수 있다. 이들 방법 중 다수는 모노뉴클레오시드37의 용액상 트리포스포릴화를 위해 Ludwig 및 Eckstein에 의해 개발된 포스피틸화 시약 살리실 포스포로클로리다이트를 사용한다. 이 시약을 사용한 올리고뉴클레오티드의 트리포스포릴화는 올리고뉴클레오티드 5'-히드록실의 포스피틸화, 피로포스페이트와의 반응 및 산화에 의한 트리포스페이트로의 전환, 이어서 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드의 절단, 탈보호 및 정제를 위한 표준 절차에 의해 고체상 상에서 달성된다(도 1)28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> 도 1: 합성 올리고뉴클레오티드의 트리포스포릴화를 위한 반응식. 첫 번째 단계에서, 올리고뉴클레오티드 5ʹ-히드록실은 SalPCl로 포스피틸화된다. 다음 단계에서, 5ʹ-살리실 포스파이트는 TBAP와 반응하여 고리형 메타포스파이트를 형성한 다음, 세 번째 단계에서 산화되어 DNA/RNA 합성기 산화 용액(0.1 M 요오드/피리딘/H2O/THF)에서 순환 5ʹ-트리메타포스페이트를 생성하고, 이는 신속하게 가수분해되어 동일한 용액28,33에서 선형 5ʹ-트리포스페이트를 생성하며, 37. 고체 CPG 지지체로부터의 후속 알칼리성 절단 및 수성 MeNH2/암모니아 중의 올리고뉴클레오티드의 탈보호는 임의의 잔류 고리형 트리메타포스페이트를 선형 형태로 가수분해할 것이다. 약어: SalPCl = 살리실 포스포로클로리다이트; TBAP = 트리부틸암모늄 피로포스페이트; THF = 테트라히드로푸란; CPG = 조절된 기공 유리; MeNH2 = 메틸아민. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이 방법을 사용하는 초기 발표 된 보고서는 종종 불량한 수율과 바람직하지 않은 부제품 28,37,38로 고통 받았지만 무수 조건을주의 깊게 유지하는 것이 일상적으로 높은 수율을 얻는 데 필요한 모든 것입니다. 이는 시약을 신중하게 준비하고 표준 플라스틱 성분으로 조립 된 간단한 반응 장치를 사용하여 달성 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 시약의 제조, 반응 챔버의 조립, 트리포스포릴화 반응, 및 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드의 후속 탈보호 및 정제를 포함하는 올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화를 위한 적절한 단계를 입증한다. 또한 천연 D-RNA 및 비생물적 L-RNA 골격을 갖는 더 큰 핵산 생성물의 합성을 위한 리가아제 리보자임(ligase ribozymes)을 위한 기질로서 5'-트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드의 대표적인 용도가 포함된다.

<table><tbody><tr><td>0.22 & 마이크로; m 폴리 에테르 설폰 주사기 필터</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>분쇄 된 폴리 아크릴 아미드 겔 입자를 제거하기위한 주사기 필터 (섹션 5)</td></tr> <tr><td>0.22 &마이크로; m PTFE 주사기 필터</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLLG013SL</td><td>CPG 수지 제거용 주사기 필터 (섹션 5)</td></tr><tr><td>1 mL 플라스틱 주사기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td><td>triphosphorylation apparatus의 구성 요소 (섹션 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>1,4- 디옥산, 무수</td><td>MilliporeSigma</td><td>296309</td><td>Triphosphorylation 용매 (섹션 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>2- 클로로 -4H-1,3,2- 벤조 디 옥사 포스 포린 -4- 온, 살리실 포스 포로 클로리디 다이트 (SalPCl)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>324124</td><td>Triphosphorylation 시약 (섹션 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>30 mL 유리 병</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>트리 인산화 용매 및 TBAP 용액 준비용 병 (섹션 2)</td></tr> <tr><td>3 방향 마개, 폴리 카보네이트 / 폴리 프로필렌</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>7328103</td><td>트리 인산화 장치의 구성 요소 (섹션 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>40 % 아크릴 아미드 / 비스 - 아크릴 아미드 용액, 19 : 1</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>PAGE (섹션 5 &ndash; 7)</td></tr> <tr><td>아세토 니트릴, 무수, 100 mL</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>Triphosphorylation 용매 (섹션 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>암모니아 중화 트랩</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 및 ANS121</td><td>Speedvac DNA130 (섹션 5)</td></tr> <tr><td>과황산 암모늄 (APS)</td> <td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610700</td><td>PAGE, 아크릴 아미드 중합 용 촉매 (섹션 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>수성 암모니아, 28 %</td> <td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>AMA 탈보호 시약 준비 (섹션 5)</td></tr> <tr><td>수성 메틸 아민, 40 %</td> <td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>AMA 탈보호 시약 준비 (섹션 5)</td></tr> <tr><td>Automated DNA / RNA oligonucleotide synthesizer</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 DNA / RNA Synthesizer</td><td>모든 컬럼 기반 합성기 허용 (섹션 1)</td></tr><tr><td>비드 캡처 자석</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>스트렙타비딘 비드 캡처용(섹션 7)</td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610404</td><td>PAGE 요소 로딩 버퍼용(섹션 5)</td></tr><tr><td>딥 진공 오일 펌프</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>동결 건조기와 함께 사용(섹션 5)</td></tr><tr><td>드리어라이트 건조제, 10-20 메시</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>삼인산화 화학물질 및 장비 보관용 건조제(섹션 1&ndash; 2)</td></tr> <tr>HOUSE에서 제조된 <td>D-RNA 27.3t 교차 키랄 중합효소</td><td>18</td><td>5&prime;-GGUGGAGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAGGGCG AGCACCACC-3&PRIME;</td><td>교차 키랄 리보자임 반응(섹션 7)</td></tr><tr><td>D-RNA CPG 고체 지지대, 1,000&Aring;, 사전 포장된 1 &마이크로; 두더지 합성 컬럼</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>대표, D-RNA 올리고뉴클레오티드 합성(섹션 1)</td></tr><tr><td>D-RNA TOM-protected phosphoramidites</td><td>ChemGenes</td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td><td>대표, D-RNA 올리고뉴클레오티드 합성(섹션 1)</td></tr><tr><td>Empty Expedite 합성 컬럼, 1&micro; m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Expedite DNA/RNA 합성제(섹션 1)</td></tr><tr><td>EPPS, N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N&prime;-(3-프로판설폰산), 고체</td><td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td><td>리보자임 반응 완충액 성분(섹션 6)</td></tr><tr><td>에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 고체</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>2가 금속 이온 킬레이터와 함께 사용하기 위한 합성 컬럼 ( 섹션 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>신속한 합성 컬럼용 필터</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>빈 합성 컬럼과 함께 사용하기 위한 신속한 합성 컬럼 필터(섹션 1)</td></tr> <tr><td>형광등/인광 젤 스캐너</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB, 29187193</td><td>분석 페이지 시각화용(섹션 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>포름 아미드, 탈 이온화</td><td>된 VWR 생명 과학</td><td>97062</td><td>PAGE 포름 아미드 젤 로딩 버퍼 (섹션 6&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>겔 이미지 정량 분석 소프트웨어</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>스캔 된 겔 이미지 정량화 (섹션 6)</td></tr> <tr><td>유리 건조제</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>Triphosphorylation 용매 저장 (섹션 2)</td></tr> <tr><td>L-RNA CPG 고체 지지대, 1,000&Aring;, 벌크</td><td>ChemGenes</td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>L-RNA 올리고 뉴클레오티드 합성 (섹션 1)</td></tr><tr><td></td><td>house18</td><td>5&prime;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime</td>에서 준비된 L-RNA 귀상어 템플릿;<td>교차 키랄 리보자임 반응(섹션 7)</td></tr><tr><td>house18</td><td>5&prime;-fluorescein-GGCUCGA-3&prime</td>에서 준비된 <td>L-RNA 프라이머</td>;<td>교차 키랄 리보자임 반응(섹션 7)</td></tr><tr><td>L-RNA TOM-protected phosphoramidites</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>L-RNA 올리고뉴클레오티드 합성 (섹션 1)</td></tr><tr><td>동결 건조기/동결 건조기</td><td>VirTis</td><td>Benchtop K</td><td>올리고뉴클레오티드 농축용(섹션 5)</td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물, 고체</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>리보자임 반응용(섹션 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>N,N-디메틸포름아미드, 무수</td><td>MilliporeSigma</td><td>227056</td><td>Triphosphorylation 용매(섹션 2)</td></tr><tr><td>NAP-25 탈염 컬럼(Sephadex G-25 수지)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45000150</td><td>Sephadex G-25 수지를 포함하는 일회용 중력 흐름 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(섹션 5)</td></tr><tr><td>Non-coring 스테인리스 스틸 바늘, 20G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-815-410</td><td>피어싱 고무 격막용 바늘 (섹션 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>올리고 뉴클레오티드 소광 계수 계산기</td><td>통합 DNA Technologies</td><td>OligoAnalyzer 도구</td><td>최근접 이웃 모델 짧은 올리고 뉴클레오티드 260nm 흡광 계수 계산기 (섹션 5)</td></tr> <tr><td>산화제 용액, THF / 피리딘 / 물</td><td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td><td>Triphosphorylation 시약 (섹션 4)</td></tr> <tr><td>PAGE 플레이트</td><td>Timberrock / CBS</td><td>NGP-250-BO 및 NO</td><td>PAGE의 경우 (섹션 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>PAGE 전력 공급</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>For PAGE (단면도 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>PAGE 스페이서 및 빗 (분석)</td> <td>Timberrock / CBS</td><td>VGS-0725 및 VGC-0714</td><td>PAGE (섹션 6&ndash; 7)</td></tr><tr><td>PAGE 간격 장치 및 빗 (예비품)</td> <td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-3025R 및 VGC-3001</td><td>페이지 (단면도 5)</td></tr> <tr><td>페이지 대</td><td>Timberrock/CBS</td><td>ASG-250</td><td>(단면도 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td><td>트리인산화장치용 왁스 밀봉 필름(섹션 2&ndash; 4)</td></tr> <tr><td>PCR thermocycler</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch Thermalcycler</td><td>교차 키랄 리보자임 반응 (섹션 7)</td></tr> <tr><td>PD 10 탈염 컬럼 (Sephadex G-10 수지)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>올리고 뉴클레오티드 < 15 nt (섹션 5)</td></tr> <tr><td>인광 스크린</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>32P 표지 RNA 시각화용(섹션 6)</td></tr><tr><td>Phosphoramidite 합성 시약</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4060-62</td><td>대표, 표준 RNA/DNA 합성용(섹션 1)</td></tr><tr><td>폴리프로필렌 나사 캡 밀봉 가능 튜브</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>나사 캡 및 실리콘 O-링이 있는 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브, 안전한 AMA 탈보호( section 5)</td></tr><tr><td>피리딘, 무수</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>Triphosphorylation 용매 (section 2)</td></tr><tr><td>역상 액체 크로마토그래피/전기 분무 이온화 질량 분석법(RP-LC/ESI-MS)</td><td>Novatia</td><td>n/a</td><td>올리고뉴클레오티드를 전문으로 하는 LC/MS를 위한 상용 서비스(섹션 5)</td></tr><tr><td>고무 격막(ID x OD 7.9 mm x 14 mm), 흰색</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>트리포스포릴화 용매 및 TBAP 제조를 위한 셉타(섹션 2)</td></tr><tr>집에서 준비한 <td>자가 복제기 리보자임 E</td><td>14</td><td>5&prime;-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGUGACCGCA ACUUA-3&PRIME;</td><td>자가 복제자 리보자임 반응(섹션 6)</td></tr><tr><td>자가 복제기 기질 A</td>는 <td>house14</td><td>5&prime;-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3&prime;-OH</td><td>자가 복제기 리보자임 반응의 경우 (섹션 6)</td></tr> <tr><td>자가 복제기 기질 B, 전사</td><td>house14</td><td>5&prime;-pppGAGACCGCAA CUUA-3&prime;</td><td>자가 복제자 리보자임 반응(섹션 6)</td></tr><tr><td>작은 건조 트랩, 4 &Aring; 분 자체</td><td>ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>DNA / RNA 합성제 인산 암 및 삼인화 시약 용 건조 트랩 (섹션 1&ndash; 2)</td></tr> <tr><td>염화나트륨 (NaCl), 다양한</td> 완충액에 사용하기위한 고체 <td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td><td>소금 (섹션 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>수산화 나트륨 (NaOH),</td> 다양한 완충액에 사용하기위한 고체 <td>MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>소금 (섹션 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>통계 데이터 피팅 소프트웨어</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>분석 PAGE에서 키네틱 모델로 데이터 피팅용(섹션 6)</td></tr><tr><td>Streptavidin-coated 마그네틱 비드</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>교차 키랄 리보자임 반응에서 비오틴 표지 RNA 캡처용(섹션 7)</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>PAGE 요소 로딩 버퍼용(섹션 5)</td></tr><tr><td>TBE 러닝 버퍼, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ62788K3</td><td>For PAGE (섹션 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>Tetrabutylammonium Fluoride, Tetrahydrofuran</td><td>Aldrich</td>의 1.0M 용액 <td></td><td>216143 2&prime; -silyl 보호 그룹 제거용 (섹션 5)</td></tr> <tr><td>테트라 메틸 에틸렌 디아민 (TEMED)</td> <td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610801</td><td>PAGE (섹션 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>트리 부틸 아민</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>Triphosphorylation 시약 (섹션 2)</td></tr> <tr><td>트리부틸 암모늄 피로 인산 (TBAP)</td> <td>MilliporeSigma</td><td>P8533</td><td>Triphosphorylation 시약 (섹션 2)</td></tr> <tr><td>Tris base</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>다양한 완충액에 사용하기위한 완충제 (섹션 5&ndash; 7)</td></tr><tr><td>TWEEN20 폴리소르베이트 세제</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>자성 비드와 함께 사용하기 위한 중성 세제 (섹션 7)</td></tr><tr><td>Urea</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>PAGE 및 젤 로딩 버퍼용 (섹션 5&ndash; 7)</td></tr> <tr><td>UV-Vis 분광 광도계</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000, ND2000</td><td>올리고 뉴클레오티드 농도 측정 (섹션 5)</td></tr> <tr><td>진공 원심 분리기</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 진공 농축기</td><td>AMA 및 THF 제거용 (섹션 5)</td></tr> <tr><td>Xylene cyanol</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610423</td><td>PAGE 요소 로딩 버퍼 (섹션 5)</td></tr></tbody></table>

올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

5'-트리포스페이트는 모든 생애에서 발견되는 필수적인 핵산 변형이며, 생명공학 및 합성 생물학에서 올리고뉴클레오티드의 기능적 변형으로 점점 더 많이 사용되고 있다. 올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트는 역사적으로 효소적 방법에 의해 시험관내에서 제조되어 왔다. 그러나, 이들 방법은 천연 RNA 올리고뉴클레오티드로 제한되고, 강한 서열 선호도를 가지며, 이종 생성물을 생산하는 경향이 있다. 화학적 트리포스포릴화의 새로운 방법은 포스포르아미다이트 화학에 의한 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성의 비용 절감과 현재 이용 가능한 다양한 뉴클레오티드 변형을 보완한다. 따라서, 임의의 서열 및 길이의 올리고뉴클레오티드 트리포스페이트의 합성, 및 선택적으로 다양한 비천연 변형을 함유하는, 이제 접근이 가능하다.
이 논문은 살리실 포스포로클로리다이트 및 피로포스페이트를 사용하는 올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화를 위한 적절한 방법 및 기술을 제시한다. 이 방법은 상업적으로 이용가능한 시약을 사용하고, 표준 고상 합성 방법에 의해 제조된 대부분의 올리고뉴클레오티드와 상용성이며, 탈보호 및 정제 전에 올리고뉴클레오티드 합성에 이어 2시간 내에 완료될 수 있다. 촉매 RNA 효소를 위한 기질로서 화학적으로 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드의 두 가지 용도가 입증되며, 비생물학적 L-RNA 트리포스페이트로부터의 해머헤드 리보자임의 미러 이미지 버전의 합성을 포함한다.

올리고뉴클레오티드는 포스포르아미다이트와 자동화된 DNA/RNA 합성기에 적합한 표준 프로토콜을 사용하여 합성되어야 하며, 생성물 올리고뉴클레오티드는 원래의 플라스틱 합성 컬럼의 고체 지지체로부터 분리되고, 5ʹ-말단 디메톡시트리틸 그룹을 제거하여 자유 5ʹ-히드록실을 생성한다(섹션 1). 이 데모에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 고체 지지체로서 1,000 Å 조절된 공극 유리(CPG) 수지를 사용하여 제조되고 0.2 또는 1 μmole 규모로 진행되었다. 합성기 컬럼, 수지, 시약 및 포스포르아미다이트의 대표적인 예가 물질의 표에 제공된다. 더 큰 규모의 반응의 경우, 후속 단계에서 사용되는 부피와 시간을 조정해야 할 수도 있습니다.
상기 트리포스포릴화 반응은 표 of Materials에 열거된 표준적이고 상업적으로 이용가능한 성분들을 사용하여 맞춤형 반응 챔버(도 2, 섹션 3)에서 컬럼 상에서 수행되며, 도 1(섹션 4)28에 예시된 반응식을 따른다. 삼인산화 동안 조건을 엄격하게 무수로 유지하고, 모든 용매 및 시약을 미리 분자 체를 통해 준비하고 사용 전에 완전히 건조시키는 것이 중요합니다 (섹션 2). 트리포스포릴화는 전형적으로 일어나기까지 2시간이 걸리고, 그 후, 세척 및 건조된 컬럼은 표준 올리고뉴클레오티드 탈보호 및 정제 절차에 따라 처리될 수 있다(섹션 5).
탈보호 후, 올리고뉴클레오티드 트리포스페이트는 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 변성시켜 정제하여, 겔로부터 적출 및 용출될 수 있는 UV 백섀도잉에 의해 단일 주요 생성물 밴드를 나타낸다. 도 3A,B의 DNA 트리뉴클레오타이드 5ʹ-트리포스페이트, pppAAA 및 pppCCC, 및 L-RNA 트리뉴클레오타이드 5ʹ-트리포스페이트 pppGAA에 대해 나타낸 바와 같이 5'-트리포스페이트 생성물은 짧은 올리고뉴클레오티드에 대한 반응 측면 생성물로부터 쉽게 분리된다. AAA 및 CCC DNA 삼량체에 대한 5'-히드록실 및 5'-트리포스페이트 생성물 둘 다를 질량 분광법에 의해 적출 및 동정하고 도 3A에 상응하게 표지하였다. AAA DNA 삼량체에 대해 보이는 바와 같이 추가의 밴드는 일반적으로 회수 및 식별하기에 충분한 물질을 함유하지 않는다. 그러나 이들 밴드의 존재는 정제되지 않은 반응 생성물 내의 추가적인 생성물 질량과 상관관계가 있으며(도 3C), 전형적으로 아래에 논의된 바와 같이 5'-디포스페이트, 모노포스페이트 및 H-포스포네이트 부산물을 나타낸다.
PAGE 정제 후, 더 큰 올리고뉴클레오티드는 분쇄 및 담금질 방법(42 ) 및 후속 에탄올 침전을 사용하여 용출될 수 있다. 그러나, 15 nt 미만의 올리고뉴클레오티드는 에탄올이 효율적으로 침전될 수 없으며, 따라서, 겔 용출을 위한 변형된 절차가 필요하다(단계 5.11.3). 물질 표 에 열거된 일회용 크기 배제 컬럼은 10 nt보다 긴 올리고뉴클레오티드와 함께 사용하는 것에 대해서만 평가된다. 그러나 우리는 삼량체만큼 짧은 올리고뉴클레오티드가 제조업체의 권장 프로토콜을 사용하여 효과적으로 탈염 될 수 있음을 발견했습니다. 그럼에도 불구하고, 짧은 올리고뉴클레오티드를 탈염할 때(단계 5.6 및 5.11.3에서와 같이) 컬럼 용출액은 분획으로 수집하고, 생성물 분획은 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 260nm에서의 흡광도로 확인하는 것이 좋다. 더 짧은 올리고뉴클레오티드에 대해 최적화된 크기 배제 컬럼이 대안적인 선택으로서 물질의 표 에 제공된다. 정제 후 합성된 올리고뉴클레오타이드 1 μmole 스케일로부터의 최종 수율은 50-300 nmol이다.
트리포스포릴화는 질량 분광법에 의해 확인될 수 있는데, 여기서 트리인산화된 생성물은 5'-히드록실 올리고뉴클레오티드보다 +239.94 Da 큰 질량을 갖지만, 5'-디- 및 모노포스페이트(각각 +159.96 및 +79.98 Da)에 상응하는 물질의 존재는 종종 관찰된다. 5'-OH 질량으로부터 +63.98 Da의 질량을 갖는 5'-H-포스포네이트 측 생성물이 또한 관찰될 수 있고, 이 생성물의 높은 수준은 트리포스포릴화 동안의 조건이 충분히 무수적이지 않았음을 나타낸다. 정제 전에, 탈보호된 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 이러한 모든 생성물을 보여주지만(도 3C), 정제된 물질은 5'-디- 및 모노포스페이트와 함께 5'-트리포스페이트 생성물에 상응하는 피크를 보여줄 것이다(도 3D,E).
질량 분광법만으로는 일반적으로 이온화 동안 삼인산염의 차등 속도 및 단편화로 인해 5'-트리포스페이트 순도의 엄격한 측정을 제공하지 않습니다. 최종 생성물 순도를 측정하기 위해, 역상 액체 크로마토그래피 및 탠덤 ESI-MS(RP-LC/ESI-MS)가 권장되며, 특히 더 긴 올리고뉴클레오티드의 경우 더욱 그렇습니다. RP-LC/ESI-MS에 의한 D-RNA 5ʹ-트리포스페이트 pppACGAGG 및 pppGAGACCGCAACUUA의 분석(각각 도 4A, B)은 20% 5ʹ-디포스페이트를 포함하는 전형적인 최종 생성물 순도를 보여주는데, 이는 이 두 종들이 더 긴 올리고뉴클레오티드에 존재할 때 분리하기 어렵기 때문이다.
합성 5'-트리포스페이트 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 생화학적 연구에서 효소적으로 제조된 물질보다 잘 또는 더 잘 기능한다. 섹션 6에서, 일례로, 합성적으로 또는 시험관내 전사에 의해 제조된 5'-트리포스페이트 14 nt RNA 기질을 RNA-촉매화된 자가-복제 반응 14,15,43,44,45에서 비교하였다. 리보자임 E는 기질 A와 B의 결합을 촉매하여 기하급수적으로 성장할 수 있는 자가촉매 반응에서 E의 새로운 카피를 생성한다(도 5A). E 및 32P표지된 A 성분은 시험관내 전사에 의해 제조되었고, 트리포스포릴화된 기질 B는 상기 기재된 바와 같이 합성적으로, 또는 시험관내 전사14에 의해 제조되었다. 자기 복제 반응 진행은 PAGE를 변성시켜 분석하고 형광/인광 겔 스캐너를 통해 정량화한 주기적인 샘플을 취하여 모니터링하였다. 물류 성장 기능에 적합한 결과 데이터는 전사 된 기질 또는 합성 B 기질이 기하 급수적 인 성장을 지원하지만 합성 B는 약간 더 많은 양의 제품을 제공한다는 것을 보여주었습니다 (그림 5B). 이러한 결과는 시험관내 전사23,24에 의해 제조된 RNA의 5'-말단에서의 조성적 이질성을 반영할 수 있다.
화학적 트리포스포릴화는 또한 시험관내 또는 세포에서 생물학적으로 제조될 수 없는 올리고뉴클레오티드 트리포스페이트의 합성을 가능하게 한다. 섹션 7에서, 섹션 1-5에서와 같이 제조된 천연 D-RNA의 거울상이성질체인 L-RNA로 구성된 비생물학적 트리포스페이트 올리고뉴클레오티드를 D-RNA "교차-키랄" 중합효소 리보자임 27.3t(도 6A)의 기질로 사용하였고, 이는 짧은 L-RNA 올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트로부터의 더 긴 L-RNA 생성물의 주형 지향 중합을 서열-일반적인 방식으로 촉매한다. 일례로서, 리보자임은 해머헤드 자가절단 모티프의 L-RNA 버전을 합성할 수 있다(도 6B)18. 정제된 L-RNA 트리뉴클레오티드 트리포스페이트를 플루오레세인 표지된 L-RNA 프라이머 및 L-RNA 주형(도 6C)과 결합시키고, 교차 키랄 리가아제와 반응시켰다. 반응 과정에 걸친 샘플을 PAGE로 분석하고 형광/인광 겔 스캐너를 사용하여 이미징하여 주형에 의해 코딩되는 해머헤드 리보자임의 L-RNA 버전의 합성을 입증하였다(도 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> 그림 3: 트리뉴클레오타이드 5ʹ-트리포스페이트의 정제. (A) DNA 트리뉴클레오티드의 트리포스포릴화의 PAGE 분석(UV-back-shadowing에 의해 시각화됨)은 트리데옥시아데노신(AAA, blue) 및 트리데옥시시티딘(CCC, 적색)이며, 사소한 측면 생성물을 시각화하기 위해 의도적으로 과부하되었다. 5ʹ-트리포스페이트 생성물(ppp) 및 5ʹ-히드록실(OH) 출발 물질을 모두 적출하고 MALDI-MS에 의해 확인하였다. (B) 주요 생성물 밴드를 적출하고 ESI-MS에 의해 5ʹ-트리포스페이트(ppp)로 확인된 L-RNA 트리뉴클레오티드 GAA의 트리포스포릴화의 준비 PAGE. (C) 탈보호 후의 조 반응 생성물의 MALDI-MS 및 (D) (A)로부터의 정제된 생성물. 5ʹ-트리포스페이트 (ppp; pppAAA 예상 1,119 Da, 관찰 1,118 Da; pppCCC 예상 1,047 Da, 관찰 1,046); 5ʹ-디포스페이트(pp), 5ʹ-모노포스페이트(p), 5ʹ-하이드록실(OH) 및 5ʹ-H-포스포네이트(Hp)라는 라벨이 붙어 있다. (E) (B)로부터 분리된 5ʹ-트리포스페이트 생성물의 직접 주입 ESI-MS로부터의 디컨볼루션된 질량 스펙트럼, 확인된 피크가 표지된 (예상 1,181.6 Da, 관찰된 1,181.0 Da). 5ʹ-디포스페이트 (pp) 생성물도 관찰되며, 트리포스페이트 및 디포스페이트 생성물 (+22 Da) 모두에 대한 나트륨 이온 피크도 관찰된다. 일반적인 오염 물질 피크에는 별표가 표시되어 있습니다. 비교의 용이성을 위해, 질량 스펙트럼은 각 스펙트럼에서 측정된 가장 높은 강도로 정규화되었고, 그 값에 상대적인 백분율로 보고된다. 약어: PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; MALDI-MS = 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화; ESI-MS = 전기 분무 이온화 질량 분광법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> 도 4: 6 nt 및 14 nt D-RNA 올리고뉴클레오티드 트리포스페이트의 분석 RP-LC . (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ 및 (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandem ESI-MS는 둘 다의 주요 피크 (~ 70 %)를 5ʹ-triphosphate (ppp)로 확인했으며, 5ʹ-diphosphate (pp)의 양은 적습니다. 약어: RP-LC = 역상 액체 크로마토그래피; nt = 뉴클레오티드; ESI-MS = 전기 분무 이온화 질량 분광법. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> 그림 5: 화학적 합성 또는 시험관내 전사에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드 5ʹ-트리포스페이트 기질의 비교. (A) 자가복제 리보자임 E는 RNA A와 5'-트리 포스포릴화 RNA B를 리게이트한다. (B) 합성(개방 원) 또는 시험관내 전사(채워진 원)인 10μM A 및 10μM B를 사용한 자가 복제 반응의 비교. (B) 데이터는 로지스틱 성장 방정식에 적합하였다: [E] = a/(1+b e-ct), 여기서 a는 최종 수율이고, b는 시그모이디시티의 정도이고, c는 지수 성장률이다. 두 반응의 성장률은 1.14 h-1에서 동일했지만 최종 범위는 합성 B와의 반응에 대해 10 % 더 높았습니다.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> 도 6: 리보자임과의 교차-키랄 L-RNA 중합. (A) L-RNA의 주형-의존성 라이게이션을 촉매하는 D-RNA 27.3t 중합효소 리보자임. (b) 27.3t에 의해 합성된 L-RNA 생성물은 해머헤드 엔도뉴클레아제 모티프의 일부를 형성한다. (c) 비오티닐화된 L-RNA 주형(갈색), 말단 표지된 L-RNA 프라이머(마젠타), 및 네 개의 L-RNA 트리뉴클레오티드 트리포스페이트(시안)를 사용하여 27.3t에 의해 촉매된 L-RNA 중합, 합성적으로 제조됨. (d) 4 h 및 24 h에서 (B)의 연장 산물의 PAGE 분석은, 전장 생성물 (검은 점)까지의 각각의 트리뉴클레오티드 혼입을 보여준다. 미반응 L-RNA 프라이머는 참조 마커로서 포함된다. 약어: PAGE = 폴리아크릴아미드 겔 전기영동; M = 참조 마커. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트는 필수 생물학적 경로에서 유비쿼터스 성분이며 생명 공학 응용에 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 여기에서, 우리는 표준 자동화 합성 기술에 의해 제조된 올리고뉴클레오티드로부터 출발하여 올리고뉴클레오티드 5'-트리포스페이트의 일상적인 합성 및 정제를 위한 기술을 기술한다.

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

Triphosphorylation은 생물학에서 RNA의 유비쿼터스 5' 변형이며 생명 공학 응용 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 여기에 요약된 프로토콜은 표준 자동 합성에 의해 제조된 임의의 올리고뉴클레오티드의 5'트리포스포릴화를 가능하게 한다. 화학적 트리포스포릴화는 RNA, DNA 또는 비천연 핵산을 포함하는 올리고뉴클레오티드에 작용한다.여기서, 생물학적 D-RNA의 거울상이성질체인 트리인산화된 왼손잡이 L-RNA는 정제되어 합성되어 리보솜 반응에 사용된다. 트리포스포릴화는 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성 후 및 탈보호 전에 수행된다. 이 단계는 여기에 나와 있지 않지만 연구원은 두 가지 모두에 대한 표준 방법에 익숙해야합니다.시작하려면 인산화를 위한 작업 공간에 적어도 두 개의 라인이 있는 가스 매니폴드가 있고 트리포스포릴화 반응이 아르곤 하에서 수행되어야 하므로 조절 가능한 압력으로 건조 아르곤 소스에 연결된 버블러가 있는지 확인하십시오. 그런 다음 한 밀리리터의 플라스틱 주사기를 라인에 부착하여 반응 장치와의 연결을 용이하게합니다. 다음으로, 1 밀리리터 플라스틱 주사기, 3 방향 폴리프로필렌 스토콕, 비코링 바늘, 1.5 밀리리터 폴리프로필렌 튜브, 작은 금속 주걱을 포함하는 장비를 수집하고, 사용 전에 적어도 하루 동안 실온에서 건조제와 함께 밀봉된 용기 또는 데시케이터에 보관한다.아르곤 압력 하에서 밀폐 된 병에서 무수 1, 4- 다이옥산 30 밀리리터를 인출하십시오. 말린 30 밀리리터 유리 병에 옮기고 건조 트랩을 추가하십시오. 고무 셉타로 밀봉하고 건조제가있는 데시케이터에 보관하십시오.유사하게, 30 밀리리터의 N,N-디메틸포름아미드, 아세토니트릴, 및 3부 디옥산 및 한 부분 피리딘의 혼합물을 부피별로 준비한다. 원고에 기재된 바와 같이 고체 트리부틸암모늄 피로포스페이트와 디메틸포름아미드 및 트리부틸아민을 30밀리리터 유리 병에 혼합하여 TBAP 용액을 제조하였다. 세 개의 드로잉 트랩을 추가합니다.병을 아르곤 아래의 고무 격막으로 밀봉하고 아르곤으로 거품을 30 분 동안 밀봉하십시오. 자동화 된 DNA/RNA 합성기를 사용하여 합성 컬럼 상에서 유리 5'히드록실을 갖는 올리고뉴클레오티드를 준비한 후. 건조된 한 밀리리터 주사기로부터 플런저를 제거하여 챔버를 준비한다.가위 또는 면도날을 사용하여 주사기 상단을 자르고 주사기를 합성 컬럼에 부착하십시오. 주사기의 상단에 세 방향 스톱콕을 부착하고 스톱콕의 측면 입구를 버블러가있는 건조 아르곤 소스에 부착하여 스톱콕의 상단 입구가 시약 주입 포트 역할을하도록하십시오. 이 작업자를 클램프가 있는 스탠드에 고정하고 왁스 씰링 필름으로 모든 업스트림 조인트를 밀봉합니다.그런 다음 주입 포트가 닫히고 장치가 아르곤 소스에 개방되도록 스톱콕을 조정하십시오. 버블러를 닫고 저압에서 아르곤이 다섯 분 동안 작용 챔버를 통해 흐르게하십시오. 버블러를 다시 연 후, 주사기를 폐기물 주사기가 될 합성 컬럼의 바닥에 부착하십시오.다음으로, 폐기물 주사기를 사용하여 컬럼을 통해 아르곤을 반복적으로 당긴 다음 플런저가 완전히 밀어 넣어 주사기를 다시 부착하십시오. 시약 또는 용매를 추가하려면 바늘을 건조 아르곤 소스에 부착하고 시약 또는 용매 병 중격에 넣고 바늘을 병 내용물에 담그지 않도록주의하십시오. 그런 다음 바늘로 건조한 주사기를 조립하고 병 내용물에 담그지 않고 시약 또는 용매 병 격막에 삽입하십시오.그런 다음 주사기를 아르곤으로 채우고 중격에서 바늘을 꺼내 아르곤을 배출하십시오. 주사기를 아르곤으로 채우고 한 번 더 배출 한 후 아르곤 압력 하에서 필요한 부피의 용매 또는 시약으로 주사기를 채 웁니다. 아르곤 소스가 닫히고 주입 포트가 열리도록 스톱콕을 조정하십시오.장치의 정지가 신속하게 조정되면 채워진 주사기 및 바늘을 소스 병에서 제거하고 바늘의 측면 또는 팁에 달라 붙은 용매를 닦아 낸 다음 바늘을 주사 포트에 삽입하십시오. 시약을 작업자의 안티 챔버 내로 배출 한 다음 바늘을 제거하고 장치를 아르곤 소스로 다시 열면서 주입구를 닫습니다. 폐기물 주사기를 사용하여 합성 컬럼을 통해 안티 챔버로부터 액체를 부드럽게 끌어당겨 모든 액체가 이제 폐주사기 내에 유지되도록 한다.이제 천천히 용액을 합성 컬럼으로 밀어 넣어 컬럼에 가스 버블이 없도록 합니다. 혼합하거나 교반하려면 폐주사기로 용액을 컬럼 위로 부드럽게 위아래로 당깁니다. 컬럼에서 시약 또는 용매를 제거하려면 용액을 폐주사기로 천천히 당깁니다.용액의 벌크가 폐주사기 내로 통과된 후, 아르곤을 통해 당겨 컬럼으로부터 잔여 용매를 플러시한다. 다음으로, 폐주사기 접합부 주위의 왁스 밀봉 필름을 제거한다. 그런 다음 주사기를 제거하고 폐기물을 버리십시오.그런 다음 폐주사기를 새로운 건조 주사기로 교체하고 관절을 다시 밀봉하십시오. 트리포스포릴화 장치를 조립한 후, 이전에 입증된 바와 같이 200 마이크로리터의 피리딘 디옥산을 항-챔버에 첨가함으로써 트리포스포릴화 반응을 시작한다. 그러나 아직 샘플을 합성 컬럼으로 끌어 당기지 마십시오.원고에 기재된 바와 같이 SalPCl을 다이옥산에 용해시킨 후, 이를 항-챔버에 첨가하고, 건조 주사기를 사용하여 합성 컬럼 상에 로딩한다. 그런 다음 15분 동안 반응시킨 다음 이전에 입증된 바와 같이 폐주사기를 사용하여 SalPCl 용액을 제거 및 폐기한다. SalPCl 용액을 제거한 직후, 250 마이크로리터의 TBAP 용액을 안티챔버에 첨가하고, 합성 컬럼 상에 로딩한다.앞에서 설명한 것처럼 동요와 함께 20 분 동안 반응시키고 버리십시오. 그 후, 컬럼을 0.5 밀리리터의 N,N-디메틸포름아미드로 세척한 다음, 0.5 밀리리터의 아세토니트릴로 세척하고, 각각의 첨가 후에 용매를 제거하였다. 산화제 용액을 첨가 한 후, 그것을 제거하고 표시된 동일한 절차를 사용하여 다시 아세토니트릴로 컬럼을 세척하고, 장치를 분해하고 다섯 밀리리터의 아세토니트릴로 컬럼을 세척한다.그런 다음 기둥을 말립니다. 트리포스포릴화된 올리고뉴클레오티드를 고체 지지체로부터 절단하고, 원고에 기재된 바와 같은 표준 프로토콜을 사용하여 탈보호한다. 다음으로, 건조된 탈보호 올리고뉴클레오티드를 우레아 로딩 완충액에 용해시키고, 섭씨 80도로 가열한 다음, 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩하고, 25 내지 35와트에서 일-2시간 동안 실행한다.겔 전기영동이 끝나면 겔 플레이트를 제거한 후 분해하고 겔을 폴리 염화 비닐 필름으로 감쌉니다. 다음으로, 254 나노미터 자외선으로 백섀도잉하여 제품 밴드를 식별하고 면도날을 사용하여 주요 제품 밴드를 소비한다. 적출된 겔을 플라스틱 주사기를 통해 또는 기계적으로 압출하여 분쇄한다.15 뉴클레오티드보다 짧은 올리고뉴클레오티드의 경우, 교반 또는 진탕으로 적어도 12시간 동안 뉴클레아제 유리 물의 겔 부피의 3배에서 용출시킨다. 그런 다음 용액을 0.2 마이크로미터 필터가 장착된 주사기를 통해 통과시켜 고체 겔 조각을 제거하고 동결건조하여 농축시킨다. 농축 후, 일회용 크기 배제 컬럼을 사용하여 잔류 염 및 경례를 제거하고 앞서 입증된 바와 같이 동결건조에 의해 농축한다.원고에 기재된 중합효소 리보자임 및 L-RNA 프라이머 주형 및 트리포스페이트 트리뉴클레오티드를 함유하는 RNA 용액 10 마이크로리터를 제조한 후, 이를 1분 동안 섭씨 90도까지 가열하고 PCR 열순환기에서 초당 섭씨 0.2도에서 섭씨 23도까지 냉각하여 어닐링한다. RNA 용액을 섭씨 17도에서 인큐베이션한 후, 반응이 진행됨에 따라 시작 완충액의 두 배 농도의 10 마이크로리터를 첨가하여 반응을 중지시키고, 10 마이크로리터 분취량을 취하고, pH 8에서 0.5몰 EDTA의 5마이크로리터로 켄칭하고, 원고에 기재된 바와 같이 RNA를 분리하기 위해 각 샘플을 처리한다. 침전된 RNA를 10 마이크로리터의 정형화된 겔 로딩 완충액에 용해시키고, 텍스트에 기재된 바와 같이 미반응 말단 표지된 프라이머를 제조하였다.샘플이 준비되면 섭씨 80도까지 가열하십시오. 각 웰에 다섯 마이크로 리터의 샘플을 로딩하고 약 40 분 동안 40 와트에서 겔을 실행하십시오. 스탠드로부터 겔 플레이트를 제거한 후, 형광 또는 인광 겔 스캐너를 사용하여 스캔하여 교차 키랄 L-RNA 연장 생성물을 시각화한다.겔 정제 후, UV 백 섀도잉은 AAA 및 CCC DNA 삼량체 및 GAA L-RNA 삼량체에 대해 나타낸 바와 같이 단일 주요 생성물로서 5'트리포스페이트의 존재를 드러낸다. 5'히드록실 측 생성물은 종종 더 느린 이동 밴드로 보이며, 이는 DNA 삼량체에 대한 질량 분광법에 의해 분리되고 확인되었다. 겔 정제 동안 추가의 밴드는 정제되지 않은 반응 생성물의 질량 분광분석에서 5'디포스페이트, 모노포스페이트, 및 H-포스포네이트 부생성물과 상관관계가 있다.5' 트리포스페이트 생성물은 5' 디포스페이트 및 모노포스페이트 질량과 함께 5'트리포스페이트에 상응하는 일차 질량 피크를 나타낸다. 화학적으로 트리포스페이트 관련 L-RNA 트리뉴클레오티드를 RNA 중합 반응에서 L-RNA 프라이머 및 L-RNA 주형과 함께 사용하여 PAGE로 분석하고 형광 겔 스캐너를 사용하여 영상화하였다. 검은 원으로 표시된 확장 된 생성물은 템플릿에 의해 인코딩 된 해머 헤드 리보자임의 L-RNA 버전의 합성을 입증했습니다.트리인산화 동안 물에 노출되면 수율이 감소합니다. 건조 시약을 준비하고 반응 장치를 조심스럽게 조립하는 단계를 따르십시오. 씰이 깨지지 않도록 장치를 통해 유체를 천천히 이동하십시오.화학적 트리포스포릴화는 왼손잡이 RNA를 포함한 비생물학적 올리고뉴클레오티드 트리포스페이트를 제조하는데 필수적이다. 이것은 생물학에서 발견되는 RNA 분자의 거울 이미지 버전의 교차 키랄 리보자임 합성을 가능하게 했다.

chemical-triphosphorylation-of-oligonucleotides

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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올리고뉴클레오티드의 화학적 트리포스포릴화

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