Bottom-Up In Vitro Methods to assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

이 프로토콜을 사용하여 다양한 곡률을 나타내는 패턴 기질에서 세포 골격 필라멘트 단백질의 조직을 시각화했습니다. 곡률 감도를 테스트할 수 있습니다. 주사 전자 현미경 이미지의 해상도는 나노 미터 규모의 조직을 시각화 할 수있을만큼 충분히 높습니다.

우리가 고정에 사용하는 방법은 단백질의 구조 내 조직을 보존하기에 충분히 온화합니다. 이것은 세포 골격 필라멘트의 행동을 이해하기위한 기초 연구의 범위에 남아 있습니다. 먼저 클린룸 환경에서 250나노미터 진폭과 2마이크로미터 측면 주기성의 물결 모양의 폴리디메틸실록산 물결 모양의 물결 모양의 물결 모양 Norland 광학 접착제(NOA 복제본)를 설계합니다.

이렇게 하려면 직경 1cm의 원형 유리 커버 슬립에 5마이크로리터의 액체 NOA를 증착한 다음 PDMS 템플릿을 드롭에 놓습니다. 어셈블리를 320나노미터의 UV 광으로 5분 동안 처리하여 액체 NOA를 얇은 폴리머 필름으로 광중합합니다. 완료되면 새로 중합된 NOA로 커버 슬립에서 PDMS 템플릿을 부드럽게 떼어냅니다.

공기 플라즈마 클리너를 사용하여 NOA 필름을 5분 동안 처리하여 표면을 친수성으로 만듭니다. 원고에 설명 된대로 작은 단층 소포 또는 SUV의 용액을 준비하고 용액이 투명해질 때까지 욕조 초음파 처리기에서 초음파 처리 하에 관찰 버퍼에 건조 된 지질 필름을 재현탁하여 SUV를 얻습니다. 나중에 NOA 패턴을 지지하는 커버 슬립을 세포 배양 상자의 웰 내에 삽입하고 갓 빛나는 배출된 NOA 패턴을 100마이크로리터의 밀리리터당 1밀리그램의 SUV 용액으로 실온에서 30분 동안 배양하여 지지된 지질 이중층을 생성합니다.

융합되지 않은 SUV를 제거하려면 두 번의 세척 사이에 샘플을 완전히 건조시키지 않고 셉틴 저염 완충액으로 측면을 6번 완전히 헹굽니다. 옥토머성 셉틴 스톡 용액을 셉틴 저염 완충액에서 10 내지 100 나노몰 및 1 밀리리터의 부피 범위의 최종 농도로 희석한다. 이어서, 단백질 용액을 실온에서 1시간 동안 슬라이드 상에서 인큐베이션한다.

융합된 지지 지질 이중층을 포함하는 NOA 슬라이드를 세척하고 셉틴 저염 완충액으로 단백질을 배양합니다. 셉틴 저염 완충액을 섭씨 37도에서 예열한 0.1몰 카코딜산나트륨 완충액에 2%글루타르알데히드 정착액으로 교체하고 반응을 15분 동안 진행하고 고정된 샘플을 0.1몰 카코딜산나트륨으로 각각 5분씩 세 번 세척합니다. 세척 후, 샘플을 사산화오스뮴의 고정 용액에서 배양하고, 이어서 탄닌산을 여과하고, 최종적으로 여과된 우라닐 아세테이트를 각각 10분 동안 배양한다.

모든 용액 후에 증류수에서 샘플을 세 번 씻으십시오. 샘플을 각각 2-3 분 동안 50 %에서 100 %까지 시작하는 에탄올 용액에서 직렬로 배양합니다. 유리 슬라이드를 에탄올로 미리 채워진 임계점 건조기 내부로 옮기고 제조업체의 건조 지침을 따르십시오.

건조된 샘플은 매우 흡습성이므로 커버 슬립을 스텁에 부착하여 즉시 코팅하십시오. 그런 다음 페인트 덩어리를 만들지 않고 커버 슬립의 윗면에 은색 페인트 스트립을 추가하십시오. 스텁과의 연결이 만족 스러운지 확인하십시오.

샘플이 완전히 증발하면 플라즈마 마그네트론 스퍼터링 헤드와 회전식 유성 스테이지가 장착 된 장치를 사용하고 제조업체에서 제공 한 표준 프로토콜을 따르십시오. 120 밀리 암페어에서 60 초 동안 사전 스퍼터링을 수행하여 표면의 산화물 층을 제거합니다. 그런 다음 1.5 나노 미터의 텅스텐을 90 밀리 암페어의 필름 두께 모니터와 50 밀리리터의 작동 거리로 증착하십시오.

나중에 샘플을 진공 하에 보관하여 SEM 분석 전후까지 주변 공기로부터 샘플을 보호합니다. 내륙 검출기로 2차 전자를 검출하여 고용액 이미징을 달성하려면 가속 전압을 3킬로볼트로 설정하고 빔 전류를 20마이크로미터 조리개로 설정합니다. 관찰의 경우 픽셀당 21.25나노미터에서 픽셀당 1.224나노미터 범위의 해상도를 사용합니다.

데이터 분석을 위해 픽셀당 5.58나노미터의 해상도를 사용합니다. 고해상도 관찰의 경우 작동 거리를 1-2mm 사이로 설정하고 피사계 심도를 늘려야 하는 경우 약 3mm 사이로 설정합니다. 스캔 속도와 라인 통합을 지속적으로 조정하여 이미지당 약 30-45초의 획득 시간으로 일정한 신호 대 노이즈 비율을 보장합니다.

대표적인 분석은 셉틴 필라멘트에 증착 된 물질이 1.5 나노 미터의 백금과 1.5 나노 미터의 텅스텐을 갖는 물결 모양의 PDMS 패턴에 미치는 영향을 보여줍니다. 벌거 벗은 거대한 단층 소포 또는 GUV가 완벽하게 구형이라는 것이 관찰되었습니다. 셉틴 유도 변형 후, 소포는면 처리 된 것처럼 보였고 변형은 정적 인 상태로 유지되어 변동하지 않았습니다.

더 높은 농도의 셉틴에서, 소포의주기적인 변형이 관찰되었다. 큰 단층 소포 또는 LUV에 결합된 셉틴 필라멘트의 자가 조립을 극저온 전자 현미경 이미지로 검사하고 기울어진 시리즈에서 3D 재구성을 얻었습니다. 셉틴 필라멘트의 곡률 의존적 배열은 주사 전자 현미경으로 시각화되었습니다.

저배율에서는 음의 곡률과 양의 곡률의 주기성을 갖는 물결 모양의 패턴이 보였다. 셉틴 필라멘트의 초 구조적 조직은 더 높은 배율로 관찰되었습니다. NOA는 성능 저하를 방지하기 위해 부드럽게 벗겨야 합니다.

이미징 후 필라멘트 간격 및 필라멘트의 방향과 같이 SCM으로 시각화된 초미세 구조 특징을 정량화하기 위해 일부 이미지 분석을 수행할 수 있습니다. 본 방법은 셉틴에 적용되었지만 다른 세포 골격 단백질 또는 긴 필라멘트로 구성되어 곡률에 민감한 단백질에도 사용할 수 있습니다.