Name: Bottom-Up In Vitro Methods to assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-17T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 학습하세요 세프틴과 지질막 상호작용을 분석하는 하향식 시험관 내 방법을 통해 막 곡률 감지 및 세포골격 단백질의 초미세구조를 연구하는 기술을. 이 프로토콜은 주사전자현미경과 크라이오전자현미경을 활용하여 나노미터 규모의 세프틴 필라멘트 배열을 시각화하고 정량적으로 분석합니다.

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Patricia Bassereau와 Daniel Lévy에게 유용한 조언과 토론에 감사드립니다. 이 작업은 프로젝트 "SEPTIME", ANR-13-JSV8-0002-01, ANR SEPTIMORF ANR-17-CE13-0014 및 프로젝트 "SEPTSCORT", ANR-20-CE11-0014-01에 자금을 지원하기위한 ANR (Agence Nationale de la Recherche)의 지원으로부터 이익을 얻었습니다. B. Chauvin은 Ecole Doctorale "ED564 : Physique en Ile de France"와 Fondation pour lea Recherche Médicale이 자금을 지원합니다. K. Nakazawa는 Sorbonne Université (AAP Emergence)의 지원을 받았습니다. G.H. Koenderink는 'BaSyC-Building a Synthetic Cell'을 통해 Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO/OCW)의 지원을 받았습니다. 중력 교부금(024.003.019). Labex Cell(n)Scale (ANR-11-LABX0038)과 Paris Sciences et Lettres (ANR-10-IDEX-0001-02)에 감사드립니다. 프랑스 국립 연구 인프라 프랑스-바이오이미징(ANR10-INBS-04)의 회원인 세포 및 조직 이미징(PICT-IBiSA), Institut Curie에게 감사드립니다.

<ol><li>Finger, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reining+in+cytokinesis+with+a+septin+corral%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%3A+News+and+Reviews+in+Molecular%2C+Cellular+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Reining in cytokinesis with a septin corral.</a> BioEssays: News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 27 (1), 5-8 (2005).</li>
<li>Barral, Y., Kinoshita, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+shed+light+onto+septin+assemblies+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural insights shed light onto septin assemblies and function.</a> Current Opinion in Cell Biology. 20 (1), 12-18 (2008).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+septin+diffusion+barrier+at+the+base+of+the+primary+cilium+maintains+ciliary+membrane+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A septin diffusion barrier at the base of the primary cilium maintains ciliary membrane protein distribution.</a> Science. 329 (5990), 436-439 (2010).</li>
<li>Lin, Y. -H., Kuo, Y. -C., Chiang, H. -S., Kuo, P. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+septin+family+in+spermiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">The role of the septin family in spermiogenesis.</a> Spermatogenesis. 1 (4), 298-302 (2011).</li>
<li>Addi, C., Bai, J., Echard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+microtubule%2C+septin+and+ESCRT+filament+remodeling+during+late+steps+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin, microtubule, septin and ESCRT filament remodeling during late steps of cytokinesis.</a> Current Opinion in Cell Biology. 50, 27-34 (2018).</li>
<li>Spiliotis, E. T., Kesisova, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+microtubule-dependent+transport+by+septin+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of microtubule-dependent transport by septin GTPases.</a> Trends in Cell Biology. 31 (12), 979-993 (2021).</li>
<li>Spiliotis, E. T., Nakos, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions+of+actin-+and+microtubule-associated+septins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Cellular functions of actin- and microtubule-associated septins.</a> Current Biology: CB. 31 (10), 651-666 (2021).</li>
<li>Salameh, J., Cantaloube, I., Benoit, B., Poüs, C., Baillet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc42+and+its+BORG2+and+BORG3+effectors+control+the+subcellular+localization+of+septins+between+actin+stress+fibers+and+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Cdc42 and its BORG2 and BORG3 effectors control the subcellular localization of septins between actin stress fibers and microtubules.</a> Current Biology: CB. 31 (18), 4088-4103 (2021).</li>
<li>Ewers, H., Tada, T., Petersen, J. D., Racz, B., Sheng, M., Choquet, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+septin-dependent+diffusion+barrier+at+dendritic+spine+necks%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">A septin-dependent diffusion barrier at dendritic spine necks.</a> PloS One. 9 (12), 113916(2014).</li>
<li>Myles, D. G., Primakoff, P., Koppel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+localized+surface+protein+of+guinea+pig+sperm+exhibits+free+diffusion+in+its+domain%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A localized surface protein of guinea pig sperm exhibits free diffusion in its domain.</a> The Journal of Cell Biology. 98 (5), 1905-1909 (1984).</li>
<li>Luedeke, C., Frei, S. B., Sbalzarini, I., Schwarz, H., Spang, A., Barral, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin-dependent+compartmentalization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+yeast+polarized+growth%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Septin-dependent compartmentalization of the endoplasmic reticulum during yeast polarized growth.</a> The Journal of Cell Biology. 169 (6), 897-908 (2005).</li>
<li>Gilden, J. K., Peck, S., Chen, Y. -C. M., Krummel, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+septin+cytoskeleton+facilitates+membrane+retraction+during+motility+and+blebbing%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The septin cytoskeleton facilitates membrane retraction during motility and blebbing.</a> The Journal of Cell Biology. 196 (1), 103-114 (2012).</li>
<li>Dolat, L., Hu, Q., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+functions+in+organ+system+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Septin functions in organ system physiology and pathology.</a> Biological Chemistry. 395 (2), 123-141 (2014).</li>
<li>Angelis, D., Spiliotis, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+mutations+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Septin mutations in human cancers.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 122(2016).</li>
<li>Takehashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin+3+gene+polymorphism+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression%22%5BJournal%5D)">Septin 3 gene polymorphism in Alzheimer's disease.</a> Gene Expression. 11 (5-6), 263-270 (2004).</li>
<li>Shuman, B., Momany, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septins+from+protists+to+people%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Septins from protists to people.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 824850(2022).</li>
<li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+cerevisiae+septins%3A+supramolecular+organization+of+heterooligomers+and+the+mechanism+of+filament+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces cerevisiae septins: supramolecular organization of heterooligomers and the mechanism of filament assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (24), 8274-8279 (2008).</li>
<li>Iv, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+animal+septins+using+recombinant+human+septin+octamers+with+distinct+SEPT9+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cell+science%22%5BJournal%5D)">Insights into animal septins using recombinant human septin octamers with distinct SEPT9 isoforms.</a> Journal of cell science. 134 (15), (2021).</li>
<li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reshaping+by+micrometric+curvature+sensitive+septin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+communications%22%5BJournal%5D)">Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments.</a> Nature communications. 10 (1), 420(2019).</li>
<li>Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micron-scale+plasma+membrane+curvature+is+recognized+by+the+septin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton.</a> The Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).</li>
<li>Patzig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin%2Fanillin+filaments+scaffold+central+nervous+system+myelin+to+accelerate+nerve+conduction%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Septin/anillin filaments scaffold central nervous system myelin to accelerate nerve conduction.</a> eLife. 5, 17119(2016).</li>
<li>Szuba, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+binding+controls+ordered+self-assembly+of+animal+septins%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Membrane binding controls ordered self-assembly of animal septins.</a> eLife. 10, 63349(2021).</li>
<li>Tanaka-Takiguchi, Y., Kinoshita, M., Takiguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin-mediated+uniform+bracing+of+phospholipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Septin-mediated uniform bracing of phospholipid membranes.</a> Current Biology: CB. 19 (2), 140-145 (2009).</li>
<li>Bertin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylinositol-4%2C5-bisphosphate+promotes+budding+yeast+septin+filament+assembly+and+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate promotes budding yeast septin filament assembly and organization.</a> Journal of Molecular Biology. 404 (4), 711-731 (2010).</li>
<li>Beber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Septin-based+readout+of+PI%284%2C5%29P2+incorporation+into+membranes+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Septin-based readout of PI(4,5)P2 incorporation into membranes of giant unilamellar vesicles.</a> Cytoskeleton. 76 (4,5), 92-103 (2019).</li>
<li>Mastronarde, D. N., Held, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+tilt+series+alignment+and+tomographic+reconstruction+in+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Automated tilt series alignment and tomographic reconstruction in IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 197 (2), 102-113 (2017).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> Journal of Structural Biology. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
<li>Nania, M., Foglia, F., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-100+nm+wrinkling+of+polydimethylsiloxane+by+double+frontal+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Sub-100 nm wrinkling of polydimethylsiloxane by double frontal oxidation.</a> Nanoscale. 9 (5), 2030-2037 (2017).</li>
<li>Nania, M., Matar, O. K., Cabral, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frontal+vitrification+of+PDMS+using+air+plasma+and+consequences+for+surface+wrinkling%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Frontal vitrification of PDMS using air plasma and consequences for surface wrinkling.</a> Soft Matter. 11 (15), 3067-3075 (2015).</li>
<li>Svitkina, T. M., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+light+and+electron+microscopy+of+the+cytoskeleton+of+cultured+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Correlative light and electron microscopy of the cytoskeleton of cultured cells.</a> Methods in Enzymology. 298, 570-592 (1998).</li>
<li>Franck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clathrin+plaques+and+associated+actin+anchor+intermediate+filaments+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Clathrin plaques and associated actin anchor intermediate filaments in skeletal muscle.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (5), 579-590 (2019).</li>
<li>Elkhatib, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+clathrin%2FAP-2+lattices+pinch+collagen+fibers+to+support+3D+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tubular clathrin/AP-2 lattices pinch collagen fibers to support 3D cell migration.</a> Science. 356 (6343), (2017).</li>
<li>Stokroos, I., Kalicharan, D., Van Der Want, J. J., Jongebloed, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+thin+coatings+of+Au%2FPd%2C+Pt+and+Cr+produced+by+magnetron+sputtering+for+FE-SEM%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">A comparative study of thin coatings of Au/Pd, Pt and Cr produced by magnetron sputtering for FE-SEM.</a> Journal of Microscopy. 189, Pt 1 79-89 (1998).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

상기 언급된 바와 같이, 지질 혼합물이 지질 이중층 내에 PI(4,5)P2 혼입을 강화하고 따라서 셉틴-막 상호작용을 용이하게 하는 데 사용되었다. 실제로, 우리는 다른 곳에서 신진 효모 셉틴이 PI (4,5 ) P 2 특정 방식으로 소포와 상호 작용한다는 것을 다른곳에서 보여주었습니다. 이 지질 조성물은 다수의 조성물을 스크리닝하는 것으로부터 경험적으로 조정되었고, 현재 저자들에 의해 널리 사용되고 있다. PI(4,5)P2 지질은 신중하게 다루어야 한다. 스톡 솔루션은 피펫팅을 위해 특정 바이알이 두 번 이상 열리지 않도록 소량으로 분취해야합니다. 게다가, 지질 분취량은 지질 산화를 방지하기 위해 아르곤 아래에 저장되어야합니다. 마지막으로, 일단 지질 혼합물이 수용액에서 가용화되면, 혼합물은 한 번에 사용되어야하며 추가 실험을 위해 저장 될 수 없습니다. 특히, GUV 재구성 또는 지질 이중층 융합을 지지한 후, 셉틴과 지질 ...

셉틴은 지질막과 상호작용하는 세포골격 필라멘트 형성 단백질이다. 셉틴은 진핵생물에서 유비쿼터스이며 수많은 세포 기능에 필수적입니다. 이들은 신진 효모 및 포유류 1,2에서 세포 분열의 주요 조절자로 확인되었다. 그들은 막 재형성 사건, ciliogenesis3 및 정자 생성4에 관여합니다. 포유동물 세포 내에서, 셉틴은 또한 Rho GTPases (BORG)-의존성 방식8의 결합제에서 액틴 및 미세소관 5,6,7과 상호작용할 수 있다. 다양한 조직(뉴런9, 섬모3, 정자10)에서, 셉틴은 막 결합 성분(11)에 대한 확산 장벽의 조절자로서 확인되었다. 셉틴은 또한 막 블링 및 돌출부 형성(12)을 조절하는 것으로 나타났다. 멀티 태스킹 단백질인 셉틴은 다양한 유행하는 질병의 출현에 연루되어 있습니다13. 그들의 잘못된 조절은 암(14) 및 신경퇴행성 질환(15)의 출현과 관련이 있다.
유기체에 따라, 몇몇 셉틴 서브유닛들(예쁜꼬마선충에서 두 개에서 인간의 경우 13개까지)이 모여 조직 의존적 방식으로 조직이 변하는 복합체를 형성한다(16). 기본 septin 빌딩 블록은 두 개에서 네 개의 서브 유닛을 수집하며, 두 개의 사본으로 존재하며 막대 모양의 palindromic 방식으로 자체 조립됩니다. 신진 효모에서 셉틴은 옥타머17,18입니다. 계내에서, 셉틴은 종종 마이크로미터 곡률을 갖는 부위에 국한된다; 그들은 분열 수축 부위, 섬모와 덴드라이트의 기저부, 정자19,20의 환부에서 발견됩니다. 막에서, 셉틴의 역할은 이중적인 것으로 보인다: 그들은 지질 이중층을 재형성하고 막 완전성을 유지하는데 연루된다(21). 따라서 멤브레인에서 셉틴 필라멘트 형성 단백질 및 / 또는 서브 유닛의 생체 물리학 적 특성을 조사하는 것은 그 역할을 이해하는 데 중요합니다. 잘 조절된 환경에서 셉틴의 특정 특성을 해부하기 위해, 상향식 시험관내 접근법이 적절하다. 지금까지, 단지 몇몇 그룹만이 시험관내 셉틴 20,22,23의 생체물리학적 특성을 기술하였다. 따라서, 다른 세포골격 필라멘트와 비교하여, 시험관 내에서 셉틴의 거동에 대한 현재의 지식은 여전히 제한적이다.
이 프로토콜은 셉틴 필라멘트의 조직, 막 재구성 및 곡률 감도가 어떻게 분석될 수 있는지를 기술한다(19). 이를 위해, 광학 및 전자 현미경 검사 방법(형광 현미경, cryo-electron microscopy[cryo-EM] 및 주사 전자 현미경[SEM])의 조합이 사용되었다. 마이크로 미터 크기의 거대한 unilamellar vesicles (GUVs)의 막 재구성은 형광 광학 현미경을 사용하여 시각화됩니다. 지질 소포에 결합된 셉틴 필라멘트의 배열 및 초구조의 분석은 cryo-EM을 사용하여 수행된다. 셉틴 곡률 감도의 분석은 가변 곡률의 물결 모양의 기질에 증착 된 고체 지지형 지질 이중층에 결합 된 셉틴 필라멘트의 거동을 연구함으로써 SEM을 사용하여 수행되며, 이는 양의 곡률과 음의 곡률 모두에 대한 곡률 감도의 분석을 가능하게합니다. 이전 분석20,24와 비교하여, 여기서는 셉틴이 어떻게 자체 조립되고, 시너지 효과를 발휘하여 막을 변형시키고, 곡률에 민감 할 수 있는지 철저히 분석하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 것을 제안합니다. 이 프로토콜은 막에 대한 친화도를 표시하는 임의의 필라멘트 단백질에 유용하고 적응가능한 것으로 여겨진다.

<table><tbody><tr><td>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포-L-세린</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>수조 초음파 발생기</td><td>Elma Elmasonic</td><td></td><td>S10H</td></tr><tr><td>Bodipy-TR-Ceramide</td><td>invitrogen, Thermo Fischer scientific</td><td>11504726</td><td></td></tr><tr><td>화학 물질 : NaCl, Tris-HCl, 자당, KCl, MgCl2, B- 카제인, 클로로포름, 카코딜 산 나트륨, 탄닌산, 에탄올</td><td>시그마 알드리치</td><td></td><td></td></tr><tr><td>공 초점 현미경</td><td>니콘</td><td></td><td>회전 디스크 또는 공 초점</td></tr><tr><td>임계점 건조기</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>CPD300</td></tr><tr><td>탈 이온수 발생기</td><td>MilliQ</td><td>F1CA38083B</td><td>MilliQ 일체형 3</td></tr><tr><td>Egg L-&alpha;- 포스파티딜콜린</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051</td><td></td></tr><tr><td>Field Emission Gun SEM (FESEM)</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Gemini SEM500</td></tr><tr><td>글루타르알데히드 25 %, 수용액</td><td>Thermo Fischer scientific</td><td>50-262-19</td><td></td></tr><tr><td>고진공 그리스, Dow corning</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMOD 소프트웨어</td><td>https://bio3d.colorado.edu/imod/</td><td></td><td>틸트 시리즈 이미지 정렬 및 3D 재구성을 위한 소프트웨어 제품군</td></tr><tr><td>Lacey Formvar/탄소 전자 현미경 그리드</td><td>Eloise</td><td>01883-F</td><td></td></tr><tr><td>지질</td><td>Avanti 극지 지질</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-&알파;-포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트</td><td>Avanti 극지 지질</td><td>840046</td><td></td></tr><tr><td>금속 증발기</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>EM ACE600</td></tr><tr><td>NOA (Norland Optical Adhesives), NOA 71 및 NOA 81</td><td>Norland 제품</td><td>NOA71, NOA81</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetraoxyde 4%</td><td>delta microscopy</td><td>19170</td><td></td></tr><tr><td>Osmometer</td><td>L&ouml; SER</td><td></td><td>15 M</td></tr><tr><td>플라즈마 클리너</td><td>Alcatel</td><td></td><td>pascal 2005 SD</td></tr><tr><td>플라즈마 발생기</td><td>전자 현미경 과학</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플런지 냉동 장비</td><td>라이카 마이크로 시스템</td><td></td><td>EMGP</td></tr><tr><td>투과 전자 현미경</td><td>Thermofischer</td><td></td><td>Tecnai G2 200 kV, LaB6</td></tr><tr><td>우라닐 아세테이트</td><td>전자 현미경 과학</td><td>22451</td><td>이 제품은 더 이상</td></tr><tr><td>왁스 플레이트, Vitrex</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr>에서 구입할 수 없습니다.</tbody></table>

bottom-up in vitro methods to assay the ultrastructural organization, membrane reshaping, and curvature sensitivity behavior of septins

Bottom-Up In Vitro Methods to Assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

막 리모델링은 원형질막과 세포 소기관 내에서 지속적으로 발생합니다. 환경 (이온 조건, 단백질 및 지질 조성물, 막 곡률)과 특정 막 재구성 과정과 관련된 다양한 파트너의 역할을 완전히 해부하기 위해 우리는 시험관 내 상향식 접근법을 수행합니다. 최근 몇 년 동안, 주요 질병과 관련된 셉틴 단백질의 역할을 밝히는 데 관심이 높아지고 있습니다. 셉틴은 원형질막과 상호작용하는 필수적이고 유비쿼터스 세포골격 단백질이다. 그들은 다른 기능들 중에서도 세포 분열, 세포 운동성, 신경 형태 형성 및 정자 형성에 연루되어 있습니다. 따라서 셉틴이 멤브레인에서 어떻게 상호 작용하고 조직되어 멤브레인 변형을 유도하고 특정 막 곡률에 어떻게 민감 할 수 있는지 이해하는 것이 중요합니다. 이 기사는 분자 수준에서 셉틴의 초 구조와 미크론 규모로 발생하는 막 리모델링 사이의 상호 작용을 해독하는 것을 목표로합니다. 이를 위해, 싹트는 효모 및 포유동물 셉틴 복합체를 재조합적으로 발현하고 정제하였다. 이어서 , 시험관내 분석의 조합을 사용하여 막에서 셉틴의 자가조립을 분석하였다. 지지된 지질 이중층(SLBs), 거대한 유니라멜라 소포(GUVs), 큰 유니라멜라 소포(LUVs) 및 물결 모양의 기질을 사용하여 셉틴 자가조립, 막 재구성 및 막 곡률 사이의 상호작용을 연구하였다.

GUV 변형 셉틴과 함께 인큐베이션된 후 재성형된 GUVs의 전형적인 공초점 형광 이미지는 셉틴이 중합되는 조건에서 도 3에 표시된다. 베어 GUV(그림 3A)는 완벽하게 구형이었다. 50 nM 이상의 신진 효모 셉틴 필라멘트와 함께 인큐베이션시, 소포는 변형된 것처럼 보였다. 최대 100 nM 농도의 싹이 트인 효모 셉틴 옥타머까지, 소포는 패싯된 것처럼 보였고, 변형은 정적으로 남아있었고 따라서 변동하지 않았다(도 3B). 200 nM 이상의 싹을 틔우는 효모 셉틴, 멤브레인이 셉틴으로 포화되면서 주기적인 변형이 관찰되었다 (도 3C). 신진 효모 셉틴을 사용하여, 스파이크를 2 μm 내지 6 μm의 주기성 및 약 1 μm의 진폭으로 시각화하였다. 따라서 셉틴은 특정 방식으로 멤...

셉틴은 세포골격 단백질이다. 그들은 지질 막과 상호 작용하고 미크론 규모에서 막 곡률을 감지 할 수 있습니다. 우리는 막 변형, 곡률에 민감한 셉틴 결합 및 셉틴 필라멘트 초 구조를 분석하기위한 상향식 시험관 내 방법론을 설명합니다.

Bottom-Up In Vitro Methods to assay the Ultrastructural Organization, Membrane Reshaping, and Curvature Sensitivity Behavior of Septins

Membrane remodeling occurs constantly at the plasma membrane and within cellular organelles. To fully dissect the role of the environment (ionic ...

이 프로토콜을 사용하여 다양한 곡률을 나타내는 패턴 기질에서 세포 골격 필라멘트 단백질의 조직을 시각화했습니다. 곡률 감도를 테스트할 수 있습니다. 주사 전자 현미경 이미지의 해상도는 나노 미터 규모의 조직을 시각화 할 수있을만큼 충분히 높습니다.우리가 고정에 사용하는 방법은 단백질의 구조 내 조직을 보존하기에 충분히 온화합니다. 이것은 세포 골격 필라멘트의 행동을 이해하기위한 기초 연구의 범위에 남아 있습니다. 먼저 클린룸 환경에서 250나노미터 진폭과 2마이크로미터 측면 주기성의 물결 모양의 폴리디메틸실록산 물결 모양의 물결 모양의 물결 모양 Norland 광학 접착제(NOA 복제본)를 설계합니다.이렇게 하려면 직경 1cm의 원형 유리 커버 슬립에 5마이크로리터의 액체 NOA를 증착한 다음 PDMS 템플릿을 드롭에 놓습니다. 어셈블리를 320나노미터의 UV 광으로 5분 동안 처리하여 액체 NOA를 얇은 폴리머 필름으로 광중합합니다. 완료되면 새로 중합된 NOA로 커버 슬립에서 PDMS 템플릿을 부드럽게 떼어냅니다.공기 플라즈마 클리너를 사용하여 NOA 필름을 5분 동안 처리하여 표면을 친수성으로 만듭니다. 원고에 설명 된대로 작은 단층 소포 또는 SUV의 용액을 준비하고 용액이 투명해질 때까지 욕조 초음파 처리기에서 초음파 처리 하에 관찰 버퍼에 건조 된 지질 필름을 재현탁하여 SUV를 얻습니다. 나중에 NOA 패턴을 지지하는 커버 슬립을 세포 배양 상자의 웰 내에 삽입하고 갓 빛나는 배출된 NOA 패턴을 100마이크로리터의 밀리리터당 1밀리그램의 SUV 용액으로 실온에서 30분 동안 배양하여 지지된 지질 이중층을 생성합니다.융합되지 않은 SUV를 제거하려면 두 번의 세척 사이에 샘플을 완전히 건조시키지 않고 셉틴 저염 완충액으로 측면을 6번 완전히 헹굽니다. 옥토머성 셉틴 스톡 용액을 셉틴 저염 완충액에서 10 내지 100 나노몰 및 1 밀리리터의 부피 범위의 최종 농도로 희석한다. 이어서, 단백질 용액을 실온에서 1시간 동안 슬라이드 상에서 인큐베이션한다.융합된 지지 지질 이중층을 포함하는 NOA 슬라이드를 세척하고 셉틴 저염 완충액으로 단백질을 배양합니다. 셉틴 저염 완충액을 섭씨 37도에서 예열한 0.1몰 카코딜산나트륨 완충액에 2%글루타르알데히드 정착액으로 교체하고 반응을 15분 동안 진행하고 고정된 샘플을 0.1몰 카코딜산나트륨으로 각각 5분씩 세 번 세척합니다. 세척 후, 샘플을 사산화오스뮴의 고정 용액에서 배양하고, 이어서 탄닌산을 여과하고, 최종적으로 여과된 우라닐 아세테이트를 각각 10분 동안 배양한다.모든 용액 후에 증류수에서 샘플을 세 번 씻으십시오. 샘플을 각각 2-3 분 동안 50 %에서 100 %까지 시작하는 에탄올 용액에서 직렬로 배양합니다. 유리 슬라이드를 에탄올로 미리 채워진 임계점 건조기 내부로 옮기고 제조업체의 건조 지침을 따르십시오.건조된 샘플은 매우 흡습성이므로 커버 슬립을 스텁에 부착하여 즉시 코팅하십시오. 그런 다음 페인트 덩어리를 만들지 않고 커버 슬립의 윗면에 은색 페인트 스트립을 추가하십시오. 스텁과의 연결이 만족 스러운지 확인하십시오.샘플이 완전히 증발하면 플라즈마 마그네트론 스퍼터링 헤드와 회전식 유성 스테이지가 장착 된 장치를 사용하고 제조업체에서 제공 한 표준 프로토콜을 따르십시오. 120 밀리 암페어에서 60 초 동안 사전 스퍼터링을 수행하여 표면의 산화물 층을 제거합니다. 그런 다음 1.5 나노 미터의 텅스텐을 90 밀리 암페어의 필름 두께 모니터와 50 밀리리터의 작동 거리로 증착하십시오.나중에 샘플을 진공 하에 보관하여 SEM 분석 전후까지 주변 공기로부터 샘플을 보호합니다. 내륙 검출기로 2차 전자를 검출하여 고용액 이미징을 달성하려면 가속 전압을 3킬로볼트로 설정하고 빔 전류를 20마이크로미터 조리개로 설정합니다. 관찰의 경우 픽셀당 21.25나노미터에서 픽셀당 1.224나노미터 범위의 해상도를 사용합니다.데이터 분석을 위해 픽셀당 5.58나노미터의 해상도를 사용합니다. 고해상도 관찰의 경우 작동 거리를 1-2mm 사이로 설정하고 피사계 심도를 늘려야 하는 경우 약 3mm 사이로 설정합니다. 스캔 속도와 라인 통합을 지속적으로 조정하여 이미지당 약 30-45초의 획득 시간으로 일정한 신호 대 노이즈 비율을 보장합니다.대표적인 분석은 셉틴 필라멘트에 증착 된 물질이 1.5 나노 미터의 백금과 1.5 나노 미터의 텅스텐을 갖는 물결 모양의 PDMS 패턴에 미치는 영향을 보여줍니다. 벌거 벗은 거대한 단층 소포 또는 GUV가 완벽하게 구형이라는 것이 관찰되었습니다. 셉틴 유도 변형 후, 소포는면 처리 된 것처럼 보였고 변형은 정적 인 상태로 유지되어 변동하지 않았습니다.더 높은 농도의 셉틴에서, 소포의주기적인 변형이 관찰되었다. 큰 단층 소포 또는 LUV에 결합된 셉틴 필라멘트의 자가 조립을 극저온 전자 현미경 이미지로 검사하고 기울어진 시리즈에서 3D 재구성을 얻었습니다. 셉틴 필라멘트의 곡률 의존적 배열은 주사 전자 현미경으로 시각화되었습니다.저배율에서는 음의 곡률과 양의 곡률의 주기성을 갖는 물결 모양의 패턴이 보였다. 셉틴 필라멘트의 초 구조적 조직은 더 높은 배율로 관찰되었습니다. NOA는 성능 저하를 방지하기 위해 부드럽게 벗겨야 합니다.이미징 후 필라멘트 간격 및 필라멘트의 방향과 같이 SCM으로 시각화된 초미세 구조 특징을 정량화하기 위해 일부 이미지 분석을 수행할 수 있습니다. 본 방법은 셉틴에 적용되었지만 다른 세포 골격 단백질 또는 긴 필라멘트로 구성되어 곡률에 민감한 단백질에도 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오에서는 전반사 형광 현미경을 사용하여 유리로 지지된 지질 이중층의 체외에서 셉틴 조직을 조사하는 절차를 보여줍니다.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: 생물학적 막 모방체에 대한 셉틴 어셈블리를 조사하기 위한 현미경 기반 체외 기술

이 비디오는 지질 이중층으로 코팅된 미세구에서 셉틴 단백질 어셈블리를 연구하는 기술을 설명합니다. 이 기술은 곡면에 있는 단백질의 곡률 의존적 어셈블리를 이해하는 데 도움이 됩니다.

Spherical Supported Lipid Bilayer Assay: 마이크로스피어에서 Septin 어셈블리를 관찰하는 기술

편광 기반의 전반사 형광 현미경 (pTIRFM)은 세포막 역학의 실시간 감지를 할 수 있습니다. 이 문서는 규제 세포 외 유출 동안 막 리모델링의 연구 pTIRFM의 구현을 설명합니다. 기술은 직접적으로 또는 간접적으로 막 형상의 변화를 수반 세포 생물학의 다른 프로세스에 일반화이다.

pTIRFM와 이미징 플라즈마 막 변형

많은 단백질이 막 표면에 부착될 때 기능을 수행합니다. 나노 디스크 막에 대한 외인성 단백질의 결합은 투과 전자 현미경에 의해 간접적으로 이미지화될 수 있습니다. 우리는 음성 염색 인산 텅스텐 산 나트륨에 의해 유도 된 나노 디스크의 특징적인 적층 (rouleau)이 외인 단백질의 결합에 의해 방지된다는 것을 보여줍니다.

방법은 시각화 및 투과 전자 현미경에 의해 막 상호 작용하는 단백질을 분석하는

여기, 우리는 다른 시냅스 구획에 속하는 단백질을 분리하는 강력한 절차를 나타내는 뇌막 분화 프로토콜을 제시합니다.

뇌막 분획 화 :<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Subsynaptic Protein Localization 평가 방법

셀에 많은 단백질을 감지 하 고 막 곡률을 유도. 곡선된 막 체 외단백질 또는 어떤 곡률 활성 분자의 상호작용을 연구 하는 지질 소포에서 막 나노튜브를 당겨 하는 방법을 설명 합니다.

거 대 한 Unilamellar 소포에서 막 나노튜브를 당기

우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

Macropinocytosis는 막 프릴이라고도 알려진 F-actin이 풍부한 시트 형 막 돌기의 형성에 의해 시작된 고도로 보존 된 내시세포 과정입니다. 거대 피노사이토틱 용질 내재화의 증가된 속도는 다양한 병리학적 조건에 연루되어 왔다. 이 프로토콜은 주사 전자 현미경을 사용하여 시험관 내에서 막 프릴 형성을 정량화하는 방법을 제시한다.

주사 전자 현미경을 이용한 멤브레인 러플 형성 시각화

세포골격 단백질의 체외 재구성은 이러한 단백질의 기본 기능적 특성을 이해하는 데 필수적인 도구입니다. 본 논문은 세포 분열 및 이동에 중심적인 역할을 하는 재조합 셉틴 복합체의 품질을 정제하고 평가하는 프로토콜을 설명합니다.

무세포 재구성을 위한 재조합 셉틴 복합체의 정제 및 품질 관리

무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

생체 물리학 적 특성과 기능을 연구하기 위해 멤브레인에서 Septin 어셈블리의 재구성

여기서, 나노바 담지 지질 이중층 시스템은 시험관 내에서 곡률 감지 능력을 가진 단백질의 특성 분석을 가능하게 하는 정의된 곡률을 갖는 합성 막을 제공하기 위해 개발된다.

시험관 내 막 곡률 감지 단백질 연구를 위한 나노바 지원 지질 이중층 시스템

학습하세요 세프틴과 지질막 상호작용을 분석하는 하향식 시험관 내 방법을 통해 막 곡률 감지 및 세포골격 단백질의 초미세구조를 연구하는 기술을. 이 프로토콜은 주사전자현미경과 크라이오전자현미경을 활용하여 나노미터 규모의 세프틴 필라멘트 배열을 시각화하고 정량적으로 분석합니다.

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