Name: 미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: 학습하세요 형광 현미경과 미세 유체 공학을 결합하여 액틴 결합 단백질이 액틴 필라멘트 조립과 해체를 조절하는 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기술은 생화학적 및 역학적 조건을 정밀하게 제어하면서 수십 개의 개별 액틴 필라멘트에서 동시에 반응을 정량화할 수 있습니다.

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우리는 B. Ladoux와 R.-M.에게 감사드립니다. UV-cleaner 장비를 사용하는 Mège 실험실과 J. Heuvingh 및 0. du Roure는 실리콘 웨이퍼에서 금형을 준비하고 미세 유체 공학에 대한 팁을 제공하는 초기 교육을 받았습니다. 우리는 유럽 연구위원회 그랜트 StG-679116 (A.J.) 및 Agence Nationale de la Recherche Grants Muscactin and Conformin (G.R.-L.)의 기금을 인정합니다.

<ol><li>Wioland, H., Jégou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celebrating+20+years+of+live+single-actin-filament+studies+with+five+golden+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Celebrating 20 years of live single-actin-filament studies with five golden rules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (3), 2109506119(2022).</li>
<li>Kuhn, J. R., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+measurements+of+actin+filament+polymerization+by+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Real-time measurements of actin filament polymerization by total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophysical Journal. 88 (2), 1387-1402 (2005).</li>
<li>Brewer, L. R., Bianco, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+cells+for+single-molecule+studies+of+DNA-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions.</a> Nature Methods. 5 (6), 517-525 (2008).</li>
<li>Jégou, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+actin+filaments+in+a+microfluidic+flow+reveal+the+mechanism+of+ATP+hydrolysis+and+give+insight+into+the+properties+of+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual actin filaments in a microfluidic flow reveal the mechanism of ATP hydrolysis and give insight into the properties of profilin.</a> PLoS Biology. 9 (9), 1001161(2011).</li>
<li>Gicquel, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+chips+for+in+situ+crystal+x-ray+diffraction+and+in+situ+dynamic+light+scattering+for+serial+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Microfluidic chips for in situ crystal x-ray diffraction and in situ dynamic light scattering for serial crystallography.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57133(2018).</li>
<li>Chandradoss, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (86), e50549(2014).</li>
<li>Schaedel, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules+self-repair+in+response+to+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Microtubules self-repair in response to mechanical stress.</a> Nature Materials. 14 (11), 1156-1163 (2015).</li>
<li>Zimmermann, D., Morganthaler, A. N., Kovar, D. R., Suarez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+biochemical+characterization+of+cytokinesis+actin-binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vitro biochemical characterization of cytokinesis actin-binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1369, 151-179 (2016).</li>
<li>Funk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profilin+and+formin+constitute+a+pacemaker+system+for+robust+actin+filament+growth%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Profilin and formin constitute a pacemaker system for robust actin filament growth.</a> eLife. 8, 50963(2019).</li>
<li>Pandit, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+and+phosphate+release+from+Arp2%2F3+complex+promote+dissociation+of+actin+filament+branches%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Force and phosphate release from Arp2/3 complex promote dissociation of actin filament branches.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (24), 13519-13528 (2020).</li>
<li>Wioland, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ADF%2FCofilin+accelerates+actin+dynamics+by+severing+filaments+and+promoting+their+depolymerization+at+both+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">ADF/Cofilin accelerates actin dynamics by severing filaments and promoting their depolymerization at both ends.</a> Current Biology: CB. 27 (13), 1956-1967 (2017).</li>
<li>Pollard, T. D., Mooseker, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+measurement+of+actin+polymerization+rate+constants+by+electron+microscopy+of+actin+filaments+nucleated+by+isolated+microvillus+cores%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Direct measurement of actin polymerization rate constants by electron microscopy of actin filaments nucleated by isolated microvillus cores.</a> The Journal of Cell Biology. 88 (3), 654-659 (1981).</li>
<li>Kovar, D. R., Harris, E. S., Mahaffy, R., Higgs, H. N., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+the+assembly+of+ATP-+and+ADP-actin+by+formins+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Control of the assembly of ATP- and ADP-actin by formins and profilin.</a> Cell. 124 (2), 423-435 (2006).</li>
<li>Jégou, A., Carlier, M. -F., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formin+mDia1+senses+and+generates+mechanical+forces+on+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Formin mDia1 senses and generates mechanical forces on actin filaments.</a> Nature Communications. 4, 1883(2013).</li>
<li>Breitsprecher, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rocket+launcher+mechanism+of+collaborative+actin+assembly+defined+by+single-molecule+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rocket launcher mechanism of collaborative actin assembly defined by single-molecule imaging.</a> Science. 336 (6085), 1164-1168 (2012).</li>
<li>Courtemanche, N., Lee, J. Y., Pollard, T. D., Greene, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension+modulates+actin+filament+polymerization+mediated+by+formin+and+profilin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tension modulates actin filament polymerization mediated by formin and profilin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9752-9757 (2013).</li>
<li>Niedermayer, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+depolymerization+of+actin+filaments+is+caused+by+photo-induced+dimerization+of+actin+protomers%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Intermittent depolymerization of actin filaments is caused by photo-induced dimerization of actin protomers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (27), 10769-10774 (2012).</li>
<li>Gateva, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropomyosin+isoforms+specify+functionally+distinct+actin+filament+populations+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">Tropomyosin isoforms specify functionally distinct actin filament populations in vitro.</a> Current Biology: CB. 27 (5), 705-713 (2017).</li>
<li>Aratyn, Y. S., Schaus, T. E., Taylor, E. W., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+dynamic+behavior+of+fascin+in+filopodia%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Intrinsic dynamic behavior of fascin in filopodia.</a> Molecular Biology of the Cell. 18 (10), 3928-3940 (2007).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+constants+for+the+reactions+of+ATP-+and+ADP-actin+with+the+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Rate constants for the reactions of ATP- and ADP-actin with the ends of actin filaments.</a> The Journal of Cell Biology. 103, Pt 2 2747-2754 (1986).</li>
<li>Wioland, H., Jegou, A., Romet-Lemonne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Torsional+stress+generated+by+ADF%2Fcofilin+on+cross-linked+actin+filaments+boosts+their+severing%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Torsional stress generated by ADF/cofilin on cross-linked actin filaments boosts their severing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (7), 2595-2602 (2019).</li>
<li>Colombo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+family+of+fluorescent+nucleotide+analogues+to+investigate+actin+dynamics+and+energetics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A functional family of fluorescent nucleotide analogues to investigate actin dynamics and energetics.</a> Nature Communications. 12 (1), 548(2021).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> The Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Romet-Lemonne, G., Guichard, B., Jégou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+single+filament+assay+to+study+formin+control+of+actin+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics single filament assay to study formin control of actin assembly.</a> Methods in Molecular Biology. 1805, 75-92 (2018).</li>
<li>Gieselmann, R., Kwiatkowski, D. J., Janmey, P. A., Witke, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+biochemical+characteristics+of+the+two+human+profilin+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Distinct biochemical characteristics of the two human profilin isoforms.</a> European Journal of Biochemistry. 229 (3), 621-628 (1995).</li>
<li>Lin, D. C., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin+polymerization+induced+by+a+motility-related+high-affinity+cytochalasin+binding+complex+from+human+erythrocyte+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Actin polymerization induced by a motility-related high-affinity cytochalasin binding complex from human erythrocyte membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (5), 2345-2349 (1979).</li>
<li>Casella, J. F., Maack, D. J., Lin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+initial+characterization+of+a+protein+from+skeletal+muscle+that+caps+the+barbed+ends+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Purification and initial characterization of a protein from skeletal muscle that caps the barbed ends of actin filaments.</a> The Journal of Biological Chemistry. 261 (23), 10915-10921 (1986).</li>
<li>Kremneva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cofilin-2+controls+actin+filament+length+in+muscle+sarcomeres%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Cofilin-2 controls actin filament length in muscle sarcomeres.</a> Developmental Cell. 31 (2), 215-226 (2014).</li>
<li>Le Clainche, C., Carlier, M. -F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+motility+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Actin-based motility assay.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 12 1-20 (2004).</li>
<li>Vignjevic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+filopodia-like+bundles+in+vitro+from+a+dendritic+network%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of filopodia-like bundles in vitro from a dendritic network.</a> The Journal of Cell Biology. 160 (6), 951-962 (2003).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Holmes, D., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+size+of+the+EB+cap+determines+instantaneous+microtubule+stability%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The size of the EB cap determines instantaneous microtubule stability.</a> eLife. 5, 13470(2016).</li>
<li>Duellberg, C., Cade, N. I., Surrey, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+aging+probed+by+microfluidics-assisted+tubulin+washout%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Microtubule aging probed by microfluidics-assisted tubulin washout.</a> Molecular Biology of the Cell. 27 (22), 3563-3573 (2016).</li>
<li>Suzuki, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometrical+constraints+greatly+hinder+formin+mDia1+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Geometrical constraints greatly hinder formin mDia1 activity.</a> Nano Letters. 20 (1), 22-32 (2020).</li>
<li>Wioland, H., Suzuki, E., Cao, L., Romet-Lemonne, G., Jegou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+advantages+of+microfluidics+to+study+actin+biochemistry+and+biomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Muscle+Research+and+Cell+Motility%22%5BJournal%5D)">The advantages of microfluidics to study actin biochemistry and biomechanics.</a> Journal of Muscle Research and Cell Motility. 41 (1), 175-188 (2020).</li>
</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

액틴 필라멘트가 길이를 따라 여러 지점에 의해 표면에 고정되거나 메틸 셀룰로오스와 같은 크라우드 링제에 의해 그 가까이에 유지되는 표준 단일 필라멘트 방법과 비교할 때, 미세 유체학은 많은 이점을 제공합니다. 표면과의 상호작용이 최소화됨에 따라, 인위적인 일시정지는 신율 및 탈중합 둘 다 회피되는 동안 유도할 수 있다. 필라멘트는 흐름에 의해 정렬되고 서로 평행하여 모니터링과 길이 측정을 용이하게합니다. 필라멘트 주변의 용액은 지속적으로 갱신되어 일정한 단백질 농도에 노출됩니다. 필라멘트가 노출되는 다른 단백질 용액 사이를 신속하게 전환 할 수 있기 때문에 (<1 초, 그림 3D, E) 시간 제어 순차적 실험을 수행 할 수 있으며 이는 종종 운동 연구에 도움이됩니다. 마지막으로, 필라멘트 상의 유동 용액에 의해 가해지는 점성 항력은 필라멘트에 제어된 기계적 응력을 가하기 위해 이용될 수 있다(대표적인 결과 섹션). 적당한 유체 흐름 (<stron...

액틴 필라멘트 및 액틴 필라멘트 네트워크의 조립 및 분해는 여러 생화학 반응에 의해 제어되며 기계적 맥락에 따라 달라집니다. 이러한 복잡한 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해서는 개별 필라멘트에 대한 개별 반응을 관찰 할 수있는 것이 매우 중요합니다 (충분히 많은 수로). 지난 수십 년 동안, 주로 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 실시간으로 동적 액틴 필라멘트를 관찰하는 것이 핵심 기술로 부상했으며 벌크 용액 생화학 적 분석1로는 얻을 수 없었던 인상적인 결과 목록을 제공했습니다.
이를 달성하기 위해서는 형광 표지 된 액틴 필라멘트를 현미경 커버 슬립의 표면에 가깝게 유지하면서 형광 표지 될 수있는 액틴 결합 단백질 (ABPs)의 용액에 노출시켜야합니다. 이렇게 하면 잘 조절된 생화학적 조건에서 개별 필라멘트에서 발생하는 이벤트를 모니터링하여 반응 속도를 정량화할 수 있는 수단이 제공됩니다. 그러나 여러 가지 특정 제한 사항을 고려해야 합니다. 필라멘트를 표면에 가깝게 인위적으로 유지하면, 종종 다수의 앵커링 포인트 덕분에 또는 메틸셀룰로스와 같은 크라우집제(crowding agent)를 사용함으로써, 이들의 거동을 변경할 수 있다(예를 들어, 이들의 중합 및 탈중합에서 정지를 야기함(2). 각 필라멘트의 윤곽선을 추적하는 것은 특히 새로운 필라멘트 또는 필라멘트 조각이 시간이 지남에 따라 시야에 축적되는 경우 어려울 수 있습니다. 반응은 액틴 단량체와 ABP의 농도가 시간이 지남에 따라 변할 수있는 유한 부피에서 일어나기 때문에 잠재적으로 정확한 속도 상수를 도출하기가 어렵습니다. 마지막으로, ABPs의 용액을 갱신하거나 변경하는 것은 30 초 미만에서 달성하기가 어렵고 종종 샘플에서 불균질 한 단백질 함량을 유발할 것입니다.
10 년 전, 개별 Deoxyribonucleic Acid (DNA) 가닥3을 연구하기 위해 이미 수행 된 작업에서 영감을 얻은 우리는 개별 액틴 필라멘트4를 관찰하고 조작하기 위해 미세 유체학에 기반한 새로운 기술을 도입했습니다. 그것은 고전적인 단일 필라멘트 기술의 앞서 언급 한 한계를 우회 할 수있게합니다. 이러한 미세유체학 분석에서, 액틴 필라멘트는 커버슬립에 흡착된 스펙트린-액틴 종자로부터 성장한다. 따라서 필라멘트는 미세 유체 챔버의 바닥에만 한쪽 끝으로 고정되고 달라 붙지 않고 표면 위로 변동합니다. 필라멘트는 들어오는 용액의 흐름과 일치하므로 윤곽선 길이의 모니터링이 용이해지고 TIRF를 사용할 수 있는 커버슬립 위의 얕은 영역에 유지됩니다. 서로 다른 용액이 혼합되지 않고 동시에 챔버 내로 흐르고 필라멘트가 순차적으로 그리고 빠르게 노출 될 수 있습니다.
여기에서는 실험실에서 단일 액틴-필라멘트 미세유체 분석을 설정하기 위한 일련의 기본 프로토콜을 제안합니다. 커버 슬립 및 미세 유체 챔버는 사전에 (반나절에) 준비 할 수 있으며 여러 생화학 적 조건을 테스트 할 수있는 실험 자체는 하루 이내에 수행됩니다.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Casein</td><td>Merck</td><td>C6905</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>생검 펀치에서 사용(플런저 포함)</td><td>Ted Pella</td><td>15115-2</td><td>ID 0.75 mm, OD 1.07 mm</td></tr><tr><td>비오틴-BSA</td><td>Merck</td><td>A8549</td><td>1 mg/mL에서 사용</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Merck</td><td>A8022</td><td>50 mg/mL</td></tr><tr><td>커버슬립 Mini-Rack 테프론 홀더</td><td>Invitrogen</td><td>C14784</td><td>for 8 커버</td></tr><tr><td>슬립 커버슬립 22x40mm 두께 #1.5</td><td>Menzel Gl&auml; ser</td><td>631-1370</td><td></td></tr><tr><td>DABCO</td><td>Merck</td><td>D27802</td><td>구성 요소, f-버퍼</td></tr><tr><td>DTT</td>, <td>Euromedex,</td><td>EU0006-D</td><td>구성 요소, F-버퍼</td></tr><tr><td>Ester NHS Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A20000</td><td>Fluorophore, Lys328의 액틴 라벨링용.</td></tr><tr><td>EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>21338</td><td>To biotinylate actin on Lys328</td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma</td><td>9-307-011-4-507</td><td>유리 세척 세제</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>N/A</td><td>오픈 소스 소프트웨어</td></tr><tr><td>Laboport</td><td>KNF</td><td>811kn.18</td><td>진공 펌프(궁극의 진공: 240mbar)</td></tr><tr><td>매직 인비저블 테이프</td><td>스카치</td><td>7100024666</td><td>표준 투명 사무용 테이프</td></tr><tr><td>Micrewtube</td><td>Simport</td><td>T341-6T</td><td>2mL 미세유체 저장소 튜브</td></tr><tr><td>미세유체 장치 파트 1: 플로우 유닛 S</td><td>플루이젠트</td><td>FLU-S-D-PCKB</td><td>유량계</td></tr><tr><td>미세유체 장치 파트 2: Fluiwell-4C-2 mL</td><td>플루이젠</td>트 <td>14002001PCK</td><td>리저버 홀더</td></tr><tr><td>미세유체 장치 파트 3: MFCS-EZ</td><td>플루이젠</td>트 <td>EZ-11000001 EZ-00345001</td><td>압력 컨트롤러</td></tr><tr><td>Model 42 - UVO-Cleaner</td><td>Jelight Inc.</td><td>42-220</td><td>자외선 세정제</td></tr><tr><td>N6-(6-Aminohexyl)-ATP-ATTO-488</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-805-488</td><td>ATP-ATTO는 액틴</td></tr><tr><td>뉴트라비딘</td> 라벨링에 사용 <td>Thermo Scientific</td><td>31000</td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG</td><td>SuSoS</td><td>PLL(20)-g[3.5]- PEG(2)</td><td>PBS에서 1mg/mL로 사용합니다.</td></tr><tr><td>폴리디메틸실록산(PDMS) 실가드 184 실리콘 엘라스토머</td><td>다우코닝</td><td>1673921</td><td>PDMS 베이스 및 경화제</td></tr><tr><td>폴리에테르에테르케톤(PEEK) 튜빙</td><td>머크</td><td>Z226661</td> 함유"<td> 푸른색" : I.D. = 0.25 mm</td></tr><tr><td>안전 블로우 건</td><td>코일호스 공압식</td><td>700-S</td><td>여과 공기</td></tr><tr><td>실리콘 튜빙</td><td>VWR</td><td>228-0701P</td><td>PEEK를 커플러에 연결</td></tr><tr><td>스테인리스강 카테터 커플러</td><td>Prime Bioscience</td><td>SC22/15</td><td>PEEK 튜브에 연결하기 위해 PDMS 입구 및 배출구에 삽입</td></tr>됨 <tr><td>열가소성 필름</td><td>Sigma Aldrich</td><td>PM996</td><td>표준 "파라필름" </td></tr><tr><td>초순수 에탄올</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>초음파 세척 수조</td><td>VWR</td><td>USC200TH</td><td>1L 비커를 수용하기 위해</td></tr><tr><td>진공 건조제</td><td>SP Bel-Art</td><td>F42022-0000</td><td>으로 PDMS 또는 용액을 탈기합니다.</td></tr></tbody></table>

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

Using Microfluidics and Fluorescence Microscopy to Study the Assembly Dynamics of Single Actin Filaments and Bundles

액틴 필라멘트의 조립 및 분해를 조절하는 복잡한 분자 메커니즘을 해독하기 위해서는 잘 조절 된 조건에서 개별 반응을 모니터링하는 것이 큰 자산입니다. 이를 위해 지난 20 년 동안 살아있는 단일 필라멘트 실험이 등장했으며, 대부분 총 내부 반사 형광 (TIRF) 현미경을 사용하여 주요 결과를 제공했습니다. 2011년에는 이러한 실험의 가능성을 더욱 확대하고 문제가 되는 아티팩트가 반복되는 것을 피하기 위해 이러한 분석에서 간단한 미세유체학을 도입했습니다. 이 연구는 개별 액틴 필라멘트가 패시베이션 커버슬립 표면에 한쪽 끝으로 고정되고 흐름과 일치하며 다양한 단백질 솔루션에 연속적으로 노출 될 수있는 우리의 기본 프로토콜을 자세히 설명합니다. 우리는 또한 특정 응용 분야에 대한 프로토콜을 제시하고 흐르는 솔루션의 점성 드래그 덕분에 제어 된 기계적 힘을 어떻게 적용 할 수 있는지 설명합니다. 우리는 이러한 실험의 기술적인주의 사항을 강조하고이 기술을 기반으로 가능한 개발을 간략하게 제시합니다. 이러한 프로토콜 및 설명은 오늘날 사용하기 쉬운 미세 유체 공학 장비의 가용성과 함께 비 전문가가 실험실에서이 분석을 구현할 수 있도록해야합니다.

위에서 설명한 모든 실험에서 형광으로 표지된 액틴 필라멘트는 표면에서 낮은 배경 형광을 나타내는 양호한 대비와 함께 명확하게 볼 수 있어야 합니다(그림 4, 일반적인 문제 해결을 위한 보충 파일 1 참조). 액틴 필라멘트는 또한 표면에 달라 붙지 않아야합니다 : 지배적 인 유속이 낮을 때, 액틴 필라멘트의 측면 변동은 살아있는 것을 관찰 할 때 인식 할 수 있어야하며 그들이 끝 중 하나에만 고정되어 있음을 명확하게 결정할 수 있어야합니다. 마찬가지로, TIRF 이미징을 사용할 때 수직 변동은 길이와 시간에 따른 강도의 변화로 볼 수 있어야 합니다. 적용된 유량에 따라 TIRF에 의해 획득된 액틴 필라멘트의 이미지 품질을 최적화하기 위해 TIRF 침투 깊이를 조정해야 할 수도 있습니다.
필라멘트를 중합 조건에 노출시킬 때(섹션 8 참조), 필라멘트 신장은 규칙적이어야 한다(즉, 필라멘트의 끝에서의 ...

우리는 형광 현미경과 함께 간단한 액틴 필라멘트 미세 유체 분석을위한 프로토콜을 제시하여 개별 액틴 필라멘트를 실시간으로 정확하게 모니터링하면서 순차적으로 다른 단백질 용액에 노출 할 수 있습니다.

In order to decipher the complex molecular mechanisms that regulate the assembly and disassembly of actin filaments, it is a great asset to monitor ...

우리는 형광 현미경을 미세 유체 공학과 결합하여 액틴 결합 단백질이 액틴 필라멘트의 조립 및 분해를 조절하는 방법을 연구합니다. 미세 유체학을 통해 우리는 생화학 적 및 기계적 조건을 정확하게 제어하면서 수십 개의 개별 액틴 필라멘트에서 일어나는 반응을 동시에 정량화 할 수 있습니다. 용액은 챔버에 도달 할 때까지 먼저 병렬로 주입 된 다음 필라멘트가 압력 설정을 변경하여 각 용액에 순차적으로 노출된다는 것을 기억하십시오.폴리디메틸실록산 또는 PDMS, 챔버 어셈블리의 제조를 시작하기 위해, 핫플레이트를 섭씨 100도까지 예열한다. 깨끗한 페트리 접시에 청소한 PDMS 챔버 하나와 유리 커버 슬립 한 개를 깊은 UV 클리너에서 삼 ~ 다섯 분 동안 자외선에 노출시킵니다. 완료되면 PDMS 챔버를 커버 슬립 위에 올려 놓고 UV에 직접 노출 된 두 표면이 접촉되도록하십시오.PDMS 커버 슬립 계면에 갇힌 기포를 제거하려면 손가락으로 챔버 표면을 부드럽게 누릅니다. 모서리와 측면을 강하게 눌러 챔버의 천장이 유리 표면과 닿지 않도록하십시오. 유리 바닥이 핫 플레이트를 향하도록 챔버를 섭씨 100도에서 5 분 동안 놓습니다.그런 다음 즉시 챔버를 사용하거나 일주일 동안 깨끗한 페트리 접시에 보관하십시오. 입구 및 출구 튜브를 헹구려면 2 밀리리터 저장소 튜브 하나를 300 마이크로 리터의 F 버퍼로 채우고 미세 유체 홀더에 나사로 고정하고 압력을 300 밀리바로 설정하십시오. F-버퍼의 다섯 ~ 여덟 방울이 낭비되도록 한 다음 압력을 0으로 설정하고 각 채널에 대해 절차를 반복하십시오.다음으로, 저장소 튜브의 출구에 대한 압력을 네 밀리바에서 50 밀리바까지 설정하고, 튜브 팁에서 액적이 나오면 튜브를 PDMS 챔버의 출구에 연결하십시오. 액체가 챔버를 채우고 모든 입구에서 나오면 출구 압력을 20 밀리바로 설정하십시오. 나중에 저장소 튜브의 압력을 1 ~ 50 밀리바로 설정하십시오.기포가 발생하지 않도록 하려면 튜브를 입구에 연결하기 전에 튜브와 PDMS 입구에서 물방울이 나오는지 확인하십시오. 입구의 압력을 30밀리바로 설정합니다. 시연된 대로 입구 두 개와 세 개를 연결한 후 모든 입구의 압력을 20밀리바로 설정하고 출구 압력을 0밀리바로 설정합니다.입구의 유속이 거의 동일한지 확인하십시오. 저수지를 변경할 때 모든 입구 압력을 12밀리바로 설정하고 출구 압력을 5밀리바로 설정하십시오. 용액을 신속하게 주입하려면 해당 입구의 압력을 150 밀리바로 설정하고 다른 입구의 압력을 약 100 밀리바로 조정하여 입구의 결과 유량이 분당 500 나노 리터가되도록하십시오.용액을 변경하려면 새로운 저장소 튜브에 200 ~ 300 마이크로 리터의 용액을 채우고 압력을 변경 설정으로 설정하십시오. 그런 다음 입구의 저수지 튜브의 나사를 풉니 다. 튜브 팁에 작은 물방울이 형성되면 신선한 용액으로 새 튜브를 조이고 압력 설정을 높은 흐름으로 변경하십시오.미세유체 구성 및 챔버 형상에 따라 용액이 튜브를 채우고 챔버에 도달할 때까지 세 분에서 다섯 분 정도 기다립니다. 이 과정은 시간에 따른 형광의 증가를 측정함으로써 뒤따를 수 있다. 표면 기능화를 위해, 용액 3 내지 200 마이크로리터의 50 피코몰 스펙트린-액틴 종자를 F-버퍼로 변경하고, 용액을 고유량 3으로 2분 동안 주입한다.표면 패시베이션을 위해, F 버퍼에 5 % BSA의 300 마이크로 리터로 튜브 3을 변경 한 다음 높은 흐름 3에서 5 분 동안 주입 한 다음 중간 흐름 3에서 5 분 동안 주입 한 다음 중간 흐름에서 5 분 동안 채널 하나와 두 개에서 일곱 ~ 8 밀리바의 감압으로 분당 100 나노 리터의 역류를 얻습니다. 전체 챔버 표면은 BSA 패시베이션됩니다. 튜브 셋을 F-버퍼로 바꿔 하이플로우 셋에서 다섯 분 동안 채널을 헹구십시오.나중에, 원고에 설명된 바와 같이, 튜브를 각각 하나의 마이크로몰 액틴 프로필린, 0.15 마이크로몰 액틴 및 F 버퍼로 1 내지 세 개로 변경하고, 3 내지 네 분 동안 모두 미리 설정된 고유동을 사용하여 신선하게 준비된 용액을 주입한다. 현미경을 켜고 카메라 노출 시간을 100 ~ 200 밀리 초, 여기 레이저를 10 ~ 20 % 전력, 총 내부 반사 형광 또는 TIRF 깊이를 200 ~ 300 나노 미터로 조정하여 60X 목표로 이미지를 캡처하십시오. 다음으로, 압력 설정을 10분 동안 10분 동안 유동미드로 설정하여 20초마다 하나의 프레임의 속도로 필라멘트 중합을 기록하고, 이어서 필라멘트 에이징을 위해 15분 동안 2개의 플로우 미드로 설정한다.에피형광 모드에서 다섯 초마다 한 프레임에서 탈중합을 포착하고, 한 프레임 내지 두 프레임 후에, 중간 흐름 셋으로 전환하여 초당 약 10개의 서브유닛에서 탈중합하는 필라멘트를 기록한다. 실험을 재설정하려면 형광으로 표지된 모든 필라멘트를 최대 전력으로 레이저에 두 분 동안 지속적으로 노출시켜 분해합니다. 솔루션을 하나, 둘 또는 세 개로 변경하고 서너 분 동안 높은 흐름으로 주입하여 서로 다른 조건을 테스트합니다.기본 중합 / 탈중합 실험의 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 얻어진 키모그래프를 사용하여 중합 및 탈중합 속도를 정량화하였다. 성장한 액틴 필라멘트가 형광 표지된 코필린 용액에 노출되었을 때, 코필린 클러스터는 핵을 형성하고 뾰족하고 철조망이 있는 끝쪽으로 성장하였다.단일 필라멘트가 파신에 노출되면 더 밝게 보이고 흐름과 완벽하게 정렬되지 않는 번들을 형성합니다. 튜브를 교체 할 때 시스템에 기포가 유입되지 않도록하고 저수지 튜브가 비어있게하지 않도록주의하는 것이 매우 중요합니다. 이 기술은 수십 개의 단일 필라멘트에 당기는 힘을 적용하고, 포르민과 코필린의 기계적 감도를 살펴보고, ARP2/3 탈분기를 하는 데 매우 중요했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biochemistry

생화학

시간 경과 현미경과 분해 굴지 모니터링

이 동영상은 액틴 및 미세소관 중합 역학을 시각화하기 위한 전반사 현미경 기반 기술인 TIRF에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 액틴과 미세소관 결합 역학의 고해상도 이미징을 실시간으로 수행할 수 있으며, 이는 세포 누화를 이해하는 데 필수적입니다.

액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

어떻게 마이크로 및 photomanipulation 기술이 FRAP photoactivation 활성화 운동 매개 변수 결정 및 마이그레이션 내 단백질의 spatiotemporal 역학 셀 설명 합니다. 실험 정보 subcellular 역학과 운동 성 레 귤 레이 터 또는 기본 말라 골격의 회전율을 포함합니다.

Micromanipulation 기법 전체적 역동성의 분석 및 Cytoskeletal 레 귤 레이 터의

선물이 분자 셔틀 만들려고 프로토콜 표면 준수 kinesin 모터 단백질 염색 이라는 microtubules을 추진. 표면으로 kinesins의 약한 상호 작용 그것에 그들의 뒤집을 수 있는 첨부 파일을 수 있습니다. 이 전시 하는 동적 어셈블리 및 그것의 기능을 유지 하면서 부품의 분해는 나노 시스템을 만듭니다.

Kinesins 연결 된 조립 분자 셔틀 역에 의해 구동

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

시험관 내에서 액토미오신 다발의 형성 및 광학 핀셋을 사용한 미오신 앙상블 힘 생성 측정이 제시되고 논의됩니다.

광학 핀셋을 사용하여 액틴 필라멘트 번들에서 미오신 앙상블 역학 조사

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

이 논문은 공동 얽힌 액틴 필라멘트와 미세 소관의 조정 가능한 3차원 복합 네트워크를 엔지니어링하고 특성화하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 복합 재료는 미오신 II 및 키네신 모터에 의해 구동되는 능동적 구조 조정 및 탄도 운동을 거치며 액틴, 미세 소관, 운동 단백질 및 수동 가교제의 상대적 농도에 의해 조정됩니다.

조정 가능한 모터 구동 역학 및 역학을 사용한 Actin-Microtubule 복합재 재구성 및 특성화

여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

학습하세요 형광 현미경과 미세 유체 공학을 결합하여 액틴 결합 단백질이 액틴 필라멘트 조립과 해체를 조절하는 메커니즘을 연구하는 방법을. 이 기술은 생화학적 및 역학적 조건을 정밀하게 제어하면서 수십 개의 개별 액틴 필라멘트에서 동시에 반응을 정량화할 수 있습니다.

미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

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