미세 유체 공학 및 형광 현미경을 사용하여 단일 액틴 필라멘트 및 번들의 조립 역학 연구

우리는 형광 현미경을 미세 유체 공학과 결합하여 액틴 결합 단백질이 액틴 필라멘트의 조립 및 분해를 조절하는 방법을 연구합니다. 미세 유체학을 통해 우리는 생화학 적 및 기계적 조건을 정확하게 제어하면서 수십 개의 개별 액틴 필라멘트에서 일어나는 반응을 동시에 정량화 할 수 있습니다. 용액은 챔버에 도달 할 때까지 먼저 병렬로 주입 된 다음 필라멘트가 압력 설정을 변경하여 각 용액에 순차적으로 노출된다는 것을 기억하십시오.

폴리디메틸실록산 또는 PDMS, 챔버 어셈블리의 제조를 시작하기 위해, 핫플레이트를 섭씨 100도까지 예열한다. 깨끗한 페트리 접시에 청소한 PDMS 챔버 하나와 유리 커버 슬립 한 개를 깊은 UV 클리너에서 삼 ~ 다섯 분 동안 자외선에 노출시킵니다. 완료되면 PDMS 챔버를 커버 슬립 위에 올려 놓고 UV에 직접 노출 된 두 표면이 접촉되도록하십시오.

PDMS 커버 슬립 계면에 갇힌 기포를 제거하려면 손가락으로 챔버 표면을 부드럽게 누릅니다. 모서리와 측면을 강하게 눌러 챔버의 천장이 유리 표면과 닿지 않도록하십시오. 유리 바닥이 핫 플레이트를 향하도록 챔버를 섭씨 100도에서 5 분 동안 놓습니다.

그런 다음 즉시 챔버를 사용하거나 일주일 동안 깨끗한 페트리 접시에 보관하십시오. 입구 및 출구 튜브를 헹구려면 2 밀리리터 저장소 튜브 하나를 300 마이크로 리터의 F 버퍼로 채우고 미세 유체 홀더에 나사로 고정하고 압력을 300 밀리바로 설정하십시오. F-버퍼의 다섯 ~ 여덟 방울이 낭비되도록 한 다음 압력을 0으로 설정하고 각 채널에 대해 절차를 반복하십시오.

다음으로, 저장소 튜브의 출구에 대한 압력을 네 밀리바에서 50 밀리바까지 설정하고, 튜브 팁에서 액적이 나오면 튜브를 PDMS 챔버의 출구에 연결하십시오. 액체가 챔버를 채우고 모든 입구에서 나오면 출구 압력을 20 밀리바로 설정하십시오. 나중에 저장소 튜브의 압력을 1 ~ 50 밀리바로 설정하십시오.

기포가 발생하지 않도록 하려면 튜브를 입구에 연결하기 전에 튜브와 PDMS 입구에서 물방울이 나오는지 확인하십시오. 입구의 압력을 30밀리바로 설정합니다. 시연된 대로 입구 두 개와 세 개를 연결한 후 모든 입구의 압력을 20밀리바로 설정하고 출구 압력을 0밀리바로 설정합니다.

입구의 유속이 거의 동일한지 확인하십시오. 저수지를 변경할 때 모든 입구 압력을 12밀리바로 설정하고 출구 압력을 5밀리바로 설정하십시오. 용액을 신속하게 주입하려면 해당 입구의 압력을 150 밀리바로 설정하고 다른 입구의 압력을 약 100 밀리바로 조정하여 입구의 결과 유량이 분당 500 나노 리터가되도록하십시오.

용액을 변경하려면 새로운 저장소 튜브에 200 ~ 300 마이크로 리터의 용액을 채우고 압력을 변경 설정으로 설정하십시오. 그런 다음 입구의 저수지 튜브의 나사를 풉니 다. 튜브 팁에 작은 물방울이 형성되면 신선한 용액으로 새 튜브를 조이고 압력 설정을 높은 흐름으로 변경하십시오.

미세유체 구성 및 챔버 형상에 따라 용액이 튜브를 채우고 챔버에 도달할 때까지 세 분에서 다섯 분 정도 기다립니다. 이 과정은 시간에 따른 형광의 증가를 측정함으로써 뒤따를 수 있다. 표면 기능화를 위해, 용액 3 내지 200 마이크로리터의 50 피코몰 스펙트린-액틴 종자를 F-버퍼로 변경하고, 용액을 고유량 3으로 2분 동안 주입한다.

표면 패시베이션을 위해, F 버퍼에 5 % BSA의 300 마이크로 리터로 튜브 3을 변경 한 다음 높은 흐름 3에서 5 분 동안 주입 한 다음 중간 흐름 3에서 5 분 동안 주입 한 다음 중간 흐름에서 5 분 동안 채널 하나와 두 개에서 일곱 ~ 8 밀리바의 감압으로 분당 100 나노 리터의 역류를 얻습니다. 전체 챔버 표면은 BSA 패시베이션됩니다. 튜브 셋을 F-버퍼로 바꿔 하이플로우 셋에서 다섯 분 동안 채널을 헹구십시오.

나중에, 원고에 설명된 바와 같이, 튜브를 각각 하나의 마이크로몰 액틴 프로필린, 0.15 마이크로몰 액틴 및 F 버퍼로 1 내지 세 개로 변경하고, 3 내지 네 분 동안 모두 미리 설정된 고유동을 사용하여 신선하게 준비된 용액을 주입한다. 현미경을 켜고 카메라 노출 시간을 100 ~ 200 밀리 초, 여기 레이저를 10 ~ 20 % 전력, 총 내부 반사 형광 또는 TIRF 깊이를 200 ~ 300 나노 미터로 조정하여 60X 목표로 이미지를 캡처하십시오. 다음으로, 압력 설정을 10분 동안 10분 동안 유동미드로 설정하여 20초마다 하나의 프레임의 속도로 필라멘트 중합을 기록하고, 이어서 필라멘트 에이징을 위해 15분 동안 2개의 플로우 미드로 설정한다.

에피형광 모드에서 다섯 초마다 한 프레임에서 탈중합을 포착하고, 한 프레임 내지 두 프레임 후에, 중간 흐름 셋으로 전환하여 초당 약 10개의 서브유닛에서 탈중합하는 필라멘트를 기록한다. 실험을 재설정하려면 형광으로 표지된 모든 필라멘트를 최대 전력으로 레이저에 두 분 동안 지속적으로 노출시켜 분해합니다. 솔루션을 하나, 둘 또는 세 개로 변경하고 서너 분 동안 높은 흐름으로 주입하여 서로 다른 조건을 테스트합니다.

기본 중합 / 탈중합 실험의 결과가 여기에 제시되어 있습니다. 얻어진 키모그래프를 사용하여 중합 및 탈중합 속도를 정량화하였다. 성장한 액틴 필라멘트가 형광 표지된 코필린 용액에 노출되었을 때, 코필린 클러스터는 핵을 형성하고 뾰족하고 철조망이 있는 끝쪽으로 성장하였다.

단일 필라멘트가 파신에 노출되면 더 밝게 보이고 흐름과 완벽하게 정렬되지 않는 번들을 형성합니다. 튜브를 교체 할 때 시스템에 기포가 유입되지 않도록하고 저수지 튜브가 비어있게하지 않도록주의하는 것이 매우 중요합니다. 이 기술은 수십 개의 단일 필라멘트에 당기는 힘을 적용하고, 포르민과 코필린의 기계적 감도를 살펴보고, ARP2/3 탈분기를 하는 데 매우 중요했습니다.