Name: 클로르헥시딘 글루코네이트 유발 복막 손상의 마우스 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: 학습하세요 클로르헥시딘 글루코네이트로 유도된 복막 섬유증의 마우스 모델을 구축하는 방법을. 이 단순하고 가시적인 프로토콜은 복막 투석 요법의 생리학적 및 병리학적 변화 연구에 활용됩니다.

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우리는 Shin-Han Tseng에게 비판적인 토론과 연구의 부분적인 실행에 진심으로 감사드립니다. 이 연구는 E-DA 병원 연구 재단과 대만 국립 청쿵 대학교의 EDAHP110003 및 NCKUEDA110002의 지원을 받았습니다.

모든 마우스 실험은 E-DA Hospital/I-Shou University의 Laboratory Animal Center의 승인을 받았으며 "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals"(NRC, USA 2011)에 따라 처리되었습니다. 7-8주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 본 연구에 사용하였다.
1. 화학 약품 준비
<ol><li>0.1% 클로르헥시딘 글루코네이트(CG, 재료 표 참조)를 15% 에탄올에 희석하여 화학적 자극제를 준비합니다.</li>
</ol>2. 동물 치료
<ol><li>세 마리의 마우스를 대조군으로 지정합니다. 0.9% 생리식염수(NS) 1mL/kg을 3주 동안 격일로 총 9회 복강주사(ip)한다.</li>
	<li>복막 섬유증 그룹에 3 마리의 마우스를 할당하십시오. 12.5μL/g 체중의 용량으로 15% 에탄올(1.1단계)에 0.1% CG를 주사하여 클로르헥시딘 글루코네이트(CG)를 사용하여 복막 섬유증을 유도합니다. 이것을 3 주 동안 격일로 총 9 번 수행하십시오.</li>
</ol>3. 복막 기능 검사 (복막 평형 시험 변형)
<ol><li>4.25% 포도당을 함유하는 투석액을 준비한다. 투석액 시료 0.5mL를 주사기로 채취한 후 투석액 시료의 포도당 농도를 확인합니다. 참고: 포도당 농도는 헥소키나제/G6PD 방법에 따라 결정됩니다. 투석액 샘플을 L-형 Glu2 분석에 접근하고 생화학적 분석기로 조사하였다( 재료 표 참조). 이것은 초기 투석액 포도당 농도입니다.</li>
	<li>20μL/20gw의 용량으로 Zoletil과 Xylazine(부피 1:2 비율로 준비, 재료 표 참조)을 근육내 주사하여 마우스를 마취합니다. 또한 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용하십시오.</li>
	<li>투석 용액(2mL/20g 체중)의 점적 수행.</li>
	<li>30분 후 발가락 꼬집음 반사가 없는 상태에서 마취 깊이를 평가하고 확인합니다. 그런 다음 복부 정중선 (xiphoid process) 아래에서 수직 절개를 수행 한 다음 마우스의 복부를 열고 주사기 ( "볼륨 1"로 정의 됨)로 복강 내 액을 수집합니다. 그런 다음 깨끗하고 마른 면의 무게를 측정하고 면봉을 생쥐의 복강에 넣어 잔류 복강 내액을 흡수합니다. 마지막으로 면 무게를 다시 측정합니다. 참고: 면화의 체중 증가는 잔류 복강내액의 무게와 같습니다. 그런 다음 얻은 부피(비중: 1g/cm3, "부피 2"로 정의됨)로 변환합니다. 최종 투석액의 양은 1권에 2권을 더한 것입니다.</li>
	<li>0.5mL의 투석액 샘플(최종 투석액)을 사용하여 포도당 농도를 측정합니다. 이것이 최종 투석액 포도당 농도입니다.</li>
	<li>화학식15를 사용하여 순 한외여과를 계산합니다. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63903/63903eq01.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>다음 식15를 사용하여 복막 투과도를 계산합니다. <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/63903/63903eq02.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>4. 복벽 근육과 간의 조직 준비 및 조직학적 분석
<ol><li>심장 천자 (정맥 절개술)를 통해 생쥐를 희생하십시오.3,16.</li>
	<li>복벽 (1cm x 1cm)을 자르고 전체 간 절제술을 받으십시오. 생쥐의 복벽과 간 조직을 10% 중성 완충 포르말린에 하룻밤 동안 고정합니다.</li>
	<li>복벽 근육과 간의 3μm 두께의 파라핀 절편을 준비하고 이전에 발표된 보고서17에 따라 조직학적 분석을 수행합니다.</li>
	<li>복벽의 정수리 복막과 마우스의 간 표면의 내장 복막을 형태 측정법을 사용하여 평가한다18.</li>
	<li>통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 통계 분석을 수행합니다( 재료 표 참조). 모든 데이터를 평균± SD로 표현하고 t-검정19를 사용하여 통계적 유의성을 분석합니다. P &lt; 0.05인 값을 유의한 결과로 정의합니다.</li>
</ol>

<ol><li>Han, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+outcome+of+CAPD%3A+twenty-five+years%27+experience+in+a+single+Korean+center%5BTitle%5D)+AND+%22Peritoneal+Dialysis+International%22%5BJournal%5D)">Improving outcome of CAPD: twenty-five years' experience in a single Korean center.</a> Peritoneal Dialysis International. 27 (4), 432-440 (2007).</li>
<li>Kawaguchi, Y., Hasegawa, T., Nakayama, M., Kubo, H., Shigematu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Issues+affecting+the+longevity+of+the+continuous+peritoneal+dialysis+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+International+Supplements%22%5BJournal%5D)">Issues affecting the longevity of the continuous peritoneal dialysis therapy.</a> Kidney International Supplements. 62, 105-107 (1997).</li>
<li>Lee, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+D+can+ameliorate+chlorhexidine+gluconate-induced+peritoneal+fibrosis+and+functional+deterioration+through+the+inhibition+of+epithelial-to-mesenchymal+transition+of+mesothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Vitamin D can ameliorate chlorhexidine gluconate-induced peritoneal fibrosis and functional deterioration through the inhibition of epithelial-to-mesenchymal transition of mesothelial cells.</a> BioMed Research International. 2015, 595030(2015).</li>
<li>Nakamoto, H., Kawaguchi, Y., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+technique+survival+on+peritoneal+dialysis+better+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Peritoneal+Dialysis+International%22%5BJournal%5D)">Is technique survival on peritoneal dialysis better in Japan.</a> Peritoneal Dialysis International. 26 (2), 136-143 (2006).</li>
<li>Schaefer, F., Klaus, G., Muller-Wiefel, D. E., Mehls, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+practice+of+peritoneal+dialysis+in+children%3A+results+of+a+longitudinal+survey.+Mid+European+Pediatric+Peritoneal+Dialysis+Study+Group+%28MEPPS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Peritoneal+Dialysis+International%22%5BJournal%5D)">Current practice of peritoneal dialysis in children: results of a longitudinal survey. Mid European Pediatric Peritoneal Dialysis Study Group (MEPPS).</a> Peritoneal Dialysis International. 19, Suppl 2 445-449 (1999).</li>
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<li>Ito, T., Yorioka, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritoneal+damage+by+peritoneal+dialysis+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Peritoneal damage by peritoneal dialysis solutions.</a> Clinical and Experimental Nephrology. 12 (4), 243-249 (2008).</li>
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</ol>

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본 연구에서는 마우스 PD 모델을 i.p. CG를 주사하고, 그 결과 이 모델에서 복막 섬유증과 기능 저하가 나타나 PD 환자의 상태를 모방하였다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫째, CG 또는 NS의 i.p. 주사를 수행하기 위해서는 천자로 인한 복강 내 장기 손상을 방지하기 위해 집게를 사용하여 마우스의 복벽 피부를 집어 올려야 합니다. 둘째, 조직학적 분석을 위해 복벽의 복막을 채취하는 동안 i.p. 주사로 손상된 부위는 피해야 합니다.
복막 섬유증의 여러 실험 동물 모델 중 가장 일반적인 것은 사용 편의성과 적응성 때문에 CG 모델입니다. Suga et al.20 은 1995년에 CG 유도 복막 섬유증 쥐 모델을 처음으로 보고했습니다. i.p. 2mL의 식염수에 용해된 0.1% CG와 15% 에탄올을 26일 동안 매일 주사했습니다. IshiI et <sup cla...

복막 투석(PD)은 일종의 신대체 요법입니다. 그러나 PD는 해결할 수 없는 문제가 있다. 예를 들어, 장기간의 PD 치료는 복막 손상을 야기할 수 있고, 결국 한외여과 실패 및 치료 중단을 초래할 수 있다(1,2,3,4,5,6). 복막 섬유증은 가장 심각한 합병증중 하나입니다 7,8. 복막 섬유증은 간질 내 세포외 기질의 침착 및 축적, 복막의 신혈관신생 및 혈관병증을 특징으로 한다 9,10.
이러한 복막 변화의 주요 원인은 재발성 복막염 및 투석액의 비생체적합성이며, 이는 고삼투압, 고포도당, 낮은 pH 및 포도당 분해 생성물 축적이다11,12. 따라서 적절한 동물 실험 모델은 연구자들이 PD 치료 중 복막의 생리학적 및 병리학적 변화를 더 잘 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다. 따라서 PD 기술 및 투석 효능을 향상시키고 환자의 생존을 연장하기 위해서는 동물 PD 모델을 구축하는 것이 중요합니다. 이 연구는 앞서 설명한 바와 같이 클로르헥시딘 글루코네이트(CG)의 복강내(i.p.) 주사에 의해 PD 마우스 모델을 생성하는 것을 목표로 했습니다 13,14. 이 PD 마우스 모델은 다른 PD 동물 모델에 비해 간단하고 사용하기 쉬우며 실현 가능합니다.

<table><tbody><tr><td>0.9 % 일반 식염수</td><td>Y F CHEMICAL CORP., 신베이시, 대만</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>10 % 중성 완충 포르말린</td><td>대만 Burnett International Co., Ltd., Taipei City, Taiwan</td><td>00002A</td><td></td></tr><tr><td>자동 생화학 분석기</td><td>Hitachi Ltd., Tokyo, Japan</td> 포도당 <td>농도 측정을위한</td><td>Labospect 시리즈 008</td></tr><tr><td>클로르헥시딘 디 글루 코네이트 용액, H2에서 20 %O</td><td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td><td>C9394</td><td>주입용 15% 에탄올로 0.1%로 희석</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>Avantor Performance Materials, LLC, PA, USA</td><td>BAKR8006-05</td><td>작업 농축을 위해 생리 식염수로 15%로 희석</td></tr><tr><td>포도당(Dianeal)</td><td>Baxter International, Inc., IL, USA</td><td>FNB9896</td><td>상업용 투석 용액(4.25%)</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8.0</td><td>GraphPad 소프트웨어, Inc., CA, US</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-type Glu 2 assay</td><td>FUJIFILM Wako, Japan</td><td>461-32403</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine 20</td><td>Juily Pharmaceutical Co., Ltd., New Taipei City,</td> <td>Taiwan-Zoletil</td><td></td></tr> <tr><td>50</td><td>Virbac Laboratories, Carros, France</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

클로르헥시딘 글루코네이트 유발 복막 손상의 마우스 모델

A Mice Model of Chlorhexidine Gluconate-Induced Peritoneal Damage

복막 섬유증은 복막 투석(PD)의 중요한 합병증입니다. 이 문제를 조사하고 해결하기 위해서는 PD의 적절한 동물 모델이 필요합니다. 본 프로토콜은 PD 환자의 상태를 모방하는 클로르헥시딘 글루코네이트(CG) 유도 복막 섬유증 모델을 설정합니다. 복막 섬유증은 수컷 C57BL/6 마우스에서 총 9회 동안 3주 동안 15% 에탄올에 0.1% CG를 복강내 주사하여(격일로 투여) 유도했습니다. 그런 다음 22일째에 복막 기능 테스트를 수행했습니다. 생쥐를 희생시킨 후, 복벽의 정수리 복막과 간의 내장 복막을 적출 하였다. 그들은 Masson의 삼색 염색 후 현미경으로 분석했을 때 더 두껍고 섬유질적이었습니다. 한외여과율은 감소하였고, 포도당 질량수송은 CG에 의해 유도된 복막 투과성의 증가를 나타내었다. 이렇게 확립된 PD 모델은 PD 기술을 개선하고, 투석 효능을 개선하고, 환자 생존을 연장하는 데 응용할 수 있다.

그림 1A,B에서 복벽의 정수리 복막은 Masson의 삼색 염색17에서 현저하게 두껍고 섬유화되었으며, 이는 CG 노출 그룹에서 복막 섬유증이 대조군 식염수 그룹(NS)보다 더 심각함을 나타냅니다. 그림 2A,B에서 간 표면의 내장 복막도 현저하게 두껍고 섬유화되어 CG 노출 그룹에서 복막 섬유증이 대조군 식염수군(NS)보다 더 심하다는 것을 증명합니다. 도 3A에서, 한외여과율은 CG 군에서 감소하고, 글루코스 질량수송은 CG 유도군에서 복막 투과성이 증가함을 나타내었다(도 3B).
<im...

현재 프로토콜은 클로르헥시딘 글루코네이트(CG) 유발 복막 섬유증의 복막 투석(PD) 마우스 모델을 설정합니다. 현재 모델은 다른 PD 동물 모델에 비해 간단하고 사용하기 쉽습니다.

Peritoneal fibrosis is an important complication of peritoneal dialysis (PD). To investigate and address this problem, an appropriate animal model of PD ...

복막투석을 위한 동물모델인 PD를 확립하는 것은 매우 중요하다. 파킨슨병 치료의 기술과 효능을 향상시켜 궁극적으로 환자의 생존율을 높일 수 있기를 바랍니다. 이 복막 투석 마우스 모델은 다른 복막 투석 동물 모델에 비해 간단하고 사용하기 쉬우며 눈에 띕니다.적합한 복막 투석 동물 모델은 연구자들이 파킨슨병 치료 동안 복막, 생리학적 및 병리학적 변화를 연구하는 데 도움이 될 수 있다. 절차의 시연은 내 실험실의 연구 조교 인 Fang-Ling Liao가 될 것입니다. 시작하려면 0.1 % 클로르헥시딘 글루코 네이트를 15 % 에탄올에 희석하여 화학 자극제를 준비하십시오.다음으로, 3마리의 마우스를 대조군으로 지정하고 0.9% 생리식염수를 kg당 1밀리리터씩 격일로 3주간 총 9회 복강주사한다. 그 후 3마리의 마우스를 복막 섬유증 그룹에 할당하고, 앞서 준비한 0.1% 클로르헥시딘 글루코네이트 용액을 체중 kg당 12.5μL의 용량으로 복강 주사하여 복막 섬유증을 유도한다. 복막 기능 검사를 위해 4.25% 포도당이 함유된 투석액을 준비합니다.그런 다음 주사기를 사용하여 0.5ml의 투석액 샘플을 채취합니다. 졸레틸과 자일라진의 주사를 준비하고 근육 주사를 투여하여 마우스를 마취시킵니다. 체중 20g 당 2 밀리리터의 용량으로 투석 용액을 복강 내 설치한다.복부 정중선을 작게 절개하고 주사기로 주요 복강 내액을 모은다. 30분 후, 검상돌기 아래 복부 정중선을 수직 절개하고 마우스의 복부를 열어 주사기로 잔류 복강내액을 채취한다. 다음으로 깨끗하고 마른 면봉의 무게를 측정합니다.솜을 마우스의 복강에 넣어 잔류 복강 내액을 흡수한 후 제거합니다. 면 무게를 다시 측정하십시오. Masson의 삼색 염색은 클로르헥시딘 글루코네이트 노출군에서 복벽의 정수리 복막이 대조군보다 현저하게 두껍고 섬유화되었음을 보여주었습니다.간 표면의 내장 복막은 또한 대조군 식염수 그룹보다 클로르헥시딘 글루코네이트 노출군에서 유의하게 두껍고 섬유화되었으며, 이는 클로르헥시딘 글루코네이트 노출군에서 복막 섬유증이 더 심하다는 것을 나타냅니다. 클로르헥시딘 글루코네이트 노출군은 한외여과율이 감소하고 포도당 질량 수송이 증가하여 클로르헥시딘글루코네이트 노출된 마우스에서 복강 투과성이 증가함을 나타내어 복강주사 시술을 하는 동안 집게를 사용하여 마우스의 복부 피부를 채취하여 천자로 인한 복강내 장기 손상을 방지하였다.

a-mice-model-of-chlorhexidine-gluconate-induced-peritoneal-damage

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

출처: 드 브리스, C. R., et.al. 만성 Pseudomonas aeruginosa 상처 감염의 지연 접종 모델. J. Vis. 경험 (2020)이 영상은 투명 필름 드레싱으로 덮인 두 개의 전층 등 피부 상처를 가진 쥐에 발광성 Pseudomonas aeruginosa 를 지연 접종하는 과정을 보여줍니다. 이로 인해 바이오필름 형성과 만성 감염 형성이 촉진됩니다. 정기적인 생물발광 모니터링을 통해 박테리아 부담을 정량화하고 감염 진행 상황을 시간에 따라 추적할 수 있습니다.

만성 Pseudomonas aeruginosa 피부 상처 감염의 마우스 모델 개발 

여기는 실시간, 비-침략 적, 발광 녹 농 균의 biofilm 상처 감염의 모니터링을 위한 털 쥐를 활용 하 여 새로운 당뇨병 murine 모델에 설명 합니다. 이 메서드는 다른 세균성 종 및 다 종 biofilms를 포함 하 여 유전자 변형된 미생물의 감염을 평가 하 고 antibiofilm 전략의 효능 테스트에 적용할 수 있습니다.

라이트 사이드에와 서: Vivo에서 당뇨병 털 Murine 모델에 만성 상처에서 녹 농 균 Biofilm 감염의 모니터링

이 문서는 복 카 테 테 르는 동물 뒤에 있던 한 액세스 포트에 연결 된 쥐에 외과 위치에 대 한 메서드를 보여 줍니다. 또한, 5/6 신 PD 환자의 신부전 상태를 위한 절차를 설명 합니다.

카 테 테 르 배치 및 5/6 신 복 막 투 석의 Murine 모델에 대 한 수술 기법

만성 상처는 전체 두께 의 상처 후 산화 스트레스의 높은 수준을 유도하여 당뇨병 마우스 모델에 급성 상처에서 개발된다. 상처는 카랄라제와 글루타티온 과산화효소에 대한 억제제로 처리되어 피부 미생물군유전체에 존재하는 박테리아에 의한 치유 및 생물막 발달을 방해합니다.

당뇨병 마우스에서 만성 상처를 만드는 프로토콜

여기서, 우리는 마우스에서 국소치성 치주염을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 우리는 마우스의 치아에 구멍을 뚫고 국소 염증을 유발하기 위해 펄프를 노출시키는 방법을 보여줍니다. 마이크로 CT 및 조직학과 같은 이 염증의 본질을 조사하는 분석 방법도 입증됩니다.

마우스에 있는 정점 치주염 유도

본 프로토콜은 마우스에서 적외선 복부 대동맥의 출현에 엘라스타제의 직접 적용을 통해 엘라스타아제 유도 AAA 모델에 대한 표준화된 수술 방법을 기술한다.

엘라스타제의 혈관주위 적용에 의해 유도된 마우스 복부 대동맥류 모델

이 기사에서는 기존 기술에서 관찰된 주요 기술적 문제를 피하기 위해 쥐 모델에 복막 투석 카테터를 이식하는 절차의 수정에 대해 설명합니다.

마우스의 복막 투석 카테터 배치를 위한 역행 이식 접근법

이 연구는 두 가지 중요한 실험 기법을 제시합니다: 상처 봉합을 평가하기 위한 쥐 상처 모델의 구축과 세포 생존력을 보존하기 위해 쥐 피부에서 단세포 현탁액을 준비하는 것입니다.

마우스 상처 모델 및 단일 세포 현탁액 준비

이 원고는 염화칼슘과 엘라스타제를 사용하여 생쥐 복부 대동맥류 모델을 확립하기 위한 프로토콜을 제시하고 이전 모델링 방법의 장점을 결합합니다. 이 모델은 복부 대동맥류의 기저에 있는 병태생리학적 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

Periadventitial Calcium Chloride and Elastase Infiltration에 의한 마우스 복부 대동맥류 모델

복강 내 약물 투여는 췌장 손상을 유발하기 위한 안전하고 효과적인 비침습적 접근법입니다. 이 연구는 다양한 정도의 췌장 손상을 유발하기 위해 마우스에 대한 5가지 고유한 복강 내 주사 프로토콜을 비교하고 중증 급성 췌장염(SAP)에 대한 병리학적 변화와 치료 전략을 조사하기 위해 중증 췌장 손상 모델을 설정했습니다.

Caerulein과 Lipopolysaccharide의 조합을 통한 중증 급성 췌장염의 마우스 모델 준비 복강 내 주사

학습하세요 클로르헥시딘 글루코네이트로 유도된 복막 섬유증의 마우스 모델을 구축하는 방법을. 이 단순하고 가시적인 프로토콜은 복막 투석 요법의 생리학적 및 병리학적 변화 연구에 활용됩니다.

클로르헥시딘 글루코네이트 유발 복막 손상의 마우스 모델

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