Name: 플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: 배우세요 마우스 골격근에서 전기천공을 이용한 플라스미드 DNA 전달 기법을. 이 방법은 근육 수축성을 손상시키지 않고 유전자 발현을 효율적으로 조절할 수 있어 근육 생리학 연구에 활용됩니다.

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동물을 이용한 모든 실험은 Penn State College of Medicine에서 수행되었으며, Penn State University의 Institutional Animal Care and Use Committee의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정안에 명시된 윤리적 기준에 따라 수행되었습니다. 12주령의 암컷 C57BL/6 마우스를 이 절차에 사용하였다. 모든 수술 도구는 실험 전에 불임성을 위해 오토클레이브되었다.
1. TA 및 EDL 주입 / 전기 천공 준비
참고: 이 단계는 TA 및 EDL 주입/전기천공 준비에 대해 동일합니다.
<ol><li>발현 플라스미드 구축물을 실험 전에 멸균 PBS에 희석된 1 μg/μL의 농도로 정제한다. 이 절차를 위해, pcDNA3-EGFP (GFP) 또는 pcDNA3 빈 벡터 (대조군)를 정제하기 위해 상업적으로 이용가능한 내독소 없는 정제 키트를 사용하였다.</li>
	<li>적절한 주입 부피를 보장하기 위해 플라스미드 농도를 계산한다 (멸균 PBS의 50 μL 중의 TA 50 μg의 DNA; EDL 10 μg의 DNA를 멸균 PBS의 10 μL) 및 분취량 샘플.</li>
	<li>선택 휠을 사용하고 휠을 눌러 다음과 같이 매개 변수를 선택하여 전기 기공기 설정을 프로그래밍하십시오 : 모드 - LV, 전압 - 12.5V / mm (사출시 조정), 펄스 길이 - 20ms, 펄스 수 - 5, 간격 - 200ms, 극성 - 단극.</li>
	<li>이소플루란 가스를 사용하여 마우스를 마취하십시오. 마우스를 5% 이소플루란이 있는 유도 박스에 넣는다. 포셉을 사용하여 발가락 핀치 반사의 부재에 의해 마취의 수술 평면을 확인하고 이소플루란을 2 % 유지 용량으로 줄입니다. 나머지 절차를 위해 37°C에서 순환 플레이트 상에 놓여 있는 적절한 코콘으로 마우스를 옮긴다.</li>
	<li>작은 머리 깎기를 사용하여 양쪽 뒷다리에서 머리카락을 제거하십시오. 주사 부위를 소독하기 위해 70 % 에탄올 / 베타 딘을 번갈아 가며 하지를 문질러 닦으십시오.</li>
</ol>2. TA 주입/전기천공
<ol><li>마우스를 수핀 위치에 두고, 아래쪽 다리의 측면 측면에 있는 피부를 통해 보이는 TA 힘줄을 찾습니다. 분리 가능한 30G 바늘이 있는 50μL 마이크로 주사기를 사용하여 바늘이 근육의 우수한 끝에 도달할 때까지 얕은 5° 각도로 근관 접합부보다 우수한 1-2mm 바늘을 삽입합니다. 참고 : 근육의 중앙에 주사가 목표입니다.</li>
	<li>주입 경로를 따라 바늘을 천천히 후퇴시키면서 플런저를 천천히 감압하여 50 μL의 플라스미드 용액을 전달하였다. 근육이 부풀어 오른다.</li>
	<li>타이머를 1분 동안 설정하고 TA에서 다리의 두께를 측정한다. 마우스의 크기에 따라 5-10mm 일 수 있습니다. 캘리퍼 전극을 측정된 두께로 설정하고 전기천공 전압을 12.5V/mm로 설정합니다.</li>
	<li>1분 후, 캘리퍼 전극을 하지에 놓습니다. 전극은 꼭 맞아야 하지만 지나치게 꽉 조여서는 안 됩니다. 20ms 지속 시간과 200ms 간격으로 5 개의 구형파 펄스를 전달하십시오 (근육은 각 펄스마다 경련을 일으켜야합니다).</li>
	<li>제어 벡터를 사용하여 대체 사지로 반복하십시오.</li>
	<li>마우스를 마취로부터 분리하고 37°C로 설정된 가열 패드 상에서 회수하도록 허용한다. 복구되면 마우스를 케이지로 되돌립니다.</li>
</ol>3. EDL 주입/전기천공
<ol><li>마우스를 수핀 위치에 두고, 경골 뼈 앞쪽 볏을 시각적으로 그리고 부드러운 촉진을 통해 찾습니다.<ol>
<li>메스를 사용하여 경골 전방 볏의 측면 측면의 피부를 통해 얕은 절개를 무릎보다 5mm 열등하게 하여 TA 근관 접합부보다 2mm 우수하게 만듭니다.</li>
		<li>작은 가위를 사용하여 근막을 무딘 해부하여 TA 근육을 노출시킵니다.</li>
		<li>다시 말하지만, 가위로 무딘 해부를 사용하여 근육을 옆으로 당겨 EDL을 노출시켜 경골에서 TA 근육을 부드럽게 분리하십시오. 작고 곡선 포셉을 사용하여 절차 중에 EDL에서 TA를 깨끗하게 유지할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>분리 가능한 30G 바늘이 있는 50μL 마이크로 주사기를 사용하여 바늘이 근육의 우수한 끝에 도달할 때까지 바늘을 EDL에 세로 방향으로 삽입합니다.</li>
	<li>주입 경로를 따라 바늘을 천천히 후퇴시키면서 플런저를 천천히 감압하여 플라스미드 용액 10 μL를 주입한다(근육이 부풀어 오름).</li>
	<li>타이머를 1 분 동안 설정하고 EDL에서 다리의 두께를 측정하십시오. 마우스의 크기에 따라 5-10mm 일 수 있습니다. 캘리퍼 전극을 측정된 두께로 설정하고 전기천공 전압을 12.5V/mm로 설정합니다.</li>
	<li>1분 후, 캘리퍼 전극을 하지에 놓습니다. 전극은 꼭 맞아야 하지만 지나치게 꽉 조여서는 안 됩니다. 20ms 지속 시간과 200ms 간격으로 5개의 구형파 펄스를 전달합니다(근육은 각 펄스마다 경련을 일으켜야 함).</li>
	<li>일회용 4/0 비흡수성 나일론 봉합사를 사용하여 절개를 닫습니다.</li>
	<li>대체 사지로 반복하거나 절대 통제로 팔다리를 손대지 않은 채로 두십시오.</li>
	<li>마우스를 마취로부터 분리하고 37°C로 설정된 가열 패드 상에서 회수하도록 허용한다. 수술 직후와 수술 후 12-24 시간 동안 적절한 피하 진통제를 투여하십시오. 복구되면 마우스를 케이지로 되돌립니다. 참고 : 이전 연구는 전기 천공 직후 TA에서 근육 수축성 결핍을 보여 주었고 수축 회복은 3 일 동안 발생합니다13,15. 이러한 이유로, 조직학, 단백질 발현 또는 근육 수축성에 대한 TA 및 EDL 근육 둘 다의 분석은 전기천공 후 3-10일 후에 수행된다. EGFP의 장기간 발현은 절차13 이후 3주까지 관찰되었다.</li>
</ol>

<ol><li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li>
<li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp27+inhibits+IKK%CE%B2-induced+NF-%CE%BAB+activity+and+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li>
<li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Regulatory%2C+Integregrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li>
<li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li>
<li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li>
<li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle%3A+studies+on+isolated+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li>
<li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li>
<li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li>
<li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li>
<li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li>
<li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li>
<li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li>
<li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732(2015).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li>
<li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li>
<li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li>
<li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+efficacy%2C+longevity%2C+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li>
</ol>

B.A.H.와 D.L.W.는 이해 상충이 없다고 주장합니다.

전기천공에 의해 강화된 골격근에서의 생체내 유전자 전달은 근육에서 단백질 발현을 조절하기 위한 유용하고 비교적 간단한 도구이다. 우리는 EDL 및 TA 근육에서 효율적인 유전자 전달을 달성하는 데 필요한 단계를 보여 주었고 EDL의 수축성 측정이 절차에 따라 실행 가능하다는 것을 입증했습니다. 이 기술은 더 복잡한 바이러스 벡터를 필요로 하지 않으며, 단일 근육에서 형질감염된 근육 섬유 및 비형질감염된 근섬유 단면 면적의 비교를 허용한다. 이 절차의 한계는 컨스트럭트 흡수 효율이 완전하지 않았고 일부 근섬유가 형질감염되지 않은 채로 남아 있다는 것이다.
논의된 절차는 발현 벡터의 전기천공에 한정되지 않는다. 우리는 이전에 단백질 녹다운이 동일한 절차를 따르지만 생체 내14에서 siRNA 또는 shRNA 구축물을 사용함으로써 달성 될 수 있음을 보여주었습니다. 추가적으로, 리포터 구축물은 표적 유전자<sup...

생체 내에서 골격근으로의 플라스미드 DNA 전기천공은 다양한 생리학적 및 병리생리학적 조건에서 유전자 발현을 조절함으로써 골격근 생리학 및 분자 신호전달의 변화를 평가하기 위한 중요한 도구이다 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . 골격근으로의 실험적 유전자 전달은 Wolff et al.에 의해 1990 년 초에 입증되었으며, RNA와 DNA는 모두 전기 천공없이 성공적으로 전달되었으며 루시퍼라제 발현은 적어도 2 개월 동안10 년 동안 유지되었습니다. 주사만으로 비교적 낮은 형질감염 효율은 문제가 있으며, 아이하라와 미야자키는 1998년 pCAGGS-IL-5 구축물을 경골 전방(TA) 근육으로 전기천공하고 혈청 IL-5 발현11을 측정함으로써 전기천공을 통한 유전자 전달 증가를 입증했다. 그 이후로 많은 연구가 최대의 유전자 전달 효율을 보장하기 위해 다양한 DNA 농도, 부피 및 전기 천공 매개 변수의 효능을 조사했습니다. Mir et al.은 DNA 농도뿐만 아니라 전압, 펄스 수, 펄스 지속 시간 및 주파수를 포함한 다양한 전기 천공 매개 변수를 테스트하고 더 큰 전압, 펄스 수 및 DNA 농도가 모두 전기 천공 효율 증가에 기여한다는 것을 확인했습니다12. 높은 전기 천공 전압에 대한 주요 경고는 근섬유로의 DNA 흡수 증가를 촉진하지만 근육 손상을 일으켜 결과를 혼란스럽게 할 수 있다는 것입니다. Schertzer et al. 200V에서의 전기 천공은 전기 천공 후 3 일 후에 근섬유의 약 50 %에서 손상을 일으킨 반면, 근섬유의 10 %만이 50V13에서 손상되었음을 보여주었습니다. 우리는 근육 손상에 비해 효율적인 DNA 전달에 영향을 미치는 변수를 고려했으며 캘리퍼 너비의 센티미터 당 125V의 전압이 효과적인 유전자 전달을 달성하기에 충분하다는 것을 발견했습니다.
전기천공 후 근육 섬유 단면적 및 전체 근육 수축성의 분석은 유전자 조절에 의한 근육 크기 및 기능의 변화를 측정하는 방법의 중요한 측면이다. 우리와 다른 사람들은 이전에 제어 벡터의 전기 천공만으로는 근섬유 영역의 감소를 일으키지 않는다는 것을 입증했습니다. 녹색 형광 단백질(EGFP) 구축물은 이들 연구13,14에서 DNA 형질감염의 유용한 형광 지표였다. 많은 연구가 전기 천공 후 TA의 계내 수축성을 조사하고 다양한 결과를 발견했습니다. 한 연구에 따르면 75V/cm 전기천공은 전기천공 후 3일 동안 파상력이 약 30% 감소했으며, 전기천공 후 7일까지 파타닉 파워가 대조군 수준으로 돌아간 반면, 50V/cm 전기천공은 힘13,15를 손상시키지 않았다. 또 다른 연구에 따르면 180V / cm 전기 천공 후 3 시간 후에 파타닉 힘이 30 % 손실되어 7 일16 일 후에 가짜 힘 수준으로 회복되었습니다.
다음의 상세한 절차에서, 우리는 마우스의 TA 및 신근 디지토럼 롱구스 (EDL) 근육에서 pcDNA3-EGFP 플라스미드의 주사 및 전기천공을 입증한다. 우리는 또한이 방법이 EDL 전체 근육 수축성에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증합니다. 목표는 기능 손실을 일으키지 않고 근섬유로의 효율적인 플라스미드 흡수를 입증하는 것입니다.

<table><tbody><tr><td>4-0 나일론 봉합사 (비흡수성)</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>봉합사 피부 절개</td></tr><tr><td>봉합 50&micro; l 해밀턴 주사기</td><td>해밀턴</td><td>80501</td><td>마이크로 주사기</td></tr><tr><td>C57BLl/6NHsd 마우스</td><td>Envigo</td><td>044</td><td>실험에 사용되는 12주 된 암컷 마우스</td></tr><tr><td>캘리퍼스 전극</td><td>BTX</td><td>45-0102</td><td>1.0cm x 1.0cm 스테인레스 스틸</td></tr><tr><td>동적 근육 제어 데이터 수집/분석</td><td>근육 수축성 측정 및 분석에 사용되는</td> <td>Aurora Scientific</td><td>605A</td> 소프트웨어</tr><tr><td>ECM 830 Electroporation System</td><td>BTX</td><td>45-0662</td><td>electroporator</td></tr><tr><td>EndoFree 플라스미드 맥시 키트</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>플라스미드 정제 키트</td></tr><tr><td>Extra Narrow Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>무딘 해부용 가위</td></tr><tr><td>힘 변환기</td><td>Aurora Scientific</td><td>407A</td> EDL Micro-Masquito Hemastats<td>의 힘을 측정하기 위해</td></tr><tr><td></td><td>정밀 과학 도구</td><td>13010-12</td><td>spERcDNA3.1</td></tr><tr><td>포유류 발현 벡터</td>를 위한 지혈제 <td>Fisher Scientific</td><td>V79020</td><td>제어 벡터</td></tr><tr><td>pcDNA3-EGFP 발현 플라스미드</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td>GFP 발현을 위한 플라스미드</td></tr><tr><td>Semken 곡선 겸자</td><td>Fine Science Tools</td><td>11009-13</td><td>수술용 겸</td></tr>자 <tr><td>수술용 칼날 스테인리스 스틸 no. 10</td><td>Becton Dickinson</td><td>37 1210</td><td>메스 블레이드</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. 매체</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>조직학을 위한 동결 매체</td></tr><tr><td>밀 배아 응글루시닌- Texas Red</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>W21405</td><td>근육 단면을 위한 멤브레인 염색</td></tr></tbody></table>

플라스미드 dna를 마우스 골격근으로 전기천공

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

플라스미드 전기천공에 의한 뮤린 골격근에서의 일시적 유전자 발현 조절은 정상 및 병리학적 생리학을 평가하는데 유용한 도구이다. 표적 유전자의 과발현 또는 녹다운을 통해 조사자는 개별 분자 사건을 조작할 수 있으며, 따라서 근육 질량, 근육 대사 및 수축성에 영향을 미치는 메커니즘을 더 잘 이해할 수 있습니다. 또한, 형광 태그를 인코딩하는 DNA 플라스미드의 전기천공은 조사자가 생체 내에서 골격근에서 단백질의 세포내 국소화의 변화를 측정할 수 있게 한다. 골격근의 주요 기능 평가에는 근육 수축성의 측정이 포함됩니다. 이 프로토콜에서, 우리는 플라스미드 DNA 주입, 전기천공 및 유전자 발현 조절 후에도 전체 근육 수축성 연구가 여전히 가능하다는 것을 입증한다. 이 교육 절차의 목표는 경골 전방 및 신근 디지토럼 롱 근육의 근섬유에서 흡수 및 발현을 촉진하기 위해 마우스 골격근으로 DNA 플라스미드 전기 천공의 단계별 방법을 시연하고 골격근 수축성이 주입 및 전기 천공에 의해 손상되지 않는다는 것을 입증하는 것입니다.

골격근에서 유전자 전달을 촉진하기 위한 전기천공은 근육 생리학의 변화를 평가하는데 사용되는 유용한 기술이다. 우리는 TA 및 EDL 근육 모두에서 효율적인 유전자 전달을 달성하기위한 상세하고 단계별 절차를 입증했습니다. 형질감염 효율의 차이는 다수의 변수로 인해 발생한다. 이러한 변수 중에는 전기 천공 매개 변수 (펄스, 전압, 펄스 지속 시간 등), 유전자 구성 크기 및 주입 된 DNA의 농도 / 부피가 있습니다. 우리는 이전에 125V / cm에서 5 펄스의 전기 천공 매개 변수, 200 ms 간격으로 분리 된 20 ms 지속 시간을 가지며 TA14에서 효율적인 유전자 전달을 달성하기에 충분하다는 것을 보여주었습니다. 우리는 또한 현재 연구에서 DNA의 주입 / 전기 천공이 실험 후 3 일 동안 EDL에서 근육 수축성의 손실을 일으키지 않는다는 것을 보여줍니다.
유전자 전달을 가시화하기 위해, pcDNA3-EGFP 또는 pcDNA3 ...

플라스미드 DNA를 골격근으로 전기천공하는 것은 마우스의 근육 수축성을 손상시키지 않으면서 유전자 발현을 조절하는 실행 가능한 방법이다.

플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

근육에서의 전기천공-매개 유전자 전달은 근육 생리학의 변화를 조사하는 쉽고 효율적인 기술이다. 우리는 전기 천공이 근육 수축성을 손상시키지 않는다는 것을 발견했습니다. 생체 내에서 근육으로 유전자 구축물을 전기천공하는 것은 유전자 구축물을 바이러스 벡터로 더 광범위하게 패키징할 필요가 없는 간단하고 효율적인 절차이다.EDL의 위치와 크기가 작기 때문에 EDL을 시각화, 격리 및 주입하는 것은 어렵습니다. 마우스 시체에서 연습하고 인도 잉크와 같은 생물학적 잉크를 주입하면 충분한 주사의 증거를 제공하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 포스트 문서 인 Brian Hain이 될 것입니다.마우스를 주입하기 전에 발가락 핀치 반사가없는 포셉을 사용하여 마취의 수술 평면을 확인한 다음 마우스를 섭씨 37도의 순환 물 플레이트에 놓여있는 코 콘으로 옮기고 나머지 절차 동안. 마우스를 수핀 위치에 놓으면 작은 머리 깎기를 사용하여 뒷다리에서 머리카락을 제거한 다음 70 % 에탄올과 베타 딘을 번갈아 가며 주사 부위를 소독하십시오. 주사의 경우 아래 다리의 측면 측면에서 피부를 통해 보이는 경골 전방 또는 TA 힘줄을 찾아 TA 근육의 우수한 끝을 표시하십시오.그런 다음 바늘이 근육의 우수한 끝에 도달 할 때까지 50 마이크로 리터 마이크로 주사기에 장착 된 30 게이지 바늘을 근긴장 접합부보다 한 두 밀리미터 떨어진 얕은 5도 각도로 근육에 삽입하십시오. 주입 경로를 따라 바늘을 천천히 후퇴시키면서 플런저를 눌러 50 마이크로리터의 플라스미드 용액을 근육으로 전달한다. 근육이 부풀어 오른다.타이머를 일분 동안 설정하고 TA 근육에서 다리의 두께를 측정 한 다음 캘리퍼 전극을 측정 된 두께로 설정하십시오. 그런 다음 전기 기공 전압을 밀리미터 당 12.5V로 설정하십시오. 1분 후, 캘리퍼 전극을 하지에 너무 꽉 조이지 않고 하지에 가깝게 배치하여 20밀리초 지속 시간과 200밀리초 간격으로 다섯 개의 구형파 펄스를 전달합니다.근육은 각 맥박으로 경련을 일으켜야합니다. 대조군 플라스미드 벡터를 사용하여 다른 사지와 함께 절차를 반복한다. 완료되면 코 콘에서 마우스를 제거하고 섭씨 37도까지 설정된 가열 패드에서 마우스를 회복시킵니다.복구되면 마우스를 케이지로 되돌립니다. 마우스를 수핀 위치에 두고, 경골 앞쪽 볏을 시각적으로 그리고 부드러운 두근 두근 거림을 통해 찾습니다. 메스를 사용하여 경골

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

우리는 electroporation과 형광 현미경을 사용하여 단백질 표현의 후속 시각화를 사용하여 라이브 생쥐의 발 근육의 섬유에 플라스미드 DNA의 transfection 효율에 대한 자세한 절차를 설명합니다.

사용 포유류 골격 근육의 유전자 Transfection VIVO에서 Electroporation

이 비디오는 자궁 내 전기천공법을 사용하여 쥐 배아의 소뇌 신경 세포에 플라스미드 DNA를 전달하는 방법을 보여줍니다. 이 방법은 정상적인 뇌 발달에서 유전자의 생체 내 기능과 종양 진행 중 뉴런 세포의 유전자 발현 변화를 이해하는 데 유용합니다.

자궁 전기천공법 기반 유전자 전달: 쥐 배아의 배아 소뇌 세포에 플라스미드 DNA를 주입하는 기술

유도된 만능 줄기 세포 (iPSC)유래 한 근생 선조는 근 이영양증을 치료하는 세포 치료 전략에 대한 유망한 후보입니다. 이 프로토콜은 급성 및 만성 근육 재생의 마우스 모델에서 iPSC 유래 메소포아세포(근육 선조의 일종)의 이식 및 분화를 평가하는 데 필요한 이식 및 기능측정을 설명합니다.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

pial 표면은 증가 주목을 받고 CNS에서 독특한 전구 영역입니다. 여기서, 세부 사항보기 개질 전기 천공 법을 사용하여이 시조 존의 급격한 유전자 조작 방법을 우리. 이 절차는 세포 계통 및 세포 분화에 관련된 신호 전달 경로의 세포 및 분자 연구에 사용할 수 있습니다와 딸 세포의 운명과 특성을 설명하기 위하여.

신생아 Pial 표면 에레

고환 마우스 세포에 대한 형질 전환 기술은 정자의 고유 한 프로세스를 공부로이 문서에서는 생체 내에서 미세 주입 및 마우스 고환의 일렉트로에 대해 설명합니다. 제시된 프로토콜은 전기 천공 법 (electroporation)에 의해 유리 모세관 준비, 원심성 덕트를 통해 미세 주입하고, 형질 전환의 단계를 포함한다.

마우스 고환의 생체 내 미세 주입 및 Electroporation에에서

이 프로토콜은 전기천공법을 사용하여 마우스 근육 섬유에 형광 표지된 단백질을 도입하고 발현합니다. 전기천공법 후 회복 후 섬유가 분리됩니다. 그런 다음 고해상도 컨포칼 현미경을 사용하여 개별 섬유를 이미지화하여 근육 구조를 시각화합니다.

DNA 일렉트로, 근섬유의 분리 및 이미징

마우스 방광에서 vivo에서 요도 도관 법 및 electroporation 통해의 urothelial 세포로 DNA 플라스 미드의 배달에 대 한 새로운 방법을 설명합니다. 그것은 방광 질환의 학위 마우스 모델을 생성 하기 위한 신속 하 고 편리한 방법을 제공 합니다.

새로운 방식의 마우스 방광 Urothelium Electroporation에 의해 플라스 미드 DNA 전달

기능적 부위 지정 형광 측정법은 단백질 도메인 동작을 실시간으로 연구하는 방법입니다. 천연 세포에 적용하기 위해 이 기술을 수정하면 이제 쥐 격리 골격근 섬유의 전압 개폐 Ca2+ 채널에서 단일 전압 센서 동작을 감지하고 추적할 수 있습니다.

골격근 흥분성을 연구하기 위한 천연 세포의 기능적 부위 지정 형광 측정

여기에서는 두개골 거근 장뇨근(LAL)의 생체 내 전기천공법(in vivo electroporation)과 탈질법(denervation)을 결합한 프로토콜을 제시합니다. 이 절차를 통해 신경근 시냅스의 재생에서 근육 유래 단백질의 잠재적 역할을 연구할 수 있습니다.

In Vivo Electroporation과 Cranial Levator Auris Longus Skeletal Muscle의 단기 신경 재생이 결합되었습니다.

여기에서는 골내 주사를 통해 ABE로 코팅된 키토산을 골수에 직접 전달하는 유전자 치료 방법을 제시합니다.

키토산 나노입자 캡슐화된 아데닌 염기 편집기 플라스미드의 골내 주입을 사용한 유전자 전달 및 발현 향상

배우세요 마우스 골격근에서 전기천공을 이용한 플라스미드 DNA 전달 기법을. 이 방법은 근육 수축성을 손상시키지 않고 유전자 발현을 효율적으로 조절할 수 있어 근육 생리학 연구에 활용됩니다.

플라스미드 DNA를 마우스 골격근으로 전기천공

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