세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

제시된 미세 유체 장치를 사용하여 균류와 다른 미생물 간의 동적 상호 작용을 정확한 공간 및 환경 제어뿐만 아니라 단일 세포 수준에서 고해상도 이미징으로 검사 할 수 있습니다. 중요하게도, 진균 성장은 미세유체 채널 내에서 제한되고 지시될 수 있다. 고품질 시간 경과 이미지를 얻을 수 있습니다.

따라서 곰팡이 - 곰팡이 및 곰팡이 - 박테리아 상호 작용의 복잡성을 탐구 할 수 있습니다. 곰팡이 미생물 상호 작용을 이해하는 것은 토양 미생물을 정의하고 보존하는 데 필수적인 단계입니다. 이 지식은 지속 가능한 농업을 가진 새로운 생물 조절제의 개발을 위해 악용 될 수 있습니다.

시작하기 위해, 약 40 그램의 폴리(디메틸실록산) 또는 PDMs를 준비하고, 깨끗한 플라스틱 컵에 주걱을 사용하여 베이스와 경화제를 10 내지 1 비율로 완전히 혼합함으로써 준비한다. 모든 기포를 제거하려면 컵을 진공 챔버에 한 시간 동안 넣으십시오. 그런 다음 투명 테이프를 사용하여 마스터 몰드를 플라스틱 마운트에 고정하고 압축 여과 된 공기를 사용하여 먼지 입자를 제거한 다음 PDM을 마스터 몰드의 중앙에 부어 정착시킵니다.

PDM 표면에 먼지 입자가 침전되는 것을 방지하려면 마스터 몰드를 플라스틱 뚜껑으로 느슨하게 덮은 다음 마스터 몰드를 오븐으로 옮기고 섭씨 70도에서 밤새 경화하십시오. 오븐에서 마스터 몰드를 제거하고 냉각시킨 후, 경화된 PDM을 PDM의 마스터 몰드를 손상시키지 않으면서 마스터 몰드 및 플라스틱 프레임으로부터 떼어냅니다. 그런 다음 먼지가없는 표면을 유지하려면 PDM에 엠보싱 된 마이크로 채널 위에 투명 테이프를 놓습니다.

그런 다음 장착 단두대 또는 면도날을 사용하여 PDM을 설계에서 지정한 슬래브로 자릅니다. 박테리아-진균 상호작용 장치 또는 BFI 장치에 사용되는 PDMs 슬래브의 측면 개구부를 절단할 때 마이크로채널이 완전히 열려 있는지 확인하십시오. 그러나 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용 장치 또는 FFI의 조립에 사용되는 PDM 슬래브의 경우 각 모서리가 유리 바닥 페트리 접시에 맞도록 트리밍해야합니다.

그런 다음 정밀 커터를 사용하여 장치 설계에 따라 입구 또는 출구 구멍을 펀치합니다. 다음으로, PDMs 슬라브를 0.5몰 수산화나트륨 용액에 침지시킨다. 슬라브를 멸균 이중 증류수로 헹구고 70% 에탄올 용액으로 옮깁니다.

에탄올을 제거하고 다시 이중 증류수로 슬라브를 헹구고 슬래브를 멸균 이중 증류수에 침지하고 다섯 분 동안 초음파 처리 한 다음 PDMs 슬래브를 물에서 제거하고 압축 여과 된 공기로 건조시킨 다음 멸균 사각형 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, PDM 슬래브와 함께 페트리 접시를 섭씨 70도의 오븐에서 한 시간 동안 배양하십시오. 슬래브가 먼지가없는 환경에서 냉각되면 테이프와 압축 여과 된 공기를 사용하여 표면에서 먼지를 제거하십시오.

이후에 함께 접착될 PDM 슬래브와 유리 바닥 페트리 디쉬의 표면을 활성화하려면 활성화될 표면이 위쪽을 향하도록 플라즈마 클리너에 놓습니다. 플라즈마 클리너에서 페트리 접시의 PDMs 슬래브를 제거한 후, 활성화된 표면을 서로 등각 접촉시켜 부드럽게 결합시킨다. 본드 BFI와 FFI PDM은 성공적인 본딩을 확인하기 위해 각각 직경 35mm와 55mm의 페트리 접시로 슬래브를 묶어 PDM 실험실을 핀셋으로 페트리 접시에서 떼어내려고 합니다.

접종 입구 또는 마이크로 채널의 붕괴가 없도록 눈 또는 일반 현미경으로 장치를 신중하게 시각화하십시오. 물 포화 또는 영양소가 풍부한 조건의 경우, 원하는 용액 100 마이크로 리터를 피펫하여 접합 직후에 BFI 장치를 채 웁니다. FFI 장치의 경우 30마이크로리터의 미디어를 각 입구에 추가합니다.

마지막으로 100 ~ 200 마이크로 리터의 멸균 이중 증류수를 페트리 접시에 첨가하여 습도를 유지하십시오. 그러나 물 불포화 조건의 경우 습도를 유지하기 위해 페트리 접시에 멸균 이중 증류수 100 ~ 200 마이크로 리터를 첨가하십시오. 곰팡이 예방 접종을 위해, 멸균 된 코르크 보어를 사용하여 층류 후드 내부에서 사흘 된 문화의 주변에있는 식민지에서 한천 플러그를 제거하여 성장하는 하이팔 앞쪽을 그대로 유지하십시오.

그런 다음 한천 플러그를 BFI 및 / 또는 FFI 장치의 곰팡이 입구에 도입하여 마이크로채널 개구부를 향해 향하는 하이팔 앞쪽의 균사체 측면을 아래로 향하게하여 채널의 최면 침투를 촉진하십시오. FFI 장치의 경우, 두 번째 곰팡이 종이있는 또 다른 한천 플러그를 반대쪽 입구에 도입하십시오. 다음으로, 페트리 접시를 투명 필름으로 밀봉하고 이미징 될 때까지 어둠 속에서 섭씨 25 ~ 28도에서 배양하십시오.

박테리아 접종을 위해, 배양기로부터 BFI 장치를 제거한 후, 멸균 환경에서 박테리아 입구 내로 박테리아 현탁액 10 마이크로리터를 피펫한다. 페트리 접시가 투명 필름으로 밀봉되면 이미징이 시작될 때까지 어둠 속에서 섭씨 25도에서 장치를 똑바로 보관하십시오. 이 프로토콜을 사용하여 곰팡이 Coprinopsis cinerea와 박테리아 Bacillus subtilis 사이의 상호 작용을 성공적으로 시각화 할 수 있습니다.

박테리아가있는 상태에서 곰팡이의 성장 속도는 약 다섯 시간의 동전 접종 후 크게 감소하기 시작했다는 것이 관찰되었습니다. 더욱이, 박테리아와 관련된 곰팡이 균사는 얇고 투명한 외관을 가졌다. 시간 경과 형광 현미경 검사는 또한 바실러스 서브틸리스와 함께 다섯 시간의 상화 접종 후 곰팡이 균사 붕괴를 밝혀냈다.

그러나 여섯 시간 이후부터는 박테리아 개체수도 감소하기 시작했다. 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용의 시각화는 Fusarium graminearum이 Trichoderma rossicum의 성장을 강하게 억제한다는 것을 보여 주었고, 이는 형광 현미경을 사용하여 분명했습니다. 이 프로토콜은 박테리아 Pseudomonas synxantha 및 Pseudomonas fluorescens의 존재하에 곰팡이 Verticillium longisporum의 중요한 형태 학적 변화를 추가로 밝혀 냈습니다.

연구에 사용 된 고해상도 동적 이미징 기술은 또한 곰팡이 Clonostachys rosea의 존재하에 Fusarium graminearum에서 septa 형성을 밝혀 냈습니다. 형광 표지는 FFI 장치에서 클로노스타키즈 로사 최면 증식의 동적 정량화를 제공하였다. 이러한 장치는 사용자가 관심있는 다른 종을 통합하고 곰팡이 미생물 상호 작용에 관한 특정 실험 질문을 해결하기 위해 적응 및 변형 될 수 있습니다.

BFI와 FFI 장치는 모두 곰팡이, 바이러스, 선충류의 공격시 곰팡이가 방어 신호와 영양소를 전파하고 박테리아 분산에 대한 조사를 가능하게하는 방법을 밝혀 과학적 경계를 넓혔습니다.