Name: 세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: 배우세요 미세유체 장치를 활용한 세포 수준 곰팡이-미생물 상호작용 연구 방법입니다. 고해상도 시차영상으로 토양 미생물군집의 동적 생태를 탐색하고 지속가능한 농업을 위한 생물방제제 개발에 활용하세요.

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우리는 임페리얼 칼리지 런던의 생명 공학과와 Leverhulme Trust (연구 보조금 참조 : RPG-2020-352)의 재정 지원을 인정합니다.

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

이 기사는 채널 미세 유체학을 사용하는 곰팡이 - 미생물 상호 작용의 연구를위한 프로토콜을 제시합니다. 저자는 이러한 장치의 다양성을 입증하고 연구자의 이익에 맞게 적응을 장려하는 것을 목표로합니다. 예시적인 BFI 및 FFI 장치를 사용하여, 진균-미생물 상호작용은 이전에 접근가능한 것보다 더 상세하게 연구될 수 있다. 토양의 배경 복잡성과 이질성을 제거하고, 균사의 성장을 단일 단층으로 제한하고, 환경 매개 변수를 엄격하게 조절함으로써, 시간이 지남에 따라 이러한 생물학적 사건의 고해상도 이미지를 캡처 할 수 있습니다. 이러한 장치를 사용하여, 미생물 파트너 간의 상호작용은 성장 속도, 형광 정량화 및 형태학적 형질의 관찰 생물이미징을 사용하여 특성화되었다.
장치는 세포 수준에서 진균-미생물 상호작용의 특성화를 가능하게 하도록 설계될 수 있다. 비 전문가를위한 다양성과 디자인의 용이성은이 프로토콜을 광범위한 연구 질문에 적응시키는 데 적합합니다. BFI 및 FFI 장치는 투명...

토양은 탄소와 인 순환 1,2에 도움이되는 풍부한 미생물을 포함하는 매우 다양한 환경입니다. 필라멘트 균류는 유기 및 무기 물질의 분해제로서 수많은 생태계의 주요 구성 요소이며 공생 관계형성 3,4을 통해 식물의 영양을 향상시킬 수 있습니다. 토양 내에서 곰팡이는 다른 곰팡이5, 박테리아6, 바이러스7 및 선충류8과 같은 수많은 미생물과 동적으로 상호 작용합니다. 이러한 상호 작용은 토양과 식물 건강에 중요한 영향을 미칩니다. 그러나 고해상도로 상호 작용하는 미생물을 이미징 할 수있는 적절한 실험 시스템이 없기 때문에 많은 사람들이 정의되지 않은 채로 남아 있습니다.
박테리아 - 곰팡이 상호 작용 (BFI) 및 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용 (FFIs)에 관한 조사는 의학의 항균제 및 농업의 생물학적 조절제를 포함하여 다양한 분야에서 가치있는 응용 프로그램을 가지고 있습니다. 예를 들어, 곰팡이 코프리놉시스 시네레아는 펩티드 콥신을 생산하며, 이는 인간 병원체 리스테리아 모노사이토게네스9에 대해 항균 활성을 나타내는 것으로 나타났다. 유사하게, 진균 유래 화합물인 그리세오풀빈은 인간 진균 감염에 대한 치료제로서 널리 이용되며, 추가적으로 식물 병원성 진균인 알터나리아 솔라니10,11의 성장을 억제할 수 있다. 토양 거주 박테리아 바실러스 서브틸리스의 몇몇 균주는 또한 진균 식물 병원균인 리조토니아 솔라니12,13의 효과적인 생물조절제인 것으로 입증되었다. 그럼에도 불구하고 전통적인 방법론과 관련된 한계로 인해 BFI 및 FFI는 단일 셀 수준에서 제대로 이해되지 않습니다.
전통적인 연구는 일반적으로 두 종 이상의 종과 대결하는 한천 플레이트를 사용하여 매크로 스케일에서 BFI와 FFI를 탐구합니다. 이들의 상호작용은 대립하는 종14,15,16의 성장 속도와 대사산물 생산을 측정함으로써 평가된다; 그러나이 방법론은 식민지 수준에서만 해결됩니다. 세포 수준에서의 상호작용을 연구하기 위해, 박테리아 및 진균 접종제는 한천으로 코팅된 유리 현미경 슬라이드에서 배양될 수 있고, 그 후 현미경(17)으로 이미지화된다. 그럼에도 불구하고 감금이 부족하기 때문에 현미경 슬라이드를 사용하여 단일 hypha를 따르는 것이 어려울 수 있으며, 이는 타임랩스 이미지를 얻기가 더 어렵다는 것을 의미합니다. 또한, 진균 균사체의 정의된 영역 내에 다른 미생물을 공간적으로 가두거나 교란될 수 있는 정의된 화학적 환경을 만들 수 있는 기회는, 예를 들어, 이러한 셋업에서 가능하지 않다. 토양의 "블랙 박스"특성은 또한 단일 세포(18)의 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 연구하는 복잡성을 추가합니다. 토양 미생물의 놀라운 다양성에서 벗어나 상호 작용하는 종을 관찰함으로써 개별 구성원이 상호 작용하는 정확한 방식을 평가할 수 있습니다. 따라서 BFI 및 FFI의 고해상도, 단일 셀 이미징을 가능하게 하는 다목적 플랫폼에 대한 지속적인 요구가 존재한다.
마이크로유체 기술, 소위 랩온어칩 시스템(lab-on-a-chip systems)은 단일 세포 수준에서 BFI 및 FFI 연구를 위한 이상적인 플랫폼을 제공합니다. 화학 분석 및 마이크로 일렉트로닉스를 위해 개발 된 기술에서 유래 한 미세 유체 공학 분야는 생물 과학19에 의해 채택되었습니다. 마이크로유체 기술은 마이크로미터 규모에서 적어도 하나의 차원을 갖는 소형화된 채널의 맞춤형 네트워크 내에서 소량의 유체를 조절하며, 생물학적 연구에서의 사용은 확대되고 있다20. 특히, 사상균21,22,23,24,25,26,27,28,29,30의 성장을 조사하기 위해 미세유체 장치가 개발되었다. 이 기술을 사용하는 한 가지 이점은 균사의 감금과 마이크로 채널 내의 영양소 분포가 기존의 한천 방법(31)보다 토양 환경의 구조와 더 밀접하게 유사하다는 것입니다. 최근에, 미세유체 플랫폼이 인간 호중구와 진균 병원체(32), 박테리아 및 식물 뿌리(33), 진균 및 선충류(34,35) 사이의 상호작용을 조사하기 위해 이용되고 있다.
미생물 상호작용을 연구하기 위해 마이크로유체학을 사용하는 많은 이점 중 하나는 마이크로채널 환경의 특이적 조절을 포함한다. 예를 들어, 층류 정권은 정의된 농도 구배를 생성하기 위해 이용될 수 있으며, 이는 박테리아 화학주성(36)을 검사할 때 특히 유용하다. 또 다른 장점은 미세 유체 장치의 제조에 일반적으로 사용되는 저렴하고 생체 적합성 엘라스토머 폴리머 인 폴리 (디메틸 실록산) (PDMS)의 투명한 특성이 밝은 필드 및 형광 현미경(37)을 사용하여 단일 세포의 고해상도 이미징을 용이하게한다는 것입니다. 마찬가지로, 마이크로채널 내의 미생물의 감금은 단일 세포를 추적하는 타임랩스 실험이 수행될 수 있다는 것을 의미하며, 개별 세포 반응이 기록되고 정량화될 수 있게 한다(37). 마지막으로, 미세유체 장치가 사용자 친화적으로 설계될 수 있기 때문에, 이들은 비전문가(38)에 의해 용이하게 이용될 수 있다.
토양-거주 미생물 사이의 상호작용에 대한 지식을 증진시키는 것은 생물 다양성을 유지하는 지속 가능한 생태계 관리 관행을 개선하고 기후 변화가 육상 환경에 미치는 영향을 완화하는 데 중요하다39. 따라서, 새로운 미세유체 도구의 개발은 세포 수준에서 곰팡이와 그들의 상호 작용에 대한 이해를 넓히는 데 필수적입니다. 여기서 프로토콜은 그림 1에 표시된 바와 같이 BFIs(40) 및 FFIs(41)의 연구를 위해 생산된 두 개의 미세유체 장치에 초점을 맞출 것이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63917/63917fig01.jpg"> 그림 1: 박테리아-진균 상호작용(BFI) 및 곰팡이-진균 상호작용(FFI) 장치의 시각적 및 개략적 표현. (A) BFI 장치의 이미지. 균사 플러그는 마이크로 채널의 한쪽 끝 입구에 배치되어 장치로 하이팔 성장을 허용합니다. 박테리아 입구는 반대쪽 끝에 있습니다. 스케일 바 = 5 mm. (B) 상호작용 마이크로채널을 통한 박테리아 입구의 위치 및 최면 성장의 방향을 묘사하는 BFI 장치의 개략적인 개요. 채널은 깊이 10μm, 너비 100μm, 길이 7mm이며 총 28개의 관측 채널이 있습니다. (c) Coprinopsis cinerea와 Bacillus subtilis NCIB 3610 사이의 한천 플레이트에서의 대결 분석, 스케일 바 = 20 mm (왼쪽). C. cinerea와 B. subtilis NCIB 3610 내 마이크로채널(중간 및 오른쪽) 사이의 상호작용, 즉 진균균 균사에 대한 박테리아의 극성 부착을 보여주는 현미경 이미지. 스케일 바 = 25 μm (중간) 및 10 μm (오른쪽). (d) 균사체 플러그로 이중 접종된 유리 바닥 페트리 접시에 결합된 FFI 장치의 이미지. 스케일 바 = 1cm. (E) FFI 장치의 개략적인 개요. 두 개의 곰팡이 접종제 플러그가 장치의 양쪽 끝에있는 입구에 도입되어 마이크로 채널의 최면 탐사가 가능합니다. 제어 채널은 하나의 진균 유입구에만 연결되며 막 다른 채널을 가지고있어 테스트 진균 간의 상호 작용을 방지합니다. 상호작용 채널은 진균 유입구를 연결하고 마이크로채널 내의 피험자 사이의 최면 상호작용을 허용한다. 각 인터랙션 채널은 18개의 다이아몬드 모양의 섹션으로 구성되며, 총 길이는 8.8mm(다이아몬드당 490 x 430μm), 깊이는 10μm, 각 다이아몬드 사이에는 20μm의 연결 영역을 가집니다. 채널 유형은 중복되고, 스케일 막대 = 1mm입니다. (F) 상호 연결된 상호 작용 채널의 반대쪽 끝에서 자라는 두 개의 접근하는 하이팔 전선 사이의 상호 작용 영역입니다. 위상차 현미경 이미지, 스케일 바 = 250 μm. 이 도면의 패널은 Stanley et al., 2014 (A-C)40 및 Gimeno et al., 2021 (D-F)41에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63917/63917fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td>페트리 접시 내 박테리아 및 곰팡이 배양을 위한 배양 배지를 응고시키는 데 사용</td></tr><tr><td>알루미늄 호일</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11759408</td><td></td></tr><tr><td>AutoCAD 2021</td><td>Autodesk, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>오토클레이브(VX-75)</td><td>Systec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>원심분리기(5810R)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>클로로트리메티실란</td><td>Merck Life Sciences</td><td>386529</td><td>주의: 클로로트리메틸실란은 유해 물질입니다. 적절한 PPE를 착용하고 조심스럽게 다루십시오. 피부와 눈과의 접촉을 피하고 흡입을 하지 마십시오. 발화원에서 멀리 유지하고 환기가 잘 되는 곳에서 사용하십시오.</td></tr><tr><td>코르크 보어</td><td>SLS</td><td>COR1000</td><td></td></tr><tr><td>개발자 솔루션 (mr-Dev 600)</td><td>Microresist Technologies</td><td></td><td>주의: mr-Dev 600 개발자 솔루션은 가연성</td></tr><tr><td>Erlenmeyer 플라스크</td><td>VWR</td><td>214-1108</td><td>예: 200 mL; 정확한 필요에 맞는 크기를 선택하십시오</td></tr><tr><td>에탄올 (70% v/v)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>E/0650DF/15</td><td>99.8%에서 희석(분석 시약 등급)</td></tr><tr><td>Fiji</td><td>ImageJ</td><td></td><td>이미징 처리를 위한 예시 소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>여과된 압축 공기</td><td></td><td></td><td>대부분의 실험실에서 표준으로 사용할 수 있습니다. 또는 공기 조절기가 있는 무급유식 압축기를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>편평한 웨이퍼 핀셋</td><td>SLS</td><td>INS5026</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10008051</td><td>구부러지고 날카로운</td></tr><tr><td>유리 바닥 페트리 접시</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>35 mm</td></tr><tr><td>유리 바닥 페트리 접시</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD5040-100</td><td>50 mm</td></tr><tr><td>유리 결정화 접시</td><td>VWR</td><td>216-1865</td><td>중고 PDMS 슬래브 세척용</td></tr><tr><td>유리 결정화 접시</td><td>VWR</td><td>216-1866</td><td>마스터 몰드</td></tr><tr><td>유리 매체 병</td><td>개발에 사용 Fisher Scientific Ltd</td><td>15456113</td><td>예: 250mL; 정확한 요구에 맞는 크기를 선택하십시오</td></tr>. <tr><td>유리 주사기(Hamilton)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10625251</td><td>클로로트리메틸실란</td></tr><tr><td>핫 플레이트(HP 160 III BM)</td> <td>분배에 사용됩니다.SAWATEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>접종 루프</td><td>VWR</td><td>COPA175CS01</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>시그마-알드리치</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>층류 후드</td><td>Air Science (PCR)</td><td></td><td>장치 제조에 사용되는 예시적인 층류 후드</td></tr><tr><td>LB 매체</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP9723-500</td><td>박테리아 하룻밤 배양을</td></tr> <tr><td>위한 예시적인 영양 육수발광 다이오드 광 엔진(LedHUB)</td><td>Omicron-Laserage Laserprodukte GmbH</td><td></td><td>곰팡이-미생물 상호작용(형광) 이미징에 사용할 수 있는 모범 광원</td></tr><tr><td>MA6 자외선 마스크 얼라인너</td><td>Suss Microtec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>맥아 추출물</td><td>VWR</td><td>84618</td><td>모범 진균 배양 배지 제작에 사용 (맥아 추출물 한천)</td></tr><tr><td>마스크 라이터</td><td>응용 재료</td><td>4700DP</td><td>포토리소그래피용 포토 마스크를 인쇄하는 데 사용할 수 있는 마스크 라이터의 예</td></tr><tr><td>: 마스터 몰드 플라스틱 마운트</td><td></td><td></td>, <td>3D 프린팅 맞춤형 홀더, 사내에서 제조된</td></tr><tr><td>미생물 안전 캐비닛&nbsp; (바이오매트2)</td><td>Contained Air Solutions</td><td></td><td>미생물 배양 및 장치 접종에 사용되는 예시 MSC</td></tr><tr><td>Milli-Q 정제수</td><td></td><td></td><td>생물학 실험실에서 표준으로 사용 가능&nbsp;</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>BP359-500</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements Advanced Research 이미징 소프트웨어</td> 이미지 획득을 위한 <td>Nikon</td><td></td><td>Exemplar 소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>NIS-Elements Free Viewer</td> 획득한 이미지를 보기 위한 <td>Nikon</td><td></td><td>Exemplar 소프트웨어 패키지</td></tr><tr><td>오븐(바인더 BD115)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15602126</td><td>폴리(디메틸실록산) 경화에 사용)(PDMS)</td></tr><tr><td>오븐 (CLO-2AH-S)</td><td>KOYO</td><td></td> 실리콘 <td>웨이퍼</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>HS234526B</td><td>투명 필름</td></tr><tr><td>페트리 접시, 사각형 멸균</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>11708573</td><td>120.5 mm</td></tr><tr><td>페트리 접시, 멸균</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15370366</td><td>90 mm&nbsp;</td></tr><tr><td>포토리소그래피 마스크</td><td>Micro Lithography Services Ltd. 영국</td><td></td><td></td></tr><tr><td>플라즈마 세정제(Zepto)</td><td>Diener Electronic</td><td>100012601</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 컵</td><td>Semadeni</td><td>8323</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 주걱</td><td>Semadeni</td><td>3340</td><td></td></tr><tr><td>휴대용 정밀 저울(OHAUS Scout)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>15519631</td><td>PDMS, 미디어 계량에 사용 분대 등.</td></tr><tr><td>정밀 절단기</td><td>Syneo</td><td>HS1251135P1183</td><td>절단 가장자리 직경: 3.18 mm</td></tr><tr><td>정밀 절단기&nbsp;</td><td>Syneo</td><td>HS1871730P1183S</td><td>커팅 엣지 직경: 4.75 mm</td></tr><tr><td>프로파일로미터&nbsp;</td><td>Bruker</td><td></td><td>Dektak XT-스타일러스</td></tr><tr><td>면도날</td><td>H&auml; berle Labortechnik</td><td>9156110</td><td></td></tr><tr><td>냉장고</td><td>Haden</td><td></td><td>4-6 &deg; C</td></tr><tr><td>Retiga R1 CCD 카메라</td><td>Qimaging</td><td></td><td>곰팡이-미생물 상호 작용 이미징에 사용할 수 있는 모범 카메라</td></tr><tr><td>스카치 매직 테이프</td><td>Office Depot</td><td>3969954</td><td>19mm 보이지 않는 테이프; 투명 테이프</td></tr><tr><td>쉐이킹 인큐베이터(Cole-Parmer SI500)</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10257954</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 웨이퍼</td><td>Inseto</td><td></td><td>100mm</td></tr><tr><td>소다 석회 유리 </td><td>플레이트 Inseto</td><td></td><td>125 mm x 125 mm x 2 mm. 마스크 정렬기에서 포토리소그래피 마스크를 고정하는 데 사용됩니다</td></tr><tr><td>. 염화나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>스핀코터&nbsp;</td><td>SAWATEC</td><td>SM-180-BM</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2010 포토레지스트</td><td>MicroChem</td><td></td><td>주의: SU-8 포토레지스트는 위험하므로 취급 시 주의하고 흡입 및 피부 접촉을 방지하십시오. 가연성, 잠재적으로 발암성 및 환경에 독성이 있습니다.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sylgard 184 엘라스토머 키트</td><td>VWR</td><td>634165S</td><td>폴리(디메틸실록산)(PDMS) 장치 준비에 사용</td></tr><tr><td>온도 조절 인큐베이터</td><td>Okolab</td><td></td><td>곰팡이-미생물 상호 작용 이미징에 사용할 수 있는 예시 인큐베이터</td></tr><tr><td>Ti2-E 반전 에피형광 현미경</td><td>Nikon</td><td>MEA54000</td><td>곰팡이-미생물 상호 작용 이미징에 사용할 수 있는 예시 현미경</td></tr><tr><td>초음파 세척기 S-Line</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>FB15050</td><td></td></tr><tr><td>진공 탈착기</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10528861</td><td>실리아화 및 PDMS 탈기는 별도의 탈데케이터에서 수행해야 함</td></tr><tr><td>x10/0.3 NA CFI Plan Fluor DL 대물 렌즈</td><td>Nikon</td><td>MRH20105</td><td>진균-미생물 상호 작용 이미징에 사용할 수 있는 예시 대물 렌즈</td></tr><tr><td>x20/0.45 NA CFI Plan Fluor DL 대물 렌즈</td><td>Nikon</td><td>MRH48230</td><td>곰팡이-미생물 상호 작용 이미징에 사용할 수 있는 모범적인 대물 렌즈</td></tr></tbody></table>

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

Microfluidic Tools for Probing Fungal-Microbial Interactions at the Cellular Level

필라멘트 균류는 토양의 성공적인 거주자이며 유기 및 무기 물질의 분해뿐만 아니라 영양소 수준의 조절과 같은 토양 생태계에서 중요한 역할을합니다. 거기에서 그들은 또한 박테리아 나 다른 곰팡이와 같은 다양한 다른 미생물과 상호 작용할 수있는 수많은 기회를 발견합니다. 그러나 세포 수준에서 곰팡이 상호 작용을 연구하는 것은 토양의 블랙 박스와 같은 특성 때문에 어려울 수 있습니다. 곰팡이 상호 작용의 연구를 위해 새로운 미세 유체 도구가 개발되고 있습니다. 박테리아 - 곰팡이 및 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용을 연구하기 위해 고안된 두 가지 플랫폼이 강조됩니다. 이러한 마이크로채널 내에서, 진균-미생물 상호작용은 이전에 가능했던 것보다 더 높은 시간적 및 공간적 분해능으로 제어된 물리-화학적 환경에서 모니터링될 수 있다. 이러한 도구의 적용은 균사에 대한 박테리아 극성 부착의 관찰 또는 특징이없는 곰팡이 - 곰팡이 적대감을 드러내는 것과 같은 수많은 새로운 생물학적 통찰력을 산출했습니다. 이러한 방법론의 주요 특징은 비 전문가가이 도구의 사용 편의성과 관련하여 미생물학 실험실에서 사용할 수있는 번역 가능성이 높은 기술을 제공합니다.

대표적인 결과는 예시 BFI40 및 FFI41 디바이스로부터 제시된다. 히팔 성장률 측정은 기본적인 현미경 기술과 함께 이러한 장치를 사용하여 쉽게 얻을 수 있습니다. 도 3A-B는 C. cinerea hyphae와 B. subtilis NCIB 3610 사이의 박테리아-진균 상호작용을 도시한다. B. subtilis의 존재는 공동 접종 후 약 5 시간 후에 C. cinerea의 성장을 정지시킨다 (도 3B). 화살표는 더 얇고 투명한 균사의 동시 형태학적 관찰을 나타낸다(도 3A). 또한 영향을받지 않은 최면 세포가 계속 증식한다는 점도 주목되었습니다. <str...

토양의 불투명도로 인해 구성 미생물 간의 상호 작용은 세포 분해능으로 쉽게 시각화 될 수 없습니다. 여기에서는 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 새로운 기회를 제공하는 두 가지 미세 유체 도구가 제시됩니다. 이 장치는 다재다능하고 사용하기 쉬우므로 세포 수준에서 높은 시공간 제어 및 고해상도 이미징이 가능합니다.

Filamentous fungi are successful inhabitants of soil and play a major role in soil ecosystems, such as in the decomposition of organic and inorganic ...

제시된 미세 유체 장치를 사용하여 균류와 다른 미생물 간의 동적 상호 작용을 정확한 공간 및 환경 제어뿐만 아니라 단일 세포 수준에서 고해상도 이미징으로 검사 할 수 있습니다. 중요하게도, 진균 성장은 미세유체 채널 내에서 제한되고 지시될 수 있다. 고품질 시간 경과 이미지를 얻을 수 있습니다.따라서 곰팡이 - 곰팡이 및 곰팡이 - 박테리아 상호 작용의 복잡성을 탐구 할 수 있습니다. 곰팡이 미생물 상호 작용을 이해하는 것은 토양 미생물을 정의하고 보존하는 데 필수적인 단계입니다. 이 지식은 지속 가능한 농업을 가진 새로운 생물 조절제의 개발을 위해 악용 될 수 있습니다.시작하기 위해, 약 40 그램의 폴리(디메틸실록산) 또는 PDMs를 준비하고, 깨끗한 플라스틱 컵에 주걱을 사용하여 베이스와 경화제를 10 내지 1 비율로 완전히 혼합함으로써 준비한다. 모든 기포를 제거하려면 컵을 진공 챔버에 한 시간 동안 넣으십시오. 그런 다음 투명 테이프를 사용하여 마스터 몰드를 플라스틱 마운트에 고정하고 압축 여과 된 공기를 사용하여 먼지 입자를 제거한 다음 PDM을 마스터 몰드의 중앙에 부어 정착시킵니다.PDM 표면에 먼지 입자가 침전되는 것을 방지하려면 마스터 몰드를 플라스틱 뚜껑으로 느슨하게 덮은 다음 마스터 몰드를 오븐으로 옮기고 섭씨 70도에서 밤새 경화하십시오. 오븐에서 마스터 몰드를 제거하고 냉각시킨 후, 경화된 PDM을 PDM의 마스터 몰드를 손상시키지 않으면서 마스터 몰드 및 플라스틱 프레임으로부터 떼어냅니다. 그런 다음 먼지가없는 표면을 유지하려면 PDM에 엠보싱 된 마이크로 채널 위에 투명 테이프를 놓습니다.그런 다음 장착 단두대 또는 면도날을 사용하여 PDM을 설계에서 지정한 슬래브로 자릅니다. 박테리아-진균 상호작용 장치 또는 BFI 장치에 사용되는 PDMs 슬래브의 측면 개구부를 절단할 때 마이크로채널이 완전히 열려 있는지 확인하십시오. 그러나 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용 장치 또는 FFI의 조립에 사용되는 PDM 슬래브의 경우 각 모서리가 유리 바닥 페트리 접시에 맞도록 트리밍해야합니다.그런 다음 정밀 커터를 사용하여 장치 설계에 따라 입구 또는 출구 구멍을 펀치합니다. 다음으로, PDMs 슬라브를 0.5몰 수산화나트륨 용액에 침지시킨다. 슬라브를 멸균 이중 증류수로 헹구고 70% 에탄올 용액으로 옮깁니다.에탄올을 제거하고 다시 이중 증류수로 슬라브를 헹구고 슬래브를 멸균 이중 증류수에 침지하고 다섯 분 동안 초음파 처리 한 다음 PDMs 슬래브를 물에서 제거하고 압축 여과 된 공기로 건조시킨 다음 멸균 사각형 페트리 접시에 넣습니다. 다음으로, PDM 슬래브와 함께 페트리 접시를 섭씨 70도의 오븐에서 한 시간 동안 배양하십시오. 슬래브가 먼지가없는 환경에서 냉각되면 테이프와 압축 여과 된 공기를 사용하여 표면에서 먼지를 제거하십시오.이후에 함께 접착될 PDM 슬래브와 유리 바닥 페트리 디쉬의 표면을 활성화하려면 활성화될 표면이 위쪽을 향하도록 플라즈마 클리너에 놓습니다. 플라즈마 클리너에서 페트리 접시의 PDMs 슬래브를 제거한 후, 활성화된 표면을 서로 등각 접촉시켜 부드럽게 결합시킨다. 본드 BFI와 FFI PDM은 성공적인 본딩을 확인하기 위해 각각 직경 35mm와 55mm의 페트리 접시로 슬래브를 묶어 PDM 실험실을 핀셋으로 페트리 접시에서 떼어내려고 합니다.접종 입구 또는 마이크로 채널의 붕괴가 없도록 눈 또는 일반 현미경으로 장치를 신중하게 시각화하십시오. 물 포화 또는 영양소가 풍부한 조건의 경우, 원하는 용액 100 마이크로 리터를 피펫하여 접합 직후에 BFI 장치를 채 웁니다. FFI 장치의 경우 30마이크로리터의 미디어를 각 입구에 추가합니다.마지막으로 100 ~ 200 마이크로 리터의 멸균 이중 증류수를 페트리 접시에 첨가하여 습도를 유지하십시오. 그러나 물 불포화 조건의 경우 습도를 유지하기 위해 페트리 접시에 멸균 이중 증류수 100 ~ 200 마이크로 리터를 첨가하십시오. 곰팡이 예방 접종을 위해, 멸균 된 코르크 보어를 사용하여 층류 후드 내부에서 사흘 된 문화의 주변에있는 식민지에서 한천 플러그를 제거하여 성장하는 하이팔 앞쪽을 그대로 유지하십시오.그런 다음 한천 플러그를 BFI 및 / 또는 FFI 장치의 곰팡이 입구에 도입하여 마이크로채널 개구부를 향해 향하는 하이팔 앞쪽의 균사체 측면을 아래로 향하게하여 채널의 최면 침투를 촉진하십시오. FFI 장치의 경우, 두 번째 곰팡이 종이있는 또 다른 한천 플러그를 반대쪽 입구에 도입하십시오. 다음으로, 페트리 접시를 투명 필름으로 밀봉하고 이미징 될 때까지 어둠 속에서 섭씨 25 ~ 28도에서 배양하십시오.박테리아 접종을 위해, 배양기로부터 BFI 장치를 제거한 후, 멸균 환경에서 박테리아 입구 내로 박테리아 현탁액 10 마이크로리터를 피펫한다. 페트리 접시가 투명 필름으로 밀봉되면 이미징이 시작될 때까지 어둠 속에서 섭씨 25도에서 장치를 똑바로 보관하십시오. 이 프로토콜을 사용하여 곰팡이 Coprinopsis cinerea와 박테리아 Bacillus subtilis 사이의 상호 작용을 성공적으로 시각화 할 수 있습니다.박테리아가있는 상태에서 곰팡이의 성장 속도는 약 다섯 시간의 동전 접종 후 크게 감소하기 시작했다는 것이 관찰되었습니다. 더욱이, 박테리아와 관련된 곰팡이 균사는 얇고 투명한 외관을 가졌다. 시간 경과 형광 현미경 검사는 또한 바실러스 서브틸리스와 함께 다섯 시간의 상화 접종 후 곰팡이 균사 붕괴를 밝혀냈다.그러나 여섯 시간 이후부터는 박테리아 개체수도 감소하기 시작했다. 곰팡이 - 곰팡이 상호 작용의 시각화는 Fusarium graminearum이 Trichoderma rossicum의 성장을 강하게 억제한다는 것을 보여 주었고, 이는 형광 현미경을 사용하여 분명했습니다. 이 프로토콜은 박테리아 Pseudomonas synxantha 및 Pseudomonas fluorescens의 존재하에 곰팡이 Verticillium longisporum의 중요한 형태 학적 변화를 추가로 밝혀 냈습니다.연구에 사용 된 고해상도 동적 이미징 기술은 또한 곰팡이 Clonostachys rosea의 존재하에 Fusarium graminearum에서 septa 형성을 밝혀 냈습니다. 형광 표지는 FFI 장치에서 클로노스타키즈 로사 최면 증식의 동적 정량화를 제공하였다. 이러한 장치는 사용자가 관심있는 다른 종을 통합하고 곰팡이 미생물 상호 작용에 관한 특정 실험 질문을 해결하기 위해 적응 및 변형 될 수 있습니다.BFI와 FFI 장치는 모두 곰팡이, 바이러스, 선충류의 공격시 곰팡이가 방어 신호와 영양소를 전파하고 박테리아 분산에 대한 조사를 가능하게하는 방법을 밝혀 과학적 경계를 넓혔습니다.

microfluidic-tools-for-probing-fungal-microbial-interactions-at

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

Microfluidic 장치는 실시간으로 적절한 물리적인 비늘에서 복잡한 자연의 프로세스를 시각화하는 데 사용할 수 있습니다. 우리는 표면 하의에 박테리아의 성장과 교통 수단을 공부하고 자연 다공성 매체의 주요 기능을 모방한 것이었 간단한 microfluidic 장치를 개발했습니다.

다공성 매체에서 미생물 교통 유학에 대한 간단한 Microfluidic 시스템 : 미생물의 창

우리는 클린 룸이나 부드러운 리소그래피 필요없이 여러 독특한 변종에 유사한 동적 조건을 적용 할 수있는 마이크로 유체 장치를 생산하는 간단한 방법을 제시한다.

여러 고유 긴장 유학을위한 마이크로 유체 장치

출처: 미켈 게녹, C. 외. 공초점 및 전자현미경을 이용한 섬유성 곰팡이 군락의 박테리아 바이오필름 정성적 다척도 분석에 관한 새로운 방법. J. Vis. 경험 (2017)이 영상은 콜로판 형성과 방사형 성장을 지원하기 위해 처리된 셀로판 막 위에 곰팡이 배양물을 준비하는 과정을 보여줍니다. 그 후 상호작용 분석에 대한 토양 박테리아 세포의 배양 및 준비 과정을 보여줍니다. 마지막으로, 박테리아 세포가 곰팡이 집락에 어떻게 부착하여 바이오필름을 형성하는지를 보여주어 박테리아-곰팡이 간 상호작용 연구를 가능하게 합니다.

바이오필름 형성을 위한 곰팡이-박테리아 공동 배양 확립

이 프로토콜에서는 원핵 생물의 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 생물반응기(PLBR)의 제작, 설정 및 기본 작동이 소개됩니다. 산업적으로 관련된 미생물을 원리 증명으로 분석하여 기존 방법으로는 거의 불가능했던 특정 기간 동안의 성장 속도, 형태 및 표현형 이질성에 대한 통찰력을 얻을 수 있었습니다.

미생물 단일 세포 분석을 위한 미세유체 피콜리터 바이오리액터: 제작, 시스템 설정 및 작동

이 문서에서 우리는 단일 세포 분석을위한 마이크로 유체 칩을 제시한다. 그것은 수있는 세포 내 단백질, 효소, 조효소, 형광 분석이나 면역에 의해 두 번째 메신저의 정량화.

단일 세포의 다목적 화학 분석을위한 미세 유체 칩

이 프로토콜은 성장과 질적으로 공 초점 및 전자 현미경으로 곰팡이 균사에 세균 바이오 필름을 분석하는 새로운 방법을 설명합니다.

새로운 방법 사상 진균 식민지에 세균 바이오 필름의 질적 다중 스케일 분석을 위해 사용 공 촛점 및 전자 현미경

식물 defensins 병원 균에 대 한 식물 방어에 중요 한 역할을 재생. 대 한 항진균 요원, 액션 (MOA)의 그들의 모드를 이해로 이러한 항진균 펩 티 드의 효과적인 사용이 중요 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 방법 공부 이러한 펩 티이 드의 MOA의 중요 한 측면을 설명 합니다.

조사 항목의 모드와 항진균 공장 Defensins의 Subcellular 지 방화 하는 곰 팡이 세포의 라이브 셀 이미징

우리는 예를 들어 새 균의 subtilis 를 사용 하 여 개별 세균성 세포 계보의 미세 분석 하는 방법을 제시. 메서드를 긴밀 하 게 제어 하 고 균일 한 성장 조건 셀 세대의 수백의 관찰 함으로써 미생물학에 전통적인 분석 방법의 단점을 극복 했다.

새 균의 subtilis 의 단일 셀 미세 분석

중요한 형광 염료는 현대 곰팡이 세포 생물학에 있는 살아있는 세포 화상 진찰 분석을 위한 필수적인 공구입니다. 이 논문은 필라멘트 균류에서 플라즈마 막 역학, 내분비 / 외신 세포증 및 세포 벽 형태 형성을 추적하기위한 확립되고 덜 알려진 형광 염료의 응용 프로그램에 대해 자세히 설명합니다.

필라멘트 곰팡이의 살아있는 세포 이미징을 위한 막 및 세포벽 선택적 형광 염료의 적용

여기서, 우리는 질량 분광계 기지를 둔 proteomics에 의하여 감염 도중 호스트와 병원체 사이 상호 작용을 프로파일기 위하여 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 단일 실험에서 호스트(예를 들어, 대식세포)와 병원체(예를 들어, Cryptococcus neoformans)의단백질 풍부도의 변화를 측정하기 위해 라벨이 없는 정량화를 사용합니다.

발견 중심의 숙주-병원균 상호 작용을 위한 라벨 프리 정량적 프로테오믹스 워크플로우

우리는 침수 된 문화와 고체 미디어 모두에서 필라멘트 곰팡이 A. nidulans의 성장 운동학을 캡처, 분석 및 정량화하기 위해 전송 된 빛 현미경 기술을 사용하여 라벨이없는 라이브 이미징 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 형광 현미경 검사법과 함께 사용할 수 있습니다.

라이브 현미경 및 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 아스퍼길러스 니둘란스 성장률의 정량적 분석

배우세요 미세유체 장치를 활용한 세포 수준 곰팡이-미생물 상호작용 연구 방법입니다. 고해상도 시차영상으로 토양 미생물군집의 동적 생태를 탐색하고 지속가능한 농업을 위한 생물방제제 개발에 활용하세요.

세포 수준에서 곰팡이 - 미생물 상호 작용을 조사하기위한 미세 유체 도구

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