고정화된_{항원에 대한} 방사성 표지된 항체의 결합 친화도 (KD) 결정

이 방법은 그의 항원에 대한 방사성 표지된 항체의 결합 친화도를 결정할 수 있다. 또한 결합의 특이성을 측정할 것이다. 이러한 간단한 방법의 주요 이점은 접합되지 않은 모 항체로부터의 간섭 없이 방사성표지된 항체만의 결합 친화도의 특이적 특성화이다.

이 기술은 방사성 표지된 항체가 그의 표적에 결합하는 능력을 정량적으로 검증한다. 이것은 핵 영상 및 다양한 질병에서의 핵 요법에 응용하는 데 중요합니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실의 대학원 동료 인 Erika Belitzky가 될 것입니다.

시작하려면 191 밀리그램의 중탄산나트륨과 23.9 밀리그램의 탄산나트륨을 50 밀리리터 원뿔형 튜브에 첨가하여 고정화 완충액을 준비하십시오. 그런 다음 40 밀리리터의 18 메가 옴 물을 넣고 볼텍싱하여 녹입니다. 이제 총 부피를 50 밀리리터로 가져 오기 전에 pH를 9.0으로 조정하십시오.

다음으로, 200 밀리리터의 PBS와 100 마이크로리터의 트윈 20을 250 밀리리터 병에 첨가하여 200 밀리리터의 세척 완충액을 준비한다. 또한 50 밀리그램의 BSA와 25 마이크로리터의 트윈 20 ~ 50 밀리리터의 PBS를 첨가하고 볼텍싱하여 혼합하여 50 밀리리터의 결합 완충액을 준비하십시오. PBS 50 밀리리터에 BSA 1.5 그램을 첨가하여 블로킹 버퍼를 제조하고 부드럽게 와류하여 혼합한다.

고정화 완충액에 항원을 희석하십시오. 그런 다음 깨지기 쉬운 96 웰의 평평한 바닥 플레이트를 취하여 100 마이크로 리터의 항원을 8 x 세 개의 배열로 24 웰의 각 웰 바닥에 첨가하십시오. 플레이트를 밀봉 테이프로 덮고 하룻밤 사이에 섭씨 네 도에서 배양하십시오.

다음날, 세척 완충액으로 접시를 세 번 씻으십시오. 싱크대에서 플레이트를 활발하게 뒤집어 액체를 처분하고 종이 타월 더미에 접시를 두드려 과도한 액체를 제거하십시오. 이어서, 항원을 함유하는 웰에, 다채널 피펫을 사용하여 웰당 300 마이크로리터의 세척 완충액을 첨가한다.

웰당 300마이크로리터의 블로킹 버퍼를 24개의 항원 코팅 웰과 96웰 플레이트의 24개의 빈 웰 모두에 첨가한다. 이어서, 플레이트를 주변 온도에서 한 시간 동안 인큐베이션하고, 플레이트의 각 웰을 300 마이크로리터의 세척 완충액으로 세 번 세척한다. 방사성 표지된 항체의 세 배 연속 희석물을 플레이트 상의 A 내지 H로 지정된 여덟 행에 대한 결합 완충액 내에 만든다.

먼저, 첫 번째 농도의 1.2 밀리리터 용액을 만드는 데 필요한 스톡 방사성 표지 항체의 부피를 계산하십시오. 그런 다음, B를 H로 표지된 마이크로원심분리 튜브에 800 마이크로리터의 결합 완충액을 첨가하고, 필요한 부피의 결합 완충액을 A로 표지된 마이크로원심분리 튜브에 첨가한다.스톡 방사성 표지된 항체의 계산된 부피를 튜브 A에 첨가하고 부드럽게 와류시킨다. 그런 다음, 미니 마이크로 원심분리기를 사용하여 스핀 다운하여 튜브의 바닥에있는 모든 액체를 수집하십시오.

다음으로, 두 개의 A에서 튜브 B에 400 마이크로 리터의 액체를 넣으십시오.볼텍스 한 후 미니 마이크로 원심 분리기를 사용하여 스핀 다운하십시오. 마찬가지로, 튜브 B에서 튜브 C로, C에서 D까지, 튜브 H까지 용액을 추가하십시오.항원으로 고정 된 세 개의 웰과 BSA로만 차단 된 세 개의 웰에 웰 당 각 희석액의 100 마이크로 리터를 추가하십시오. 이제 A 표준에서 H 표준으로 표지 된 마이크로 원심분리 튜브에 각 희석액 100 마이크로 리터를 추가하고 감마 카운터에서 분석 할 방사성 표지 항체 표준으로 이러한 튜브를 저장합니다.

플레이트를 섭씨 37도에서 한 시간 동안 부드럽게 흔들면서 배양하십시오. 원고에 설명된 바와 같이 각 웰에 대해 마이크로원심분리 튜브를 라벨링한다. 방사성 표지된 항체를 진공 흡인기기를 사용하여 96-웰 플레이트의 웰로부터 흡인한다.

이제 다중 채널 피펫을 사용하여 300 마이크로 리터의 세척 버퍼를 각 웰에 추가하십시오. 세척 완충액을 흡인하고 세척을 네 번 더 반복하십시오. 웰을 적절한 마이크로 원심분리 튜브로 분해하십시오.

H1, H2, H3, H3에서 A1, A2, A3으로 표시된 항원으로 튜브의 방사능을 계산한 다음 감마 카운터를 사용하여 H4, H5, H6, A4, A5, A6으로 표시된 BSA로만 표시하십시오. 방사성 표지된 아미반타맙은 EGFR 및 cMET 단백질에 대해 특이적 결합을 나타냈다. 유사하게 결합 친화도는 또한 EGFR 및 cMET 단백질에 결합된 단일팔 방사성 표지된 팹에 의해 유지되었다.

포화 결합 플롯은 방사성 표지된 항체의 농도가 너무 낮을 때, 선형 곡선으로 표시된 바와 같이 포화가 달성되지 않았다는 것을 보여주었다. 너무 높았던 방사성 표지된 항체의 농도는 수평 고원에 의해 나타난 바와 같이 뚜렷한 대수 성장 없이 포화를 가져왔다. 또한, 높은 비특이적 결합은 고농도의 방사성 표지된 항체로 인해 나타났다.

이 절차는 각각의 특정 방사성 표지된 항체에 대한 농도 범위를 최적화하기 위해 다수의 시도를 취할 수 있다. 부정적인 결과의 데이터를 사용하여 향후 실험을 설계할 수 있습니다. 일단 결합 친화도가 알려지면, 이는 방사성 표지된 항체의 특성화의 일부로서 다른 시험관내 검정에 대한 벤치마크로서 사용될 수 있다.