매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량 분광법 이미징 을 사용한 초파리 뇌의 신속한 지질 분석을 위한 샘플 준비

Maldi MS 분광법 이미징은 과도한 샘플 수정 없이 지질 존재비와 분포를 식별하고 시각화하는 확립되고 유용한 도구입니다. Maldi 이미징의 주요 장점은 라벨링 없이 현장에서 지질을 검출하고 대량의 샘플을 동시에 분석할 수 있다는 것입니다. 연습이 완벽을 만든다.

실제 실험 샘플을 처리하기 전에 잘 연습하십시오. 샘플 준비 시간을 최소화하고 절차 전반에 걸쳐 오염을 방지합니다. 시작하려면 기포 형성을 피하면서 최적의 절단 온도 또는 OCT를 극저온 금형 깊이의 절반까지 플라스틱 극저온에 추가합니다.

금형을 평평한 표면에 몇 분 동안 그대로 둔 다음 드라이 아이스로 옮깁니다. 드라이 아이스에 저온을 평평하게 유지하고 OCT가 평평하고 균일 한 표면을 형성하도록합니다. OCT가 금형에서 완전히 응고 될 때까지 기다리십시오.

냉동 OCT 스테이지를 즉시 사용하거나 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 성인 파리를 마취 한 후 이산화탄소를 사용하여 실험실 닦은 조각이 들어있는 페트리 접시를 준비하십시오. 정전기를 줄이기 위해 물티슈의 일부를 적시는 데 물을 사용하십시오.

물티슈를 반은 젖고 반은 건조하게 유지하십시오. 해부 스코프 1에서 플라이 헤드를 절단 한 후 4-5 개의 헤드를 모아 실험실 와이프의 건조한 영역에 놓습니다. 드라이 아이스에서 현미경 2로 OCT 단계를 수행하십시오.

즉시 헤드를 OCT 단계로 옮기고 OCT 용융을 피하기 위해 약 30-60초가 걸리는 빠르게 배열하십시오. OCT에서 적절한 지지를 확보하기 위해 각 플라이 브레인 주위에 약 1mm의 빈 공간을 남겨두고 섹션을 처리할 수 있는 적절한 공간을 제공하기 위해 블록 가장자리에서 4-5mm의 빈 공간을 남겨 둡니다. OCT 스테이지를 드라이 아이스에 다시 놓고 약 3분 동안 그대로 두어 OCT 스테이지가 얼고 단단한 상태로 유지되도록 합니다.

모든 플라이 헤드가 정렬된 후 OCT 스테이지를 드라이아이스 위에 5분에서 10분 더 둡니다. OCT 스테이지를 드라이 아이스에서 평평한 표면으로 옮긴 다음 다량의 OCT 화합물을 빠르게 추가하여 모든 샘플을 덮고 전체 저온 몰드를 채우는 데 약 3 초가 걸립니다. 즉시 냉동 생물을 드라이 아이스로 다시 옮기고 내장 된 조직이 포함 된 전체 OCT 블록을 동결시킵니다.

OCT 스테이지를 드라이 아이스에 5-10 분 더 두십시오. 저온의 가장자리에 샘플을 라벨링하고 절단 준비가 될 때까지 냉동 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관하십시오. 저항으로 설정된 전압계를 사용하여 ITO 슬라이드의 전도도를 테스트하여 ITO 코딩면을 확인합니다.

저항 측정이 있는 면을 조직을 부착할 면으로 표시합니다. 라벨을 붙이고 슬라이드 오염을 방지하기 위해 항상 슬라이드 바닥에 실험실 물티슈를 설정하십시오. 그런 다음 조직이 저온 유지 챔버에서 30-45분 동안 평형을 이루도록 합니다.

저온 유지 장치를 가급적이면 70 % 에탄올로 청소하십시오. 스테이지에서 롤 플레이트를 닦고 사용한 블레이드를 제거합니다. 추가 깨끗한 물티슈를 사용하여 에탄올이 증발하고 절단이 시작되기 전에 모든 표면이 건조한지 확인하십시오.

다음으로, 조직의 유형에 따라 저온 유지 챔버 모래 표본 헤드의 온도를 조정합니다. OCT를 사용하여 표본 홀더에 조직을 장착합니다. OCT 블록의 바닥을 덮을 만큼 충분한 OCT를 사용하고 블록을 가능한 한 평평하게 장착하도록 주의하십시오.

무대에 깨끗한 칼날을 놓고 잠급니다. 원하는 절단 각도를 얻기 위해 필요에 따라 시편의 헤드를 스테이지 쪽으로 배치합니다. 그런 다음 관심 영역을 찾을 때까지 두꺼운 부분에서 절단을 시작하십시오.

무대를 깨끗하게 유지하기 위해 미리 냉각된 아티스트 브러시로 여분의 조각을 지속적으로 털어냅니다. 필요에 따라 챔버 온도를 약간 조정하고 원하는 영역에 도달하면 단면의 두께를 10-12 마이크로 미터로 변경하십시오. 조심스럽게 원하는 섹션을 수집하십시오.

실온 ITO 슬라이드를 가져와 섹션 위에 놓습니다. 섹션에 부드럽게 접근하고 저온 유지 장치 단계에 흔적을 남기지 않고 슬라이드에 부착하십시오. 슬라이드를 랙에 따로 놓거나 여러 섹션의 모음 사이에 있는 저온 유지 장치 외부의 실험실 닦으십시오.

동일한 코호트의 서로 다른 샘플 간의 비교를 원하는 경우 여러 샘플의 섹션을 단일 슬라이드에 배치하여 동시에 분석하여 변동을 최소화할 수 있습니다. Maldi 대상 홀더는 한 번에 두 개의 슬라이드를 수용할 수 있으므로 필요한 경우 두 개의 슬라이드로 분리합니다. 진공 상자의 슬라이드를 건조제를 바닥 층으로 사용하여 건조제로 운반합니다.

슬라이드를 진공 상태에서 30-60 분 동안 구동 한 다음 매트릭스 증착을 진행합니다. 메탄올 물에 2 개의 5 개의 디 하이드 록시 벤조산 또는 DHB를 매트릭스로 사용하십시오. 슬라이드를 슬라이드 트랜스 포터에 넣고 왁스 필름으로 개구부를 단단히 밀봉하십시오.

지퍼백으로 밀봉합니다. 건조제가 들어있는 다른 지퍼 백에 넣으십시오. 외부에 라벨을 붙이고 적절한 안구 건조증을 가진 Maldi 핵심 시설로 샘플을 배송하십시오.

매트릭스 증착의 경우 DHB 밀리리터당 40밀리그램과 메탄올 물을 매트릭스로 사용하고 자동 HTX M5 매트릭스 분무기를 사용하여 스프레이합니다. 10PSI의 질소 가스 압력을 사용하십시오. Maldi 비행 시간, MS 기기 및 양이온 모드를 사용하여 질량 스펙트럼을 획득하십시오.

아세토 니트로에서 0.5마이크로리터의 적린 에멀젼을 ITO 슬라이드에 발견하여 기기를 보정합니다. 이 스펙트럼을 사용하여 2차 교정 곡선을 적용하여 100 - 1000 MZ 질량 범위에서 기기를 교정하십시오. 레이저 스폿 직경을 40마이크로미터 래스터 너비에 대한 변조된 빔 프로파일이므로 중간으로 설정하고 어레이 위치당 1000헤르츠의 레이저 반복률로 500샷을 합산하여 이미징 데이터를 수집합니다.

그런 다음 스펙트럼 데이터를 기록합니다. 제곱 평균 정규화를 사용하여 이미징 데이터 분석을 수행하여 플러스 마이너스 0.10 달톤의 대역폭에서 이온 이미지를 생성합니다. 소프트웨어를 사용하여 동일한 실험에서 OCT와 뇌 조직 모두의 스펙트럼을 정렬하여 OCT의 이온 억제 간섭에서 중첩 피크를 평가한다.

마지막으로, 조직 샘플을 함유하는 MALDI 슬라이드를 헤마톡실린 및 에오신, 또는 H 및 E 염색에 의해 처리한다. Maldi MS 분석의 이미지는 LPR1 녹아웃 돌연변이 뇌에서 지질 함량의 전반적인 감소를 보여주었습니다. 대표적인 H 및 E 염색된 성체 파리 뇌 절편이 여기에 도시되어 있다.

지질 종, 각각의 MZ 값 및 히트 맵의 척도도이 이미지에 표시됩니다. 적어도 4개의 생물학적 복제로부터의 대조군과 비교하여 LPR1 녹아웃 돌연변이체에서의 감소의 평균 배는 화살표 옆에 숫자로서 도시된다. 대조군 및 돌연변이 파리 둘 다로부터의 뇌 조직 영역에서 선택된 빈 OCT 영역의 질량 스펙트럼은 MZ1 내지 1000 및 MZ520 내지 900의 범위에서 나타내었다.

OCT의 간섭은 이온 억제 현상 및 중첩 신호 문제와 관련이 있습니다. 지질체학 데이터의 충실도를 유지하려면 적절한 샘플 준비, 해부 및 극저온 절편이 중요합니다. Maldi 실험을 수행한 후 액체 크로마토그래피, 질량 분석법 기반 지방체학이라고도 하는 LCMS를 통해 지질의 정체를 확인할 수 있습니다.

이 기술은 뇌의 인간 질병 관련 대사 변화를 이해하는 길을 열어주는 강력하고 부드러운 모델 시스템을 사용하여 뇌 지질 항상성에 대한 분자 통찰력을 얻습니다.