Name: 차등 동적 현미경을 사용하여 세포 골격 역학 정량화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 37 s
Description: 배우세요 차등 동적 현미경(DDM)을 사용하여 재구성된 세포 골격 네트워크의 역학을 정량화하는 방법을. 비멘틴 네트워크의 비에르고딕성과 활성 액틴-미세소관 복합체의 탄도 운동을 분석할 수 있습니다.

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이 연구의 일부는 국립 보건원 R15 상 (National Institute of General Medical Sciences Award no. R15GM123420, R.M.R.-A.에 수여 및 R.J.M.), 과학 진흥 연구 공사의 코트렐 학자 상 (27459 호, R.J.M.에 수여), 윌리엄 M. 케크 재단 연구 보조금 (R.M.R-A.에 수여). GHK는 네덜란드 연구위원회 (NWO; NWO 인재 프로그램의 프로젝트 번호 VI.C.182.004)의 재정 지원을 감사하게 인정합니다.

참고: 다음 프로토콜의 각 단계와 함께 사용할 코드가 포함된 Jupyter 노트북 파일은 다음 GitHub 리포지토리 https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples 에서 찾을 수 있습니다. 해당 파일의 PDF는 보충 파일 1에 포함되어 있습니다. 또한 각 함수 및 클래스의 코드 및 설명서에 대한 연습은 웹 사이트 https://rmcgorty.github.io/PyDDM/ 에서 찾을 수 있습니다.
1. 소프트웨어 설치
<ol><li>예제 DDM 분석 파일을 따라 가려면 코드 실행을 위해 Jupyter Notebook을 설치합니다. NumPy 및 Matplotlib를 포함한 다른 필수 공통 Python 패키지도 설치하십시오. 이 패키지는 모두 Anaconda 배포판과 함께 번들로 제공됩니다 (https://www.anaconda.com/products/individual 참조).</li>
	<li>파이썬 패키지 xarray63을 설치하십시오. 이 패키지는 메타데이터 및 분석 매개 변수를 구성하고 저장하는 데 필요합니다. Anaconda 배포판을 사용하는 경우 다음 명령을 사용하여 xarray (권장 종속성과 함께)를 설치하십시오. conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 병목 현상
</li>
	<li>다음 명령을 사용하여 PyYAML 패키지를 설치합니다. conda install -c anaconda yaml 이 패키지는 분석할 이미지와 사용자가 분석 및 피팅을 위해 설정한 파라미터에 대한 메타데이터를 읽는 데 필요합니다.</li>
	<li>GitHub 리포지토리에서 다운로드하거나 git 명령을 사용하여 PyDDM 패키지를 설치합니다. 자식 클론 https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git
</li>
</ol>2. 이미징 세션 계획
<ol><li>사용 가능한 최적의 이미징 형식 및 광학 설정을 선택합니다. 앞서 언급했듯이 DDM은 여러 가지 현미경 검사 방법과 함께 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>사용할 적절한 대물 렌즈와 이미지 크기를 계획하는 데 도움이 되도록 픽셀 크기와 전체 이미지 크기에 따라 프로브될 웨이브 넘버( q)의 범위를 결정합니다. 배율 및 시야각의 선택이 이러한 계산을 기반으로 실험에 최적인지 확인합니다. 여기에서 분석된 이미지의 경우, 60x 1.4 NA 대물 및 0.83 μm의 픽셀 크기를 갖는 256 x 256 픽셀의 이미지 크기를 활성 액틴-미세소관 복합체 네트워크에 사용하였다. 비멘틴 네트워크에 내장된 비드의 이미지의 경우, 100x 1.4 NA 대물렌즈와 0.13μm의 픽셀 크기를 갖는 512 x 512 픽셀의 이미지 크기가 사용되었다. 참고: 최소 q는 2π/NΔ x로 설정되며, 여기서 이미지 크기(정사각형으로 가정)는 N× N 픽셀이고 픽셀 크기는 Δx입니다. 최대 q는 최소 π/Δx 및 2π NA/λ이며, 여기서 NA는 이미징 대상의 수치 조리개이고 λ는 빛의 파장입니다(브라이트필드 이미징의 경우 NA를 (NA대물 + NA콘덴서)/2로 대체할 수 있음).</li>
	<li>다음으로, 조사할 시간 척도의 범위를 고려합니다. 일반적으로 DDM 분석은 최소 1000 프레임의 시퀀스에서 수행됩니다.<ol>
<li>적절한 프레임 속도를 결정하기 위해, 샘플의 피쳐가 최소 해결 가능한 길이 스케일(최대 q에 해당)의 순서로 거리를 이동하는 데 걸리는 예상 시간을 고려하십시오.</li>
		<li>프로브된 시간 스케일 범위의 상한을 고려할 때, 전형적으로, 주어진 지연 시간Δt 의 수백 개의 이미지 차이들의 전력 스펙트럼이 잡음을 감소시키기에 충분한 통계를 제공하기 위해 함께 평균화된다는 것을 인식한다. 따라서 프로브된 최대 시간 척도보다 긴 이미지 시퀀스를 획득합니다. 참고: 예상 확산 계수 D 또는 속도 v가 알려진 경우 τ = 1/Dq2 또는 τ = 1/vq를 사용하여 예상 특성 감쇠 시간을 q의 범위와 함께 추정할 수 있으며, 이는 시야각 및 픽셀 크기에 따라 결정됩니다. 액세스 가능한 q-범위에 대한 예상 τ 값의 범위는 프레임 속도의 선택과 획득할 프레임 수를 안내하는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 샘플 준비 및 이미지 수집
참고: 대표 결과 섹션에 제시된 데이터에 사용된 샘플 준비 및 이미징 설정에 대한 자세한 내용은 저자11,51,64 및 보충 파일 2의 이전 간행물을 참조하십시오.
<ol><li>프로브할 시간 및 길이 스케일의 고려에 기초하여, 이상적으로는, 1000 프레임 이상의 이미지 시퀀스를 획득한다. 참고: 이 코드는 이미지 내에서 정사각형 이미지 또는 관심 있는 사각형 영역을 분석하므로 그에 따라 프레임 크기를 조정합니다.</li>
	<li>이미지 시퀀스를 입체 그레이스케일 TIFF 스택으로 저장합니다. 또는 Nikon Instruments 시스템에서 사용하는 ND2 형식인 ND2 형식은 설치된 패키지에서 읽을 수 있습니다. 이미지가 다른 형식으로 저장된 경우 ImageJ 또는 다른 이미징 처리 프로그램을 사용하여 이미지를 TIFF 스택으로 변환합니다. 참고: ND2 파일을 사용하는 경우 https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader 의 패키지 nd2reader를 설치해야 합니다.</li>
</ol>4. 매개 변수 설정
<ol><li>PyDDM 코드 리포지토리에 제공된 매개변수 파일 example_parameter_file.yml의 복사본을 예제 폴더 아래에 만듭니다. 이 YAML 파일을 NotePad++와 같은 텍스트 편집기 또는 JupyterLab의 텍스트 편집기로 엽니다. 대표 결과 섹션에 제시된 데이터 분석에 사용되는 예제 YAML 파라미터 파일은 보충 파일 2 를 참조하십시오.</li>
	<li>복사된 YAML 파일에서 분석할 이미지 시퀀스에 해당하는 데이터 디렉터리 및 파일 이름을 제공합니다. 메타데이터 섹션 아래에서 픽셀 크기와 프레임 속도를 제공합니다.</li>
	<li>Analysis_parameters 섹션에서 DDM 행렬을 계산하는 방법에 대한 세부 정보를 제공합니다. 여기에 있는 일부 매개 변수는 선택 사항입니다.<ol>
<li>최소한 매개 변수 number_lag_times 및 last_lag_time에 대한 값을 제공합니다. 이들은 DDM 행렬을 계산하는 다른 지연 시간의 수와 사용할 가장 긴 지연 시간 (프레임 내)에 각각 해당합니다. 여기에 사용된 비멘틴 네트워크에서의 트레이서 비드의 데이터에 대해, 파라미터 number_lag_times 및 last_lag_time는 각각 60 및 1000이었다. 이 코드는 1 프레임에서 로그 간격이 있는 first_lag_time까지의 지연 시간(또는 선택적 매개 변수 last_lag_time이 지정된 경우 다른 최소 지연 시간)에 대한 DDM 행렬을 계산합니다. 참고: M 프레임을 획득한 경우 M-1만큼 큰 지연 시간에 대한 DDM 행렬을 계산할 수 있습니다. 그러나 이러한 큰 지연 시간에 통계가 좋지 않으면 데이터가 시끄러울 수 있습니다. DDM 행렬을 계산하는 데 걸리는 가장 긴 지연 시간은 데이터의 세부 정보에 따라 다르지만 전체 이미지 시리즈 지속 시간의 삼분의 일 정도를 시도하는 것이 좋습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>DDM 행렬 또는 ISF(중간 산란 함수)가 Fitting_parameters 섹션에 어떻게 적합해야 하는지에 대한 세부 정보를 제공합니다. model 매개변수 아래에 모델 이름을 지정합니다. 선택한 모델의 각 피팅 매개변수에 대한 초기 추측, 하한 및 상한을 제공합니다. 참고: 가능한 피팅 모델 목록을 표시하려면 print_fitting_models 기능을 실행하십시오. 이 모델은 PyDDM 웹 사이트의 온라인 설명서에서도 찾을 수 있습니다.</li>
</ol>5. DDM 행렬 계산
<ol><li>DDM_Analysis 클래스의 인스턴스를 초기화합니다. 이렇게 하려면 YAML 파일의 전체 파일 경로가 포함된 파일 이름을 DDM_Analysis에 전달하여 위에서 설명한 메타데이터 및 분석 매개 변수를 제공합니다. 또는 메타데이터와 매개 변수를 Python 사전 데이터 구조로 전달합니다.</li>
	<li>함수 calculate_DDM_matrix를 실행하여 DDM 행렬을 계산합니다. 이 계산은 프레임 크기와 지연 횟수에 따라 몇 분 이상 걸릴 수 있습니다. 일반적인 실행 시간은 그림 2 를 참조하십시오.</li>
	<li>데이터 집합이라고 하는 xarray 패키지의 데이터 구조에 있는 반환된 데이터를 검사합니다. 이 데이터 구조는 속성 ddm_dataset 아래에 저장됩니다. 참고: DDM 행렬뿐만 아니라 관련 변수 및 메타데이터도 이 데이터 구조에 저장됩니다. 또한 네트워크 공통 데이터 양식(netCDF) 형식으로 디스크에 저장됩니다.</li>
	<li>생성되고 표시될 플롯과 그림을 검사합니다. 이 수치는 데이터 디렉토리에 PDF 파일로도 저장됩니다.<ol>
<li>생성 된 플롯 중 하나가 푸리에 변환 된 이미지의 <img alt="Equation031" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;"> 앙상블 평균 제곱 모듈러스를 q의 함수로 보여줍니다. 기본적으로 코드에서는 이를 사용하여 배경 매개 변수 B를 추정합니다. 큰 q의 한계에서 <img alt="Equation031" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;"> B가 배경인 B/2에 접근한다고 가정하여 배경을 추정하십시오.</li>
		<li>큰 q에서 고원에 도달하지 못하면 <img alt="Equation031" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq031.png" style="margin-bottom: 0px;"> B를 추정하기위한 다른 방법을 사용하십시오. 이렇게 하려면 매개 변수 background_method을 YAML 파일 또는 함수 calculate_DDM_matrix에 대한 선택적 키워드 인수로 설정합니다. B를 추정하는 방법에 대한 자세한 내용은 대표적인 결과 섹션에 제시되어 있다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63931/63931fig2v2.jpg"> 그림 2: DDM 행렬을 계산하기 위한 계산 시간. (A) 및 (B)에서, DDM 행렬을 계산하기 위한 시간이, <img alt="Equation009" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq009.png" style="margin-bottom: 0px;">도시되어 있다. 모든 경우에 사용되는 데이터는 이미지 크기가 512 x 512 픽셀인 5000 프레임의 동영상입니다. DDM 행렬은 1 프레임 (0.01 초)과 1000 프레임 (10 초) 사이에 로그 적으로 간격을 둔 30 지연 시간에 대해 계산되었습니다. 이 코드는 32GB RAM이 있는 Intel i7-10700 2.90GHz 데스크탑 컴퓨터에서 실행되었습니다. (A)에서, 각 지연 시간에 대한 DDM 행렬을 계산하는데 사용되는 이미지 차이의 수를 변화시키는 효과가 도시되어 있다. 이를 위해 이미지는 비닝되어 이미지 크기가 256 x 256이 됩니다. 각각의 지연 시간 Δt에 대해, 그Δt에 의해 분리된 이미지들은 감산되고 결과 매트릭스는 푸리에 변환된다. 주어진 Δt에 대해, 그Δt에 의해 분리된 이미지의 모든 쌍들이 사용될 수 있고(파란색으로 도시됨), 오직 비중첩 이미지 쌍들만이 사용될 수 있고(예를 들어, 프레임 1 및 10, 10 및 19 등; 갈색으로 도시됨), 또는 300개 이하의 이미지 쌍들이 각각의Δt에 대해 사용될 수 있다. (B)에서, 계산 시간에 대한 이미지 크기를 변경하는 효과가 도시되어 있다. 이미지는 2 x 2, 4 x 4 또는 8 x 8 픽셀을 그룹화하여 비닝되어 이미지 크기가 각각 256 x 256, 128 x 128 또는 64 x 64가 되었습니다. 각각에 대해, 약 300개의 이미지 쌍이 각각의Δt에 대한 DDM 행렬을 계산하는데 사용된다. (c) DDM 매트릭스로부터, 중간 산란 함수(ISF)가 추출될 수 있다. 이것은 (A)의 세 가지 경우에 대해 도시된다. 파란색 데이터 포인트(오프셋 없음)는 각Δt에 대해 최대 수의 이미지 쌍이 사용될 때 ISF에 해당합니다. 갈색 데이터 포인트(오프셋이 0.1)는 겹치지 않는 이미지 쌍이 각Δt에 사용될 때 ISF에 해당합니다. 분홍색 데이터 포인트(오프셋이 0.2인 경우)는 각Δt에 대해 최대 300개의 이미지 쌍이 사용될 때 ISF에 해당합니다. 겹치지 않는 이미지 쌍을 사용하여 발견된 ISF는 긴Δt에서 잡음을 나타낸다. 이 경우, 긴 Δt에서 몇 개의 이미지 쌍이 사용된다(예를 들어, 1000 프레임의Δt에 대해, 단지 4개의 이미지 쌍만이 사용된다). (d) ISF를 지수 함수에 피팅함으로써, 각 파수, q에 대한 특성 감쇠 시간, τ가 결정된다. 분홍색에서는 원본 이미지를 2 x 2로 비닝한 후 이미지 크기가 256 x 256이 되는 결과가 표시됩니다. 회색으로, 8 x 8로 비닝한 후 결과가 나타나며, 그 결과 이미지 크기가 64 x 64가 됩니다. 데이터를 비닝하면 더 높은 파수에서 다이내믹에 대한 정보가 손실되지만 64 x 64 이미지에 대한 DDM 행렬을 계산하면 256 x 256 이미지보다 약 16배 빠릅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63931/63931fig2v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
6. DDM 매트릭스 또는 ISF 피팅
<ol><li>DDM_Fit 클래스의 인스턴스를 초기화합니다. 이렇게 하려면 이미지 메타데이터 및 피팅 매개 변수가 포함된 YAML 파일의 파일 이름을 DDM_Fit로 전달합니다.</li>
	<li>DDM 행렬 또는 ISF가 데이터를 피팅하는 데 사용할 모델을 결정합니다. 함수 print_fitting_models을 실행하여 사용 가능한 모델을 나열합니다. YAML 매개변수 파일에 사용하거나 함수 reload_fit_model_by_name을 사용하여 사용할 모델을 지정합니다.</li>
	<li>제공된 YAML 매개변수 파일에서 선택한 모델의 각 매개변수에 대한 초기 추측 및 경계를 설정합니다. 매개변수에 대한 초기 추측값을 변경하려면 함수 set_parameter_initial_guess을 사용합니다. 함수 set_parameter_bounds을 사용하여 매개 변수의 경계를 설정합니다. 예를 들어, 보충 파일 2에서 볼 수 있듯이 vimentin 네트워크의 추적기 비드 데이터의 경우 붕괴 시간에 대한 초기 추측값은 1초이고 해당 매개 변수의 경계는 0.01초와 2000초였습니다.</li>
	<li>함수 핏으로 핏을 실행합니다. 이 함수의 출력에 변수를 할당하여 결과에 쉽게 액세스할 수 있습니다. 참고: 이 함수는 많은 선택적 인수를 사용할 수 있습니다. 이러한 인수 목록과 기본값이 아닌 값으로 설정하는 것을 고려해야 하는 경우에 대해서는 코드 설명서 및 제공된 예제를 참조하십시오.</li>
</ol>7. 적합 결과 해석
<ol><li>함수 fit_report을 사용하여 적합 매개변수의 적합치 및 q-의존성을 검사하기 위한 플롯을 생성합니다. 참고: 이 함수는 일련의 플롯을 생성하며, 이 플롯은 PDF로도 저장됩니다. 이 함수에 대한 선택적 인수를 사용하여 생성된 플롯을 수정할 수 있습니다.</li>
	<li>생성된 플롯 중에는 모델 및 최적 적합 매개변수를 사용하여 계산된 DDM 행렬 또는 ISF와 함께 네 개의 q-값(fit_report에 대한 선택적 인수로 지정됨)에서 DDM 행렬 또는 ISF(선택한 피팅 모델에 따라 다름)를 보여주는 2 x 2 서브플롯이 있는 그림이 있습니다. 대화형 방식으로 가장 적합한 DDM 행렬 또는 ISF를 플로팅하려면 Jupyter 노트북 환경을 사용할 때 제공된 예제와 같이 클래스 Browse_DDM_Fits을 사용합니다.</li>
	<li>특징적인 감쇠 시간 τ 대 파수 q의 플롯으로부터 역학이 확산, 하위 확산, 탄도 또는 다른 유형의 움직임을 따르는지 여부를 결정하십시오. 이것은 τ와 q 사이의 전력 법칙 관계를 찾음으로써 수행 할 수 있습니다. 참고: 함수 fit_report에 의해 생성된 τ 대 q의 로그 로그 플롯에는 지정된 q 값 범위에 대한 전력 법칙에 해당하는 세 줄이 표시됩니다. 실선 검정 선은 τ 대 q를 전력 법칙에 맞추는 것에 해당하며, τ = 1 / Kq β이며, 여기서 K 및 β는 자유 매개 변수입니다. 주황색의 점선은 단순 확산, τ = 1 / Dq2에 대한 피팅에 해당하며, 여기서 D는 확산 계수입니다. 파란색의 점 점선은 τ = 1 / vq에 맞는 값에 해당하며, 여기서 v는 속도입니다.</li>
</ol>8. 결과 저장
<ol><li>적합의 결과는 xarray 데이터 세트에 저장됩니다. xarray 함수 to_netcdf 또는 Python의 내장 pickle 모듈을 사용하여이 데이터 구조를 디스크에 저장하십시오. xarray 함수 open_dataset를 사용하여 이러한 netCDF 파일을로드하십시오.</li>
	<li>함수 save_fit_results_to_excel를 사용하여 데이터와 함께 적합 결과를 워크시트 파일에 저장합니다.</li>
</ol>

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</ol>

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여기에 설명된 소프트웨어 패키지는 DDM을 사용하여 광학 현미경을 사용하여 획득한 이미지에서 관찰된 밀도 변동을 분석합니다. 비멘틴 네트워크에 포매된 트레이서 입자의 데이터로부터의 대표적인 결과가 먼저 도시되었다. 이러한 데이터의 분석은 단일 입자 추적이 세포 골격 네트워크(6,12,13)에 대한 많은 과거 연구에서 어떻게 사용되었는지와 유사하게 네트워크의 메쉬 크기 및 강성을 특성화하는데 사용될 수 있다. 단일 입자 추적보다 DDM을 사용하면 DDM이 파티클을 지역화할 필요가 없다는 이점이 있습니다. 따라서 입자 밀도가 너무 높거나 입자가 너무 작아서 국부적으로 추적하지 못하는 이미지에서도 DDM은 여전히 역학을 결정할 수 있습니다. 단일 입자 추적이 유리한 곳은 입자 간 변동성을 검사할 때입니다. DDM을 사용하면 앙상블 평균 역학을 찾을 수 있지만 단일 입자 추적을 사용하면 단일 파티클의 MSD와 앙상블 평균 MSD를 모두 계산할 수 있습니다. 그러나 DDM은 넓은 시야 내에서 여러 관심 영역을 분석하여 이기종 역학을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.
다음으로, 두 개의 상이하게 표지된 세포골격 필라멘트 유형으로 구성된 활성 네트워크에서의 형광 표지된 필라멘트의 데이터로부터의 대표적인 결과를도 11에 나타내었다. 이 데이터를 통해 탄도 동작은 이미지 내에서 지역화 가능한 기능이 필요하지 않은 것으로 특성화되었습니다. DDM은 사용자 입력이 거의없는 앙상블 평균 역학을 추출하기 때문에 서로 다른 조건으로 획득 한 이미지 시리즈를 비교하는 것을 간단합니다 (예 : 액틴의 비율이 다른 샘플과 미세 소관 또는 미오신 농도가 다른 샘플을 비교하는 것,50에서 수행 된 것처럼). 또한 형광 이미징을 사용하여 다색 표지를 사용하여 네트워크의 다양한 구성 요소의 역학을 조사 할 수 있습니다. 이것은11,50에서 이루어졌으며, 여기서 액틴과 미세 소관의 역학은 다색 이미징을 사용하여 활성 액틴-미세 소관 복합 네트워크에서 별도로 분석되었습니다. 여기의 대표적인 결과 섹션에서, 미세소관 채널로부터의 결과만이 도시되었지만, 이전 연구에서, 우리는 미세소관과 액틴 필라멘트(11)의 역학을 비교하였다.
우리는 이러한 대표적인 결과가 수동적 인 하위 확산 또는 능동적 인 탄도 운동을 보여줍니다. 중요한 것은 DDM을 사용하여 중간 시간 또는 길이 척도에서 역학 유형에 교차가있는 시스템을 분석 할 수 있다는 것입니다. 예로서, Kurzthaler et al.은 DDM을 활성 야누스 콜로이드 시스템과 함께 사용하여 짧은 시간 스케일에서 능동적 지향 운동을 탐색하고 더 긴 시간 스케일59에서 배향의 무작위화를 탐구했다. Giavazzi et al. 조대 폼과 함께 DDM을 사용하고 버블33의 길이 스케일에 대응하는 역학에서 크로스 오버를 발견했습니다. Cho et al.은 콜로이드 겔과 함께 DDM을 사용했으며 프랙탈 클러스터에서 전체 네트워크(32)에 이르기까지 서로 다른 길이 스케일에서 세 가지 구별 가능한 정권을 발견했습니다.
대표적인 결과 섹션에 포함된 데이터는 브라이트필드 현미경 및 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 획득되었습니다. 그러나 앞서 언급했듯이 DDM은 많은 이미징 형식과 함께 사용할 수 있습니다. 모든 이미징 양식에서 사용자는 광학 단면화의 정도 또는 피사계 심도와 같은 광학 설정을 고려해야합니다. 높은 수준의 광학 단면화는 초점이 맞지 않는 물체로부터의 신호를 감소시킬 수 있지만, 물체가 피사계 심도25,28에서 벗어나는 시간 척도보다 큰 시간 척도에 걸친 역학을 정확하게 측정 할 수는 없습니다. q-의존적 피사계 심도가 DDM 분석에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 보다 철저한 논의는22에서 찾을 수 있다. 브라이트필드 이미징의 경우 사용자는 샘플 두께를 고려해야 할 수도 있습니다. 약하게 산란하는 샘플들에 대해, 더 두꺼운 샘플들은 더 많은 신호(42)를 제공할 수 있는 반면, 탁한 샘플들은 다수의 산란(81)을 설명하도록 분석을 수정하는 것을 요구할 수 있다. 마지막으로, 선형 공간이 불변하지 않은 이미징 방법(즉, 물체의 카메라에 의해 기록된 강도가 해당 물체가 xy 샘플 평면에 있는 위치에 따라 달라지는 경우)의 경우, 암장 DDM27로 입증된 바와 같이 선형 공간 분산을 설명해야 할 수도 있습니다.
DDM을 시작하는 사람들을 위해, 우리는 공간적, 시간적 해상도를 고려하는 것의 중요성을 강조하고자합니다. 결정된 감쇠 시간을 파수의 함수로 검사할 때, 분해능의 한계(즉, 그림 5에서 수행된 바와 같이, 최대 및 최소 지연 시간 및 최대 파수)를 표시하는 것이 중요합니다. 최적의 대물 렌즈, 이미지 크기, 프레임 속도 및 동영상 지속 시간을 선택할 수 있도록 데이터를 수집하기 전에 이러한 제한에 대해 신중하게 생각해야합니다. 다른 중요한 고려 사항은 배경 매개 변수 B를 추정하는 방법입니다. 배경을 추정하기 위한 다수의 방법이 문헌에서 사용되었고, 과대 또는 과소 평가 B의 효과가 선행 간행물62,77에 기술되었다. 그림 10에서 볼 수 있듯이 PyDDM을 사용하면 사용자가 B를 추정하는 다양한 방법을 구현할 수 있으므로 새로운 사용자가 이러한 방법을 시도하고 사용하기에 적합한 방법을 평가할 것을 제안합니다.
이 패키지의 강점은 예제 데이터, 분석이 수행된 방식을 추적하기 위한 메타데이터의 저장 및 구성, DDM 매트릭스를 분석하는 방법의 유연성(다양한 피팅 모델, 배경 파라미터 B를 추정하기 위한 여러 방법, MSD를 찾는 기능)을 갖춘 철저한 문서화 및 연습입니다. 그러나이 코드에는 개선 될 수있는 여러 가지 측면이 있습니다. 현재 이 코드는 빠른 계산 속도를 위해 최적화되지 않았습니다. 계산 속도를 높이기위한 방법은61,62 개로보고되었으며 향후 릴리스에서 구현 될 예정입니다. 또한, 불확실성을 더 잘 예측하고 사용자를 적절한 ISF 모델(62)로 안내하기 위한 시뮬레이션을 사용하기 위해 최근에 보고된 방법을 구현할 계획이다. 다른 개선을 위해, 우리는 사용자가 제안과 함께 저희에게 연락 할 수 있기를 바랍니다.

세포 골격은 진핵 세포의 세포질을 가로 질러 세포 표면을 핵에 연결하는 단백질 필라멘트의 네트워크입니다. 그것은 크고 반복되는 기계적 부하에 대한 기계적 보호를 제공하는 독특한 재료 특성을 가지고 있지만 동적 셀 모양 변화를 주도합니다1. 재구성 된 세포 골격 네트워크는 임베디드 입자의 케이징에서 분자 모터에 의해 구동되는 탄도 운동에 이르기까지 다양한 흥미로운 동적 행동을 일으킬 수 있습니다 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . 이러한 네트워크의 역학을 분석하는 방법에는 임베디드 트레이서 마이크로스피어(6,7,12,13,14)의 모션을 추적하는 것, 시간에 따른 단백질-밀도 클러스터의 크기를 추적하는 이미지 분석(8), 동적 광 산란 15, 입자 이미지 속도계4,16,17,18,19가 포함된다. , 시간에 따른 이미지의 파워 스펙트럼 밀도를 계산(19), 및 키모그래프 분석(20)을 계산한다. 재구성 된 세포 골격 네트워크에 대한 더 많은 연구가 수행됨에 따라 세포 역학 또는 활성 물질을 이해할지 여부, 역학을 특성화하기위한 견고하고 편견이 없으며 재현 가능한 방법이 점점 더 필요합니다. 세포 골격 역학을 연구하는 데 사용 된 비교적 새로운 기술 인 차동 동적 현미경 (DDM) 21,22은 사용자 정의 매개 변수가 거의없는 역학을 효율적으로 정량화하는 기술 중 하나입니다. 여기에 설명 된 소프트웨어 패키지를 사용하면 프로그래밍 또는 이미지 분석 경험이 거의없는 연구원이 DDM을 자신의 작업에 활용할 수 있습니다.
DDM은 샘플의 역학을 추출하는 이미지 분석 기술입니다. 입자 추적 또는 입자 이미지 속도측정과 마찬가지로 DDM에는 일반적으로 현미경으로 기록되는 시계열 이미지(종종 수천 개의 이미지)가 필요합니다. 파티클 트래킹과 달리, 개별 피쳐 또는 트레이서 비드는 이미지에서 국부화(또는 지역화될 수 있음)될 필요가 없습니다. 입자 추적 및 입자 이미지 속도측정과 달리 상대적으로 적은 사용자 지정 매개 변수로 DDM을 사용하여 앙상블 역학을 복구합니다. DDM을 사용하면 푸리에 공간에서 이미지를 분석하여 파수 범위, q, 여기서 q = 2πu, u는 공간 주파수 <img alt="Equation004" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq004.png"> 의 크기, q에 대한 밀도 변동의 감쇠 시간을 결정합니다. 하나는 산란과 같은 정보를 얻지만 현미경21,22,23에서 획득 한 실제 공간 이미지를 얻습니다. 따라서, 광역 형광 22,24, 공초점 형광 25, 편광 26, 암장27, 또는 광장 형광 28 현미경과 같은 현미경 검사의 다양한 콘트라스트 생성 방법을 이용할 수 있다. 또한, DDM 분석에 사용되는 이미지들은 상보적인 정보를 제공하기 위해 입자 추적 또는 입자 이미지 속도측정에 사용될 수 있다.
동적 광산란과 광학 현미경의 이러한 기능의 조합은 DDM을 강력하고 다재다능한 기술로 만듭니다. DDM이 73nm 콜로이드 입자의 확산을 측정하기 위해 입증 된 2008 년 21 년 Cerbino and Trappe에 의해 처음 설명 된 이래로, DDM은 흐르는 콜로이드 29, 콜로이드 응집30,31, 네마틱 액정의 점탄성 26, 콜로이드 젤32의 역학, 조대 폼 33, 제한된 환경에서의 나노 입자 34, 35,36,37, 박테리아 운동성 38,39,40,41, 약하게 산란하는 단백질 클러스터(42), 유체 계면에서의 모세관파(43), 및 다른 시스템의 확산. DDM을 사용하는 출판물의보다 완전한 목록을 찾는 사람들은 주제에 대한 철저한 검토 논문 22,23,44,45를 참조 할 수 있습니다.
DDM은 또한 생물학적 네트워크의 역학을 조사하는 데 사용되었습니다. Drechsler et al.은 DDM을 사용하여 살아있는 초파리 난모세포에서 액틴의 역학을 측정했습니다46. Burla et al. 히알루로난과 히알루로난-콜라겐 복합체47의 네트워크에서 트레이서 입자의 역학을 정량화하였다. 재구성된 세포골격 네트워크(9,10)에서 트레이서 입자의 역학을 연구하기 위한 DDM의 몇몇 용도, 그러한 네트워크에서의 DNA 분자의 수송(48,49), 및 활성 재구성된 네트워크의 역학 또한 11,50,51이 문서화되었다. 이러한 시스템에서 역학을 측정할 때 DDM의 장점은 개별 입자 또는 분자를 국부화하고 추적할 필요가 없다는 것입니다. 예를 들어, 혼잡 한 환경에서 DNA 분자의 역학은 이러한 작고 비 구형 분자를 추적하는 데 어려움이 있음에도 불구하고 DDM으로 측정 할 수 있습니다. 또한, 형광 현미경을 사용하면 다중 색상 라벨링을 사용하여 복합 복합체에서 개별 구성 요소의 역학을 선택적으로 측정 할 수 있습니다.
DDM을 수행하기 위해 시간이 지남에 따라 일련의 이미지 인 I (x, y, t)를 가져옵니다. 주어진 래그 시간에 대해,Δt, 그 지연 시간에 의해 분리된 이미지의 모든 (또는 서브세트의) 쌍이 발견된다. 각 쌍의 차이의 제곱 푸리에 변환,
<img alt="Equation007" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq007.png" style="margin-bottom: 0px;">
는 함께 계산되고 평균화됩니다. 이 양은, <img alt="Equation008" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq008.png" style="margin-bottom: 0px;">역학이 등방성인 경우에 한해, 방사상으로 평균화된다. 이렇게 하면 DDM 행렬(이미지 구조 함수라고도 함) <img alt="Equation009" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq009.png" style="margin-bottom: 0px;">이 생성됩니다. 이 프로세스는 그림 1에 그래픽으로 표시되어 있습니다. 이 DDM 행렬에서 샘플의 역학을 결정하기 위해 DDM 행렬은 형태를 취한다고 가정합니다.
<img alt="Equation010" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq010.png" style="margin-bottom: 0px;">
여기서 A는 현미경의 세부 사항과 샘플의 구조에 의존하는 진폭이고, B는 이미지의 노이즈에 의존하는 배경이며, f (q,Δt)는 역학21,22에 대한 정보를 포함하는 중간 산란 함수 (ISF)입니다. 간단한 경우에,
<img alt="Equation014" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq014.png" style="margin-bottom: 0px;">
여기서 τ는 특징적인 감쇠 또는 비상관관계 시간이다. 이러한 ISF는 묽은 콜 로이드 현탁액 21,24,27,37,40,52와 같은 인체 시스템에 DDM을 사용하는 여러 연구에서 사용되어 왔다. 그러나 ISF의 다른 형태를 사용하여 다양한 유형의 역학을 모델링 할 수 있습니다. 예를 들어, 다분산 샘플에 대한 ISF를 모델링하기 위해 누적 확장을 다음과 같이 사용할 수 있다.
<img alt="Equation016" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq016.png" style="margin-bottom: 0px;">
여기서 μ는 다분산도42,53의 척도이고; 밀도 변동이 두 가지 개별 모드로 감소하면 다음과 같은 ISF를 사용할 수 있습니다
<img alt="Equation018" src="/files/ftp_upload/63931/63931eq018.png" style="margin-bottom: 0px;">26, 54, 55, 56 , 57;
다른 ISF는 미생물 또는 다른 활성 입자 38,39,40,41,58,59를 수영하는데 사용될 수 있다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63931/63931fig1v2.jpg"> 그림 1: DDM 분석 개요. 이미지의 시계열에서 이미지 차이의 푸리에 변환이 계산되어 DDM 행렬을 계산합니다. DDM 행렬은 q 값 범위에 걸친 밀도 변동의 시간 척도를 결정하기 위해 모델에 적합할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63931/63931fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
여기에서는 Python, PyDDM으로 개발된 DDM 분석 소프트웨어 패키지의 사용에 대해 설명합니다. 이 소프트웨어 패키지는 지난 몇 년 동안 연구 실험실 및 기타 출판 된 연구에서 수행 한 작업을 기반으로합니다. 이 소프트웨어 패키지를 만들기 위한 주요 동기는 (1) 분석에 사용된 메타데이터 및 파라미터를 추적하고 저장해야 할 필요성을 포함한다. (2) 처음부터 끝까지 분석의 상세한 예와 함께 철저한 문서화; (3) 데이터를 피팅하기 위해 상이한 수학적 모델을 채용하는(또는 새로운) 수학적 모델을 생성하는 쉬운 방법(예를 들어, 활성 필라멘트(60)을 위해 최근에 개발된 것과 같은 ISF 모델을 추가하는 것은 간단할 것이다). DDM 분석을위한 다른 소프트웨어 패키지도 존재하지만 모든 것이 오픈 소스 프로그래밍 언어로 잘 문서화되고 작성된 것은 아닙니다. 예를 들어, GPU(https://github.com/peterlu/ConDDM)25에서 컴퓨팅을 사용하는 C++ 코드, 푸리에 변환을 사용하여 계산 속도를 높이는 C++ 코드(https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)61, MATLAB 및 Python 버전(https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)40, MATLAB 코드(https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)27, 불확실성 정량화가 있는 MATLAB 코드( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)62. 이 PyDDM 패키지는 잘 문서화되어 있으며 DDM 매트릭스를 계산하고 분석하는 방법에 많은 유연성을 제공하므로 프로그래밍 또는 이미지 분석의 배경에 관계없이 DDM을 구현하려는 연구원에게 유용 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 이 소프트웨어 패키지를 사용하여 시험관내 재구성된 세포골격 네트워크의 역학을 정량화하는 방법을 보여줍니다. 이것은 두 개의 뚜렷한 이미징 데이터 세트를 사용하여 수행됩니다 : (1) 밝은 필드 현미경으로 찍은 vimentin 네트워크에 내장 된 서브 마이크론 트레이서 입자의 이미지와 (2) 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 찍은 미오신 구동 활동이있는 얽힌 복합 네트워크에서 형광 표지 된 액틴 및 미세 소관 필라멘트의 이미지. 이 두 데이터 세트의 분석은 다양한 이미징 형식 (예 : 밝은 필드 또는 공초점 형광)으로 촬영 한 이미지를 분석하고, 임베디드 트레이서 또는 라벨이 붙은 필라멘트에서 역학을 추출하고, 다양한 역학 (예 : 하위 확산 및 제한 또는 탄도)을 정량화하는 능력을 포함하여 DDM의 주목할만한 강점을 강조합니다.

<table><tbody><tr><td>CMOS 카메라, Orca-Flash 4.0</td><td>Hamatsu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>F-127 Pluronic</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jupyter Notebook</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti-Eclipse 현미경</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLL-PEG-bio</td><td>SuSos AG, D&uuml; bendorf, 스위스</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리스티렌 비드</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>단백질 투석 미니 카세트</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyDDM</td><td>University of San Diego</td><td>N/A</td><td>오픈 소스 소프트웨어 https://github.com/rmcgorty/PyDDM</td></tr></tbody></table>

차등 동적 현미경을 사용하여 세포 골격 역학 정량화

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

세포는 크롤링하고, 스스로 치유하고, 현저하게 역동적인 세포 골격으로 인해 강성을 조정할 수 있습니다. 이와 같이, 세포골격 바이오폴리머의 네트워크를 재구성하는 것은 활성이고 적응가능한 물질의 호스트로 이어질 수 있다. 그러나 이러한 재료를 정밀하게 조정 된 특성으로 엔지니어링하려면 역학이 네트워크 구성 및 합성 방법에 어떻게 의존하는지 측정해야합니다. 이러한 역학을 정량화하는 것은 복합 네트워크의 시간, 공간 및 공식화 공간에 걸친 변형에 의해 도전 받고 있습니다. 여기의 프로토콜은 푸리에 분석 기술인 차등 동적 현미경(DDM)이 어떻게 생체 중합체 네트워크의 역학을 정량화할 수 있는지를 설명하며, 특히 세포골격 네트워크 연구에 매우 적합합니다. DDM은 레이저 스캐닝 공초점, 광역 형광 및 브라이트필드 이미징을 포함한 다양한 현미경 양식을 사용하여 획득한 이미지의 시간 시퀀스에서 작동합니다. 이러한 이미지 시퀀스로부터, 파동 벡터의 스팬에 걸친 밀도 변동의 특징적인 역상관 시간을 추출할 수 있다. DDM 분석을 수행하는 사용자 친화적 인 오픈 소스 Python 패키지도 개발되었습니다. 이 패키지를 사용하면 중간 필라멘트 (vimentin) 네트워크 및 활성 액틴 - 미세 소관 네트워크의 데이터로 여기에서 입증 된 바와 같이 표지 된 세포 골격 구성 요소 또는 임베디드 트레이서 입자의 역학을 측정 할 수 있습니다. 사전 프로그래밍 또는 이미지 처리 경험이 없는 사용자는 이 소프트웨어 패키지 및 관련 문서를 사용하여 DDM을 수행할 수 있습니다.

차동 동적 현미경 (DDM)은 동적 광산란과 현미경의 기능을 결합합니다. 여기서, DDM을 사용하여 비멘틴 네트워크에서 입자의 서브확산 및 케이징된 역학을 정량화함으로써 재구성된 세포골격 네트워크를 특성화하는 과정과 활성 미오신 구동 액틴-미세소관 복합체의 탄도 운동이 제시된다.

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

우리의 프로토콜은 다양한 광학 현미경 기술을 사용하여 많은 시스템에서 역학을 정량화 할 수 있습니다. 우리는이 방법이 특히 재구성 된 세포 골격 네트워크의 역학을 특성화하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 강조합니다. 우리의 차동 동적 현미경 소프트웨어 패키지를 사용하는 주요 장점은 잘 문서화되어 있고, 여러 예제 분석 파일을 가지고 있으며, 다양한 유형의 역학을 연구하기 위해 쉽게 적응할 수 있다는 것입니다.우리의 소프트웨어 패키지는 재구성 된 세포 골격 네트워크뿐만 아니라 다른 부드럽고 생물학적으로 관련된 물질에서도 역학을 정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 프로브가 Micro-Manager와 같은 현미경 제어 소프트웨어를 사용하여 1, 000 프레임 이상의 이미지 시퀀스를 획득하는 시간 및 길이 스케일에 기초합니다. PyDDM 코드 리포지토리에 제공된 예제 폴더 아래에서 example_parameter_file.yml이라는 매개 변수 파일의 복사본을 만듭니다.메모장 + 또는 JupyterLab의 텍스트 편집기와 같은 텍스트 편집기로이 EML 파일을 엽니 다. 복사된 EML 파일에서 분석할 이미지 시퀀스에 해당하는 데이터 디렉토리와 파일 이름을 제공합니다. 메타데이터 섹션 아래에서 픽셀 크기와 프레임 속도를 제공합니다.분석 매개변수 섹션에서 DDM 행렬의 계산을 위한 매개변수(예: 다른 지연 시간 수 및 가장 긴 지연 시간)를 선택합니다. 피팅 매개변수 섹션의 DDM 행렬 또는 중간 산란 함수의 피팅에 대한 세부 정보(예: 모델 및 모델 매개변수의 이름, 초기 추측, 하한 및 상한)를 제공합니다. EML 파일의 파일 이름에 DDM 분석에 대한 전체 파일 경로를 전달하여 분석 매개변수에 메타데이터를 제공하여 DDM 분석 클래스의 인스턴스를 초기화합니다.또는 메타데이터와 매개 변수를 Python 사전 데이터 구조로 전달합니다. 함수를 실행하여 DDM 행렬을 계산합니다. Xarray 패키지에 데이터 세트로 저장되는 관련 변수 및 메타데이터로 반환된 데이터를 검사합니다.그런 다음 PDF 파일 및 데이터 디렉토리로 저장된 플롯과 그림을 검사하십시오. 이러한 플롯 중 하나는 배경을 추정하는 방법에 대한 기본 방법을 보여줍니다. 필요한 경우 EML 파일의 매개변수 배경 메소드를 사용하거나 함수 계산 DDM 행렬에 대한 선택적 키워드 인수로 배경을 추정하는 방법을 변경하십시오.이미지 메타데이터 및 피팅 매개변수가 포함된 EML 파일의 파일 이름을 전달하여 DDM fit 클래스의 인스턴스를 초기화합니다. 기능 인쇄 피팅 모델을 실행하여 사용 가능한 모델을 나열합니다. EML 매개변수 파일에 사용할 모델을 지정하거나 이름별로 적합 모델 다시 로드 함수를 사용하여 지정합니다.선택한 모델의 각 매개변수에 대해 함수 세트 매개변수 초기 추측 및 매개변수 경계를 설정하여 EML 파일에 지정된 값과 다른 경우 초기 추측 및 경계를 설정합니다. 함수 핏으로 핏을 실행합니다. 함수 적합도 보고서를 사용하여 적합 매개변수의 q 종속성에서 적합치를 검사하기 위한 플롯을 생성합니다.적합도와 함께 네 개의 q 값에서 DDM 행렬 또는 ISF를 보여주는 두 개의 서브플롯이 있는 그림을 포함한 출력을 확인합니다. Jupyter 노트북 환경에 맞는 DDM 클래스 찾아보기를 사용하여 대화형 방식으로 가장 적합한 DDM 행렬 또는 ISF를 플로팅합니다. 감쇠 시간 대 파형 플롯의 점을 클릭하면 데이터와 적합도가 표시됩니다.Xarray 데이터 세트에 저장된 적합의 결과를 확인하고 두 개의 netCDF 또는 Python의 내장 피클 모듈 함수를 사용하여이 데이터 구조를 디스크에 저장하십시오. DDM 분석은 vimentin 네트워크에서 0.6 미크론 비드의 브라이트필드 이미지 시리즈와 스펙트럼적으로 구별되는 형광 라벨을 갖는 활성 액틴-미세소관 복합체 네트워크로부터의 공초점 현미경 이미지에서 수행되었다. 중간 산란 함수는 상이한 파수 및 19 마이크로몰 및 34 마이크로몰의 비멘틴 농도를 갖는 네트워크에서의 지연 시간의 함수로서 플롯팅되었다.0보다 훨씬 높은 값에서 함수의 긴 지연 시간 고원은 비인체성을 나타냅니다. 서로 다른 비멘틴 농도를 갖는 두 네트워크에 대해 q의 함수로 플롯된 붕괴 시간 타우는 서브-확산 또는 제한된 움직임을 보여준다. 34 및 49 마이크로몰 비멘틴을 갖는 네트워크에 대해 q제곱된 q의 함수로서 플롯된 비인체성 파라미터 c는 c의 로그가 제한된 운동에 대해 예상대로 q제곱에 비례한다는 것을 보여주었다.평균 제곱 변위 대 지연 시간 플롯은 DDM에서 결정된 값이 단일 입자 추적을 통해 발견된 값과 잘 일치한다는 것을 보여주었습니다. 더 집중된 네트워크의 경우, 더 긴 지연 시간에서 값이 고원화됩니다. 활성 액틴-미세소관 복합체 네트워크에 대한 DDM 매트릭스 대 지연 시간은 특정 q 값에 대한 DDM 매트릭스가 낮은 지연 시간에서 고원을 가졌고, 그 후 큰 지연 시간에서 더 고원화되어 증가한다는 것을 보여주었다.적합치에서 DDM 매트릭스까지의 특징적인 감쇠 시간 타우는 타우와 q 사이의 관계가 탄도 운동을 나타낸다는 것을 보여준다. 이 PyDDM 소프트웨어 패키지를 개발한 후, 우리는 활성 세포골격 네트워크 및 기타 시스템의 이방성 및 시간 변동 역학을 조사하는 데 이 패키지를 사용했습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

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