Name: 정밀 절단 폐 슬라이스를 활용하여 기도 및 폐 동맥 평활근의 수축 조절 연구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: 학습하세요 정밀 절단 폐 슬라이스(PCLS)를 이용한 기도 및 폐 동맥 평활근 수축 조절 연구 방법을. 마우스 폐 조직을 활용한 이 ex vivo 모델은 폐 생리학 및 호흡기 질환 치료 전략 개발에 중요한 통찰을 제공합니다.

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이 작업은 NIH 보조금, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A)에 의해 지원됩니다.

모든 동물 보호는 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침에 따라 이루어졌습니다. 8주령의 야생형 C57/B6 수컷 마우스를 본 연구에 사용하였다.
1. 실험 준비
<ol><li>작업 솔루션을 준비하십시오.<ol>
<li>1x 행크의 균형 잡힌 소금 용액 (HBSS, Ca2+ 및Mg2+ ,pH는 20mM HEPES로 균형을 이룬다, 자료표 참조)을 준비한다. HBSS 용액을 사용하여 PCLS를 준비하고 처리하십시오. PCLS를 준비 할 때 HBSS 용액을 얼음 위에 차갑게 유지하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>둘베코의 변형 이글 배지와 F-12 (DMEM-F12)를 항생제 - 항균제 (1:100 부피비, 표 참조)로 보충하여 PCLS의 배양액을 준비하십시오.</li>
	<li>1.5 % 아가로스와 6 % 젤라틴 용액을 준비하십시오.<ol>
<li>저융점 (LMP) 아가로스 또는 젤라틴 분말 ( 물질 표 참조)을 HBSS 용액과 별도로 15 mL 멸균 원심분리 튜브 (또는 용액 부피 >10 mL인 경우 50 mL 튜브)에 섞어 최종 농도로 혼합하십시오. 참고: 아가로스 용액의 총 부피 = 5 mL/마우스 x 마우스 수; 젤라틴 용액 = 2 mL/마우스 x 마우스 수.</li>
		<li>분말이 완전히 용해 될 때까지 끓는 물에 용액 튜브를 가열하십시오. 아가로스와 젤라틴 용액을 모두 42°C 수조에 보관하십시오. 참고: 해부 테이블의 가열 램프는 작동 환경을 따뜻하게 유지하고 마우스 폐에 주입되기 전에 아가로스 용액이 응고되는 것을 방지하는 데 유용할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>한 쌍의 해부 가위, 두 쌍의 곡선 마이크로 해부 포셉 및 한 쌍의 지혈 포셉을 포함한 모든 해부 도구를 70 % 에탄올 용액에 적어도 20 분 동안 잠수하십시오.</li>
	<li>비브라톰을 준비( 재료 표 참조)하여 폐 조직을 얇은 조각으로 절편성하십시오.</li>
	<li>기도 또는 혈관 수축 반응을 평가하기 위해 CCD 카메라로 반전 위상차 현미경을 유지하고 맞춤형 레이저 스캐닝 공초점 현미경 (자료 표 참조)을 사용하여 폐 SMC18에서Ca2+ 신호 전달을 평가하십시오.</li>
</ol>2. 아가로스와 젤라틴 용액으로 마우스 폐의 팽창
<ol><li>마우스를 안락사시킵니다.<ol>
<li>마우스를 5% 이소플루란이 있는 플라스틱 챔버(약 750cm3)에 넣는다. 마우스가 적어도 1 분 동안 호흡을 멈출 때까지 챔버에 보관하십시오. 참고: 케타민 (240 mg/Kg) 및 자일라진 (32 mg/Kg)19 또는 펜토바르비탈 (0.3 mL)20의 복강내 주사와 같은 다른 일차 안락사 방법은 흡입된 이소플루란의 대안으로 적용될 수 있다.</li>
		<li>마우스 몸체를 수핀 위치의 해부 보드에 놓습니다. 꼬리, 앞발 및 머리를 25G 주사기 바늘로 고정하여 몸을 제자리에 고정시키고 70 % 에탄올 스프레이로 몸을 소독하십시오.</li>
		<li>외과 용 가위로 마우스의 복부를 엽니 다 (절개, 길이 ~ 2cm x 너비 2cm). 그런 다음 복부 대동맥을 잘라 혈액량을 고갈시킵니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>아래 단계에 따라 폐 엽을 팽창시킵니다.<ol>
<li>흉골과 횡격막 위의 양측 열등한 흉곽을 따라 흉강을 조심스럽게 열고 흉강이 열릴 때 폐 엽이 붕괴되는 것을 관찰하십시오.</li>
		<li>양측 복부 흉곽의 일부를 제거하여 심장을 노출시킵니다. 날카로운 가위 끝을 폐 조직에서 멀리 향하게하여 폐 손상을 피하십시오.</li>
		<li>포셉을 사용하여 마우스 목의 흉선과 연조직을 분리하여 기관을 노출시킵니다.</li>
		<li>20G Y형 IV 카테터의 팁이 통과할 수 있도록 기관의 상단부에 작은 구멍(직경 1.2mm) 을 절단합니다(재료 표 참조).</li>
		<li>Y자형 카테터의 어댑터 포트 하나를 0.5mL의 공기로 미리 채워진 3mL 주사기로 연결하고, 다른 포트는 2mL의 따뜻한 1.5% 아가로스 용액(42°C)으로 미리 채워진 3mL 주사기로 연결한다.</li>
		<li>카테터를 채우기 위해 아가로스 용액을 주입한 다음, 미리 절단된 개구부를 통해 카테터를 5-8 mm 길이의 기관 내로 밀어 넣는다.</li>
		<li>아가로스 용액을 약 1 mL/5 s로 천천히 주입하십시오. 폐는 근위 - 원위 축을 따라 확장됩니다. 각 폐 엽의 가장자리가 팽창 될 때 주사를 중단하십시오. 참고 : 폐가 파열 될 수 있으므로 폐를 과도하게 팽창시키지 마십시오. 젊은 성인 마우스의 전체 폐를 팽창시키는 아가로스 용액의 부피는 약 1.3 ± 0.1 mL이다.</li>
		<li>다른 주사기에서 0.2-0.3 mL의 공기를 주입하여 카테터 및 전도성 기도의 잔류 아가로스를 원위 폐포 공간으로 밀어 넣습니다.</li>
		<li>한 쌍의 곡선 지혈 포셉으로 기관을 닫습니다 ( 재료 표 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>폐 혈관 조직을 채우십시오.<ol>
<li>1 mL 주사기를 따뜻한 6 % 젤라틴으로 채 웁니다. 바늘 두피 정맥 카테터에 연결하고 카테터를 젤라틴 용액으로 채운 다음 바늘로 열등한 벽에 가까운 우심실에 구멍을 뚫습니다.</li>
		<li>바늘을 2-3mm 길이의 우심실로 밀어 넣고 바늘 끝을 주요 폐동맥으로 향하게하십시오.</li>
		<li>젤라틴 용액 0.2 mL를 우심실 및 폐동맥 혈관에 천천히 주입하십시오. 참고 : 폐 엽은 적절한 젤라틴 인플레이션으로 약간 더 창백하게 보입니다.</li>
		<li>주사 후 5분 동안 바늘을 제자리에 두고, 심장과 폐에 얼음처럼 차가운 HBSS 용액을 부어 폐엽을 식힌 다음, 해부보드가 있는 몸체를 4°C 냉장고 또는 얼음 위에 총 10분 동안 놓는다.</li>
		<li>가위로 주변의 결합 조직에서 마우스 폐와 심장을 제거하십시오. 그런 다음 각 폐엽을 분리하고 얼음 위의 HBSS 용액에 보관하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 폐 엽을 얇은 조각으로 절개하기
<ol><li>수퍼접착제로 시편 컬럼 상단에 폐엽을 다듬어 부착하고, 절단 방향이 힐라에서 폐 표면까지 대부분의 기도에 수직이 되도록 로브(그림 1A,B)의 방향을 맞춥니다.</li>
	<li>신선한 얇은 면도날이있는 비브라톰을 사용하여 폐 엽을 150 μm 조각으로 자릅니다. 차가운 HBSS 용액으로 미리 채워진 100mm 멸균 페트리 접시에 조각을 모으십시오. 주: 슬라이싱을 시작하기 전에 적절한 블레이드 이동 속도와 진동 주파수를 설정하십시오. 압축기의 일반적인 설정은 속도 레벨 4 및 진동 레벨 4입니다.</li>
	<li>슬라이스를 DMEM/F-12 배지(20 슬라이스/15 mL 배지/접시)로 채워진 페트리 접시로 옮기고 실험 전에 하룻밤 동안 37°C 배양기에서 유지한다. 참고: 마우스 PCLS는 기도 수축성 반응을 잃지 않고 약 7일 동안 배양물에서 유지될 수 있다(17). 폐동맥의 수명은 철저히 평가되지 않았습니다. 우리의 관찰에서, 그들은 DMEM / F12 배지에서 적어도 3 일 동안 온전한 구조와 혈관 반응을 유지합니다. 장기간 보관을 위해, 마우스 PCLS를 10% DMSO(바이알 당 1mL 배지에 5개 슬라이스)를 함유하는 DMEM/F12 배지로 채워진 냉동 장치에 넣고, -80°C에서 하룻밤 동안 이소프로필 알콜 충전된 용기에 동결시키고, 수주 내지 수개월 동안 액체 질소에서동결보존할 수 있다.</li>
</ol>4. 폐내 기도와 동맥의 수축 반응 분석
<ol><li>PCLS를 HBSS로 채워진 24웰 배양 플레이트에 각 웰에 하나씩 넣습니다. 우물 중앙에서 PCLS를 찾은 다음 피펫으로 HBSS 용액을 제거하십시오.</li>
	<li>현미경으로 슬라이스에서 대상 기도 및 용기를 찾은 다음, 미리 절단된 중앙 구멍(직경 2-3 mm)이 있는 나일론 메쉬를 사용하여 슬라이스를 커버하여 표적 영역을 노출시킵니다.</li>
	<li>메쉬 위에 중공 금속 와셔를 내려 놓고 슬라이스를 제자리에 고정시킵니다(그림 2A).</li>
	<li>600 μL의 HBSS 용액을 첨가하여 PCLS를 잠급니다. 슬라이스를 10분 동안 쉬고 기도나 선박의 기준선 이미지를 기록합니다.</li>
	<li>피펫으로 빈 HBSS 용액을 조심스럽게 흡입하고 1 μM의 메타콜린 (MCh) 또는 10 nM의 엔도텔린과 같은 작용제와 함께 HBSS 600 μL를 첨가함으로써 기도 또는 혈관 수축을 유도 하였다 (물질의 표 참조). 참고: 도구 세트 표준으로서의 KCl 자극은 메타콜린 또는 엔도텔린 노출 전에 필요하지 않습니다. 마우스 기도에서 100 mM의 KCl 자극은 단지 작고 불규칙한 기도 수축(10%-15%)을 유도한다20. 마찬가지로, 프라이밍 메타콜린 자극은 동일한 작용제, 예를 들어 메타콜린 또는 세로토닌이 첫 번째 및 반복적 인 노출20,22에서 유사한 기도 수축을 유발한다는 것을 확인했기 때문에 의무적이지 않습니다.</li>
	<li>발광 영역 변화가 평형 상태에 도달할 때까지 현미경으로 반응을 관찰한 다음, 분석을 위해 기도 또는 혈관 이미지를 기록한다.</li>
	<li>피펫으로 MCh 또는 엔도텔린 용액을 제거하고 동일한 작용제 농도 및 이완제를 갖는 새로운 600 μL HBSS 용액을 첨가하고; 기도 또는 혈관 이완을 관찰하고 기록하십시오.</li>
	<li>아래 단계에 따라 기도 또는 혈관 반응을 정량화한다.<ol>
<li>NIH가 후원하는 무료 소프트웨어 FIJI에 이미지를로드하십시오.</li>
		<li>도구 모음에서 다각형 선택을 선택하여 각 프레임의 기도 또는 혈관 내강을 윤곽을 그립니다.</li>
		<li>분석을 선택> 측정값을 영역 > 설정합니다.</li>
		<li>분석 > 측정을 선택하여 관심 영역을 정량화합니다. 결과는 통계 분석을 위해 별도의 창에 표시됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 기도 또는 혈관 SMC의Ca2+ 신호전달 분석
<ol><li>Ca2+ 염료 로딩 완충액을 준비한다.<ol>
<li>Ca2+ 염료, 오레곤 그린 488 BAPTA-1-AM (재료 표 참조), 50 μg (1 바이알)을 10 μL의 DMSO와 함께 용해시킨다.</li>
		<li>0.2 g의 플루로닉 F-12 분말 ( 물자재 표 참조)을 1 mL의 DMSO에 용해시켜 20% 플루로닉 용액을 생성하였다.</li>
		<li>20% 플루로닉 용액 10μL를Ca2+ 염료-DMSO 용액 10μL와 혼합한다.</li>
		<li>200 μM의 설포브로모프탈레인과 함께 HBSS 용액 2 mL에 혼합물 20 μL를 첨가하여 Ca2+ 염료 로딩 버퍼를 만든다(표 참조).</li>
	</ol>
</li>
	<li>15마리의 마우스 PCLS를 2 mL의Ca2+ 로딩 완충액에 넣고 30°C에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 슬라이스를 실온에서 형광 염료 탈에스테르화를 위해 추가로 30분 동안 100 μM의 설포브로모프탈레인과 함께 HBSS 용액 2 mL로 옮긴다.</li>
	<li>SMC의 Ca2+ 신호를 감지합니다.<ol>
<li>Ca2+ 염료가 장착된 슬라이스를 대형 커버 글래스에 놓습니다.</li>
		<li>3mL 주사기를 고진공 실리콘 그리스로 채웁니다. 18G 무딘 바늘을 통해 그리스를 짜서 슬라이스 위와 아래의 커버 글라스를 가로 질러 두 개의 평행선을 그립니다.</li>
		<li>두 그리스 라인 사이에 나일론 메쉬를 사용하여 슬라이스를 덮으십시오. 두 번째 커버 유리를 메쉬 위에 놓아 측면에 그리스로 밀봉된 챔버를 생성합니다(그림 3A). 참고: 나일론 메쉬는 슬라이스를 하단 커버슬립에 부착하여 40x 오일과 같은 높은 크기 반전 목표의 작동 거리 내에 유지하는 데 필수적입니다.</li>
		<li>HBSS 또는 작용제 용액을 수동으로 또는 관류 시스템을 통해 피펫팅하여 한쪽 끝에서 챔버에 추가하십시오. 연속 유체 관류의 경우 티슈 페이퍼 또는 진공으로 다른 쪽 끝에서 흡입하여 챔버로부터 유체를 제거하십시오.</li>
		<li>PCLS 챔버를 현미경 무대에 놓습니다. SMC 23의 Ca2+ 신호를 15 또는30 이미지 / s의 레이저 스캔 속도로 맞춤형 공진 스캐닝 공초점 현미경으로 감지하십시오. 참고: 대안적으로, 현재 널리 이용가능한 고속 상용 레이저 스캐닝 공초점 현미경은 PCLS에서 폐 SMCs의Ca2+ 신호전달 검정에 적용될 수 있다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SMCs에서Ca2+ 형광을 정량한다.<ol>
<li>녹화된 이미지 시퀀스를 FIJI로 로드하고 이미지 > 유형 > 8비트 회색조를 선택합니다.</li>
		<li>도구 모음에서 사각형 선택을 선택하고 평활근 셀에서 5픽셀 x 5픽셀 관심 영역(ROI)을 정의합니다.</li>
		<li>분석 >Ca2+ 형광 강도를 나타내는 평균 회색 값> 측정 설정을 선택합니다.</li>
		<li>SMC 수축에 따라 ROI의 위치가 변경되면 분석 > Ca2+ 형광 강도 측정을 프레임별로 선택합니다.</li>
		<li>SMC의 ROI가 이미지 스택에서 유사한 위치에 유지되면 이미지 > 스택을 선택>Ca2+ 형광 강도의 측정 스택을 선택합니다. 참고: 사용자 지정 작성된 매크로를 연결하여 SMC가 이미지 스택에서 수축과 함께 이동할 때 SMC 내의 ROI를 추적하고 프레임별로 ROI의 Ca2+ 강도(회색 값)를 자동으로 측정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+the+Ca2%2B+sensitivity+of+airway+smooth+muscle+cells+in+murine+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Modulation of the Ca2+ sensitivity of airway smooth muscle cells in murine lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Sanderson, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 10, 071795(2014).</li>
<li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li>
<li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2%2B+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li>
<li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li>
<li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li>
<li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NT4%2FTrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lung+tissue+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mouse lung tissue slice culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1940, 297-311 (2019).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD38+plays+an+age-related+role+in+cholinergic+deregulation+of+airway+smooth+muscle+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">CD38 plays an age-related role in cholinergic deregulation of airway smooth muscle contractility.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 6749 (21), 01760-01767 (2021).</li>
<li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li>
<li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li>
<li>Mondoñedo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566(2020).</li>
<li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li>
<li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li>
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PCLS의 준비에는 몇 가지 중요한 단계가 포함됩니다. 첫째, 고르지 않은 아가로스 분포로부터 조직 경화의 변화를 피하기 위해 폐 엽을 균질하게 팽창시키는 것이 필수적이다. 액체 아가로스가 37°C 이하의 온도에서 얇은 카테터 또는 기도에서 빠르게 겔화됨에 따라, 원위 폐 필드의 결과적인 충전 결함은 폐 조직 강성의 불균형을 증가시키고 비브라톰 섹션 동안 조직 찢어짐을 야기할 수 있다. 따라서, 저융점 아가로스 용액을 수조에서 42°C로 유지하고 해부 테이블에서 가열 램프를 사용하여 빠른 아가로오스 겔화를 피하기 위해 실시할 수 있다. 빠른 주사는 더 높은 순응도를 가진 폐 실질에 더 많은 아가로스를 밀어 넣을 수 있으므로 피할 필요가 있습니다. 수동 아가로스 주사는 보통 약 5-7 초가 걸립니다. 둘째, 아가로스 주입의 끝에서 필요한 단계는 소량의 공기(∼0.2 mL)를 밀어 전도성 기도로부터 원위 폐포 공간으로 아가로오스를 플러시하는 것이다. 그렇지 않으면, 아가로스는 젤을 만들고 기도 수축에 저항하기 위해 루멘에 머무를 것...

평활근 세포 (SMC)는 폐의 주요 구조 세포 유형으로, 주로기도와 폐 혈관의 배지 벽에 상주합니다. SMC는 발광 구경을 변경하여 공기와 혈류를 조절하는 계약을 체결합니다 1,2. 따라서 SMC의 수축 조절은 공기 환기 및 폐 순환의 항상성을 유지하는 데 필수적입니다. 대조적으로, 비정상적인 SMC 수축성은 천식 및 폐 동맥 고혈압과 같은 폐쇄성 기도 또는 폐 혈관 질환을 유발합니다. 그러나, 폐 SMCs의 기능적 평가는 폐 조직, 특히 폐 2,3의 원위 부분에서의 작은 기도 및 미세혈관에 대한 제한된 접근에 의해 도전 받고 있다. 현재의 솔루션은 기도 수축을 반영하기 위해 Flexivent에 의한 기류 저항을 측정하고, 폐 혈관 수축을 평가하기 위해 우심 카테터 삽입에 의한 폐 동맥 혈압을 검사하는 것과 같은 간접 분석에 의존합니다 4,5. 그러나, 이러한 간접 분석은 구조적 요인에 의해 혼동되고, 전체 폐 규모6,7에서 기도 또는 혈관 반응의 공간적 다양성을 포착하지 못하고, 세포 수준에서 수축 조절에 대한 기계론적 연구에 부적합하다는 것과 같은 여러 단점을 갖는다. 따라서, 단리된 일차 세포, 기관지/기관지 근육 스트립(8,9) 또는 큰 혈관 세그먼트(10)를 사용하는 대안적인 접근법이 시험관내 SMC 연구를 위해 적용되었다. 그럼에도 불구하고 이러한 방법에도 한계가 있습니다. 예를 들어, 배양 조건(11,12)에서 일차 SMCs의 빠른 표현형 적응은 세포 배양으로부터 생체내 설정으로 소견을 추정하는 것을 문제시한다. 또한, 단리된 근위 기도 또는 혈관 세그먼트 내의 SMCs의 수축성 표현형은 원위 폐 6,7에서 SMCs를 나타내지 않을 수 있다. 또한, 조직 수준에서의 근육력 측정은 수축 조절에 대한 기계론적 통찰력에 필수적인 분자 및 세포 사건과 분리되어 있습니다.
살아있는 폐 조직 절편인 정밀 절단 폐 절편(PCLS)은 근적외선 미세환경(즉, 보존된 다세포 구조 및 상호작용)13에서 폐 SMC를 특성화하기 위한 이상적인 생체외 도구를 제공한다. Placke 박사와 Fisher 박사는 1980 년대14,15 년대에 아가로스 팽창 쥐와 햄스터 폐에서 폐 조각의 제조를 처음 도입 한 이래로,이 기술은 PCLS에 생물 의학 연구를위한 더 높은 품질과 더 큰 다양성을 제공하기 위해 지속적으로 발전해 왔습니다. 한 가지 중요한 개선은 기관을 통한 아가로오스로 인한 폐 인플레이션 외에도 젤라틴 주입에 의한 폐 동맥 보존의 향상입니다. 그 결과, 기도 및 폐동맥 둘 모두는 생체외 평가(16)를 위해 PCLS에서 온전하게 유지된다. 또한, PCLS는 문화에서 오랜 시간 동안 실행 가능합니다. 예를 들어, 마우스 PCLSs는 배양에서 최소 12일 동안 세포 생존력 및 대사에 큰 변화가 없었으며, 뿐만 아니라,17일까지 7일 동안 기도 수축성을 유지하였다. 또한 PCLS는 수축 및 이완 분석을 위해 다양한 크기의 기도 또는 혈관을 유지합니다. 더욱이, 세포 수축성의 결정인자인 SMCs의 세포내 Ca2+ 신호전달은 공초점 또는2-광자 현미경(13)에 의해 이미지화된Ca2+ 리포터 염료로 검정될 수 있다.
폐 연구에서 마우스 모델의 광범위한 적용을 고려할 때, 생체외 폐 연구를 위해 무손상 기도 및 폐동맥을 갖는 마우스 PCLS를 제조하기 위한 상세한 프로토콜이 여기에 기술되어 있다. 준비된 PCLS를 사용하여, 우리는 수축성 또는 이완제 자극에 대한기도 및 폐 동맥 반응을 평가하는 방법을 후속 시연했습니다. 또한, PCLS를 Ca2+ 리포터 염료로 로딩한 다음, 수축성 또는 이완제 반응과 관련된 SMCs의Ca2+ 신호전달을 이미징하는 방법이 또한 기재되어 있다.

<table><tbody><tr><td>1mL 주사기</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>15mL 멸균 원심분리기 튜브</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>3mL 주사기</td><td>BD</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>50mL 멸균 원심분리기 튜브</td><td>Celltreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>아세틸-베타-메타콜린</td><td>Millipore Sigma</td><td>62-51-1</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항균성</td><td>열 Fisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>CCD 카메라</td><td>Nikon</td><td>Nikon Ds-Ri2 카메라</td><td></td></tr><tr><td>커버 안경</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td><td></td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>맞춤형 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경</td><td></td><td></td><td>참조 18</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-092-CM</td><td></td></tr><tr><td>엔도텔린 1</td><td>밀리포어 시그마</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>미세 해부 가위</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9702861</td><td></td></tr><tr><td>냉동 용기</td><td>시그마-알드리치</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>돼지 껍질의 젤라틴</td><td>시그마-알드리치</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>14025092</tr><tr><td>지혈 집게</td>자 <td>Fisher Scientific</td><td>16-100-117</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>High vaccum silicone grease</td><td>Fisher Scientific</td><td>146355d</td><td></td></tr><tr><td>이소프로필 알코올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>금속 와셔</td><td>Home Depot Product Authority</td><td>800442</td><td>Everbilt Flat Washers #10</td></tr><tr><td>Micro-dissecting forcep</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>Needle 두피 정맥 세트 (25 G)</td><td>EXELINT</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>NOC-5</td><td>Cayman Chemical</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>나일론 메쉬</td><td>부품 공급</td><td>U-CMN-300</td><td></td></tr><tr><td>Oregon green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Life Technologies</td><td>o-6807</td><td></td></tr><tr><td>위상차 현미경</td><td>니콘</td><td>니콘 이클립스 TS 100</td><td></td></tr><tr><td>플루로닉 F-127</td><td>써모 피셔</td><td>P-6867</td><td></td></tr><tr><td>면도날</td><td>페르소나</td><td>페르소나 양날 면도날 흰색 포장지 100 카운트</td>설포브로모프탈레인 시그마-알드리치 S0252 초강력 접착제 크레이지 글루 크레이지 글루, 다목적 초순수 저 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 융점 아가로스</td><td>Thermo Fisher</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Precisionary</td><td>VF 310-0Z</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome 냉각 블록</td><td>Precisionary</td><td>SKU-VM-CB12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome 시편 튜브</td><td>Precisionary</td><td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Y형 IV 카테터</td><td>BD</td><td>383336</td><td>BD Saf-T-Intima 폐쇄형 IV 카테터</td></tr></tbody></table>

정밀 절단 폐 슬라이스를 활용하여 기도 및 폐 동맥 평활근의 수축 조절 연구

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

평활근 세포 (SMC)는기도와 폐 동맥의 수축을 매개하여 기류 저항과 폐 순환을 각각 수정하므로 폐 시스템의 항상성에 중요한 역할을합니다. SMC 수축성의 규제 완화는 천식 및 폐 고혈압을 포함한 여러 폐 질환에 기여합니다. 그러나, 제한된 조직 접근과 생체내 SMC 표현형을 유지하기 위한 배양 시스템의 부족으로 인해, 이들 질환에서 탈조절된 SMC 수축성의 기초가 되는 분자 메커니즘은 완전히 확인된 채로 남아 있다. 정밀 절단 폐 슬라이스 (PCLS)는 이러한 기술적 어려움을 우회하는 생체 외 모델을 제공합니다. 살아있는 얇은 폐 조직 절편으로서 PCLS는 자연 환경에서 SMC를 유지하고 SMC 수축을 조절하는 SMC 수축 및 세포 내 Ca2+ 신호전달의 현장 추적을 허용합니다. 여기에서, 상세한 마우스 PCLS 준비 프로토콜이 제공되며, 이는 온전한 기도 및 폐동맥을 보존한다. 이 프로토콜은 폐 엽을 슬라이스하기 전에 두 가지 필수 단계를 포함합니다 : 기관을 통해 저융점 아가로오스로기도를 팽창시키고 우심실을 통해 젤라틴으로 폐 혈관을 채우십시오. 이 프로토콜을 사용하여 제조된 PCLS는 기도 및 폐내 동맥 구획 모두에서 SMC의Ca2+ 매개 수축 조절을 평가하기 위한 생물 검정에 사용될 수 있습니다. 호흡기 질환의 마우스 모델에 적용될 때,이 프로토콜은 SMC의 기능적 조사를 가능하게하여 질병에서 SMC 수축성 조절 완화의 기본 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.

온전한 폐내 기도와 동맥을 보존하는 마우스 PCLS 제제 150 μm 두께의 PCLS를 반전된 위상차 현미경 하에서 관찰하였다. 마우스 폐에서 전도성 기도는 폐동맥을 동반하며, 힐러스에서 말초 폐까지 이어집니다. 마우스 PCLS에서 대표적인 폐기도-동맥 다발이 도 2B에 도시되어 있다. 기도는 루멘의 내부 표면을 감싸는 활성 실리얼 박동을 가진 입방체 상피 세포에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 대조적으로, 근처의 폐동맥은 편평한 내피에 의해 특징지어진다. 말초 폐장에 도달하면, 전도성 기도는 호흡 덕트와 낭으로 분기하여 작은 acinar 세동맥을 둘러 쌉니다 (그림 2C).
마우스 PCLS를 활용하여 폐기도 및 동맥 수축 평가 메타콜린(MCh, 1 μM) 유도 기도 수축은 <strong class="xfi...

본 프로토콜은 거의 생체내 환경에서 기도 및 폐 내 동맥 평활근 수축성을 평가하기 위해 마우스 정밀 절단된 폐 절편을 준비 및 활용하는 것을 기술한다.

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

PCLS는 거의 손상되지 않은 조직 환경에서기도 및 혈관 평활근 세포 활성의 평가를 지원하여 폐 연구를위한 귀중한 생체 외 모델을 제공합니다. 평활근 연구의 용어로, 정밀 절단 폐 조각은 평활근 세포의 생체 내 표현형과 주변 구조와의 상호 작용을 보존하면서 평활근 세포에 대한 접근을 허용하며, 이는 세포 수준에서 기계론적 연구에 중요합니다. 시작하려면 마우스 몸체를 수핀 위치의 해부 보드에 놓습니다.꼬리, 앞발 및 머리를 25G 주사기 바늘로 고정하고 70 % 에탄올로 몸을 살균하십시오. 흉강을 따라 조심스럽게 흉강을 열고 횡격막 위의 양측 열등한 흉곽을 엽니 다. 그런 다음 날카로운 가위 끝을 폐 조직에서 멀어지게하고 양측 복부 흉곽의 일부를 제거하여 심장을 노출시킵니다.흉강이 열리면 폐 엽이 붕괴되는 것을 관찰하십시오. 가위를 사용하여 마우스 목의 연조직을 제거하여 기관을 노출시킵니다. 기관의 상단부에서 직경 1.2 밀리미터의 작은 구멍을 만들어 20G Y 자형 IV 카테터 팁을 통과시켜야합니다.Y자형 카테터의 어댑터 포트 하나를 0.5밀리리터의 공기로 미리 채워진 3밀리리터 주사기로 연결하고, 다른 포트에는 섭씨 42도까지 가온된 1.5%agarose 용액 2밀리리터가 미리 채워진 3밀리리터 주사기로 연결합니다. 카테터를 채우기 위해 아가로스 용액을 주입 한 다음 카테터를 통해 기관 내로 5 ~ 8 밀리미터로 밀어 넣습니다. 천천히 아가로스 용액을 5 초 당 1 밀리리터의 속도로 주입하십시오.폐가 근위축에서 원위 축을 따라 확장되는 것을 관찰하십시오. 각 폐 엽의 가장자리가 팽창 될 때 주사를 중단하십시오. 그런 다음 다른 주사기에서 0.2 ~ 0.3 밀리리터의 공기를 주입하여 잔류 아가로스를 전도성 기도로 밀어 원위 폐포 공간으로 밀어 넣습니다.클립은 한 쌍의 곡선 지혈 포셉으로 기관을 닫았습니다. 폐 혈관 조직을 채우려면 따뜻한 6 % 젤라틴으로 1 밀리리터 주사기를 채우고 바늘 두피 정맥 카테터에 연결하십시오. 카테터에 젤라틴 용액을 채우고 바늘로 열등한 벽 가까이에서 우심실을 뚫습니다.바늘을 우심실에 2 ~ 3 밀리미터 동안 밀어 넣고 바늘 끝을 주요 폐동맥으로 향하게하십시오. 약 0.2 밀리리터의 젤라틴 용액을 우심실 및 폐 동맥 혈관에 천천히 주입하십시오. 주사 후 다섯 분 동안 바늘을 제자리에 유지하고 심장과 폐에 얼음처럼 차가운 HBSS 용액을 부어 폐 엽을 식히고 몸을 냉장고에 넣으십시오.이 단계 후, 가위로 주변 결합 조직에서 마우스 폐와 심장을 제거한다. 그런 다음 각 폐엽을 분리하고 얼음 위의 HBSS 용액에 보관하십시오. 폐 엽을 다듬고 절단 방향이 힐라에서 폐 표면까지의 대부분의 기도에 수직이 되도록 방향을 정합니다.슈퍼 접착제로 표본 기둥 위에 부착하십시오. 신선한 얇은 면도날이있는 비브라 톰을 사용하여 폐 엽을 150 마이크로 미터 조각으로 자릅니다. 차가운 HBSS 용액으로 미리 채워진 멸균 페트리 접시에 조각을 모으십시오.슬라이스를 DMEM/F-12 배지로 채워진 페트리 접시로 옮깁니다. 실험 전에 하룻밤 사이에 섭씨 37도 인큐베이터에 접시를 놓습니다. 단일 정밀 절단된 폐 슬라이스를 HBSS로 채워진 24웰 배양 플레이트의 각 웰에 배치한다.우물 중앙에서 슬라이스를 찾은 다음 피펫으로 HBSS 용액을 제거하십시오. 현미경으로 슬라이스에서 대상 기도와 용기를 찾은 다음 미리 절단된 중앙 구멍이 있는 나일론 메쉬를 사용하여 덮어 표적 기도 용기 영역을 노출시킵니다. 메쉬 위에 중공 금속 세탁기를 올려 조각을 제자리에 고정시킵니다.그런 다음 600 마이크로 리터의 HBSS 용액을 첨가하여 조각을 잠급니다. 10분 후에 기준 이미지를 기록합니다. 기도 또는 혈관 수축을 유도하려면 피펫으로 HBSS 용액을 조심스럽게 제거하고 600 마이크로 리터의 HBSS를 작용제로 첨가하십시오.칼슘 염료 로딩 완충액을 제조하기 위해, 먼저 10 마이크로리터의 DMSO와 0.2 그램의 플루로닉 F-12 분말로 50 마이크로그램의 염료를 DMSO의 1 밀리리터에 용해시킨다. 10 마이크로리터의 플루로닉 용액과 10 마이크로리터의 칼슘 염료 용액을 섞는다. 이 혼합물을 200 마이크로 몰의 설포브로모프탈레인을 함유하는 HBSS 용액 2 밀리리터에 첨가한다.이어서, 15개의 정밀 절단된 폐 조각을 2밀리리터의 칼슘 로딩 완충액에 넣고, 섭씨 30도에서 1시간 동안 인큐베이션한 다음, 100마이크로몰 설포브로모프탈레인을 함유하는 HBSS에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음 칼슘 염료가 적재 된 조각을 큰 커버 유리에 놓습니다. 18G 무딘 바늘 또는 200 마이크로리터 피펫 팁에 부착된 3밀리리터 주사기에 고진공 실리콘 그리스를 채우고 슬라이스 위와 아래에 커버 글라스를 가로질러 두 개의 평행선을 그립니다.두 그리스 라인 사이에 나일론 메쉬를 사용하여 슬라이스를 덮습니다. 두 번째 커버 글라스를 메쉬 위에 올려 놓고 챔버를 생성합니다. HBSS 또는 작용제 용액을 피펫으로 한쪽 끝에서 챔버에 첨가하십시오.티슈 페이퍼로 다른 쪽 끝에서 흡입하여 챔버에서 유체를 제거하십시오. 슬라이스의 챔버는 이제 고속 레이저 스캐닝 공초점 현미경으로 칼슘 이미징을 할 준비가되었습니다. 폐기도 동맥 다발은 위상차 현미경 하에서 두께 150 마이크로미터의 정밀 절단된 폐 조각에서 관찰되었다.휴지 상태에서, 기도는 근처의 폐동맥을 가진 입방체 상피 세포에 의해 확인되었다. 메타콜린에 노출된 후, 발광 영역은 감소하였고, 폐동맥은 자극에 대한 반응을 보이지 않았다. 기도 수축성 반응은 발광 면적 감소의 백분율에 의해 정량화되었고, 하루 및 오일 배양에서 유사한 용량 의존적 반응을 보였다.말초 폐장에 도달하면, 전도성 기도는 호흡 덕트와 작은 acinar 세동맥을 둘러싸는 주머니로 분기합니다. 내피에 노출되면 기도와 폐동맥 모두 수축되고, 이어서 NOC-5가 이완을 유도한다. 휴지 상태에서, 칼슘 염료가 로딩된 슬라이스는 공초점 형광 현미경 하에서 기도 및 혈관 시스템의 평활근 세포에서 낮은 형광을 보였다.작용제에 노출되면, 칼슘 형광 강도는 세포에서 상승하고 발진 신호와 상관 관계가있는 전체 세포로 전파되었습니다. 현명한 기술은, 아가로오스로 폐를 균질하게 팽창시키고 빠르거나 과도한 아가로스 주사를 피하는 것이 필수적입니다. 항상 끝에 공기를 밀어 전도성 기도에서 원위 폐포 공간으로 아가로스를 플러시합니다.요약하면, 정밀-절단된 폐 슬라이스 배양물을 사용하여, 특수한 다양한 폐 평활근 기능을 제공하고 시험관내에서 평활근 조절 완화를 모델링할 수 있다. 또한 novo 혈관 확장 또는 기관지 확장제 약물을 스크리닝하는 이상적인 플랫폼을 제공합니다.

utilizing-precision-cut-lung-slice-to-study-contractile-regulation

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

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Murine 정밀 절단 폐 슬라이스를 사용하여 폐 내 동맥의 저산소 폐 혈관 수축의 비디오 형태 측정 분석

우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

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