Name: 동적 세포 배양을 위한 출구 분별과 통합된 다중 스트림 관류 생물반응기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T13:45:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 학습하세요 다중 스트림 관류 생물반응기를 이용한 동적 세포 배양 방법으로, 저비용으로 분비 및 흡수 동역학을 측정하고 세포에 시간 변화 자극을 적용할 수 있습니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 연구는 그랜트 번호 (Grant Nos)의 지원을 받아 수행되었습니다. 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 R01EB012521, R01EB028782 및 T32 GM008339.

<ol><li>Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+of+individual+fibroblasts+reveals+persistent%2C+independently+phased+circadian+rhythms+of+clock+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression.</a> Current Biology. 14 (24), 2289-2295 (2004).</li>
<li>Talaei, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mathematical+model+of+the+dynamics+of+cytokine+expression+and+human+immune+cell+activation+in+response+to+the+pathogen+Staphylococcus+aureus%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A mathematical model of the dynamics of cytokine expression and human immune cell activation in response to the pathogen Staphylococcus aureus.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, 711153(2021).</li>
<li>Kemas, A. M., Youhanna, S., Zandi Shafagh, R., Lauschke, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-dependent+glucose+consumption+dynamics+in+3D+primary+human+liver+cultures+measured+by+a+sensitive+and+specific+glucose+sensor+with+nanoliter+input+volume%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Insulin-dependent glucose consumption dynamics in 3D primary human liver cultures measured by a sensitive and specific glucose sensor with nanoliter input volume.</a> FASEB Journal. 35 (3), 21305(2021).</li>
<li>Muzzey, D., van Oudenaarden, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+time-lapse+fluorescence+microscopy+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative time-lapse fluorescence microscopy in single cells.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 25, 301-327 (2009).</li>
<li>Calligaro, H., Kinane, C., Bennis, M., Coutanson, C., Dkhissi-Benyahya, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+standardized+method+to+assess+the+endogenous+activity+and+the+light-response+of+the+retinal+clock+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">A standardized method to assess the endogenous activity and the light-response of the retinal clock in mammals.</a> Molecular Vision. 26, 106-116 (2020).</li>
<li>Battat, S., Weitz, D. A., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+outlook+on+microfluidics%3A+the+promise+and+the+challenge%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">An outlook on microfluidics: the promise and the challenge.</a> Lab on a Chip. 22 (3), 530-536 (2022).</li>
<li>Petrenko, V., Saini, C., Perrin, L., Dibner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+measurement+of+circadian+clock+gene+expression+and+hormone+secretion+in+human+primary+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Parallel measurement of circadian clock gene expression and hormone secretion in human primary cell cultures.</a> Journal of Visualized Experiments. (117), e54673(2016).</li>
<li>Yamagishi, K., Enomoto, T., Ohmiya, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-culture-based+secreted+bioluminescence+reporter+assay+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Perfusion-culture-based secreted bioluminescence reporter assay in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 354 (1), 15-21 (2006).</li>
<li>Watanabe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multichannel+perfusion+culture+bioluminescence+reporter+system+for+long-term+detection+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Multichannel perfusion culture bioluminescence reporter system for long-term detection in living cells.</a> Analytical Biochemistry. 402 (1), 107-109 (2010).</li>
<li>Murakami, N., Nakamura, H., Nishi, R., Marumoto, N., Nasu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+circadian+oscillation+of+melatonin+release+in+pineal+cells+of+house+sparrow%2C+pigeon+and+Japanese+quail%2C+using+cell+perfusion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of circadian oscillation of melatonin release in pineal cells of house sparrow, pigeon and Japanese quail, using cell perfusion systems.</a> Brain Research. 651 (1-2), 209-214 (1994).</li>
<li>Erickson, P., Houwayek, T., Burr, A., Teryek, M., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+continuous+flow+cell+culture+system+for+precision+cell+stimulation+and+time-resolved+profiling+of+cell+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A continuous flow cell culture system for precision cell stimulation and time-resolved profiling of cell secretion.</a> Analytical Biochemistry. 625, 114213(2021).</li>
<li>Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSaltzman%2C+WM+%22Drug+Delivery%3A+Engineering+Principles+for+Drug+Therapy%22">Drug Delivery: Engineering Principles for Drug Therapy</a>. , Oxford University Press. (2001).</li>
<li>Fogler, H. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFogler%2C+HS+%22Elements+of+Chemical+Reaction+Engineering.+4th+edn%22">Elements of Chemical Reaction Engineering. 4th edn</a>. , Prentice Hall PTR. Boston. (2006).</li>
<li>Conesa, J. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aConesa%2C+JA+%22Chemical+Reactor+Design%3A+Mathematical+Modeling+and+Applications%22">Chemical Reactor Design: Mathematical Modeling and Applications</a>. , Wiley. (2019).</li>
<li>Toson, P., Doshi, P., Jajcevic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Explicit+residence+time+distribution+of+a+generalised+cascade+of+continuous+stirred+tank+reactors+for+a+description+of+short+recirculation+time+%28bypassing%29%5BTitle%5D)+AND+%22Processes%22%5BJournal%5D)">Explicit residence time distribution of a generalised cascade of continuous stirred tank reactors for a description of short recirculation time (bypassing).</a> Processes. 7 (9), 615(2019).</li>
<li>Tamayo, A. G., Shukor, S., Burr, A., Erickson, P., Parekkadan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+leukemic+T-cell+transcriptional+dynamics+in+vivo+with+a+blood-based+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Tracking leukemic T-cell transcriptional dynamics in vivo with a blood-based reporter assay.</a> FEBS Open Biology. 10 (9), 1868-1879 (2020).</li>
<li>Newell, B., Bailey, J., Islam, A., Hopkins, L., Lant, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterising+bioreactor+mixing+with+residence+time+distribution+%28RTD%29+tests%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Characterising bioreactor mixing with residence time distribution (RTD) tests.</a> Water Science and Technology. 37 (12), 43-47 (1998).</li>
<li>Dubois, J., Tremblay, L., Lepage, M., Vermette, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+dynamics+within+a+bioreactor+for+tissue+engineering+by+residence+time+distribution+analysis+combined+with+fluorescence+and+magnetic+resonance+imaging+to+investigate+forced+permeability+and+apparent+diffusion+coefficient+in+a+perfusion+cell+culture+chamber%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Flow dynamics within a bioreactor for tissue engineering by residence time distribution analysis combined with fluorescence and magnetic resonance imaging to investigate forced permeability and apparent diffusion coefficient in a perfusion cell culture chamber.</a> Biotechnology and Bioengineering. 108 (10), 2488-2498 (2011).</li>
<li>Gaida, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+and+gas+residence+time+distribution+in+a+two-stage+bioreactor+with+cell+recycle%5BTitle%5D)+AND+%22HAL+Open+Science%22%5BJournal%5D)">Liquid and gas residence time distribution in a two-stage bioreactor with cell recycle.</a> HAL Open Science. , (2008).</li>
<li>Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wave+characterization+for+mammalian+cell+culture%3A+residence+time+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22New+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Wave characterization for mammalian cell culture: residence time distribution.</a> New Biotechnology. 29 (3), 402-408 (2012).</li>
<li>Olivet, D., Valls, J., Gordillo, M. A., Freixó, A., Sánchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+residence+time+distribution+technique+to+the+study+of+the+hydrodynamic+behaviour+of+a+full-scale+wastewater+treatment+plant+plug-flow+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chemical+Technology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Application of residence time distribution technique to the study of the hydrodynamic behaviour of a full-scale wastewater treatment plant plug-flow bioreactor.</a> Journal of Chemical Technology and Biotechnology. 80 (4), 425-432 (2005).</li>
</ol>

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

이 작업은 TNF-α의 일시적인 펄스에 반응하여 NF-κB 구동 유전자 발현의 역학이 측정되는 구체적인 예와 함께 입증된 다수의 배지 공급원을 갖는 관류 세포 배양 시스템의 조립 및 작동을 기술한다. 관류 시스템 성분의 RTD를 측정하고 모델링하고, 신호 컨볼루션을 사용하여 수집된 유출수 배지 분획에서의 TNF-α 펄스에 대한 세포의 노출과 TNF-α 분포를 모두 예측하였다. 세포를 펄스에 노출시키고, 분획을 40시간 동안 수집하였고, 그 후 GLuc를 분획에서 측정하고, 자극-반응 동α동성을 밝히기 위해 예측된 TNF- 신호와 함께 플롯팅하였다.
이 관류 방법은 단점이없는 것은 아닙니다. 특히, 시스템은 인큐베이터 내에 설치된 후 튜브가 웰 플레이트에 연결되는 중요한 간단한 단계로 인해 멸균 위험을 수반합니다. 저자의 경험에서 오염은 매우 드뭅니다. 그럼에도 불구하고 오염 위험은 다음과 같은 방법으로 완화 될 수 있습니다. 첫 번째는 생물 안전 캐비닛에서 모든 세포 처리 절차 ...

많은 중요한 생물학적 과정은 세포 및 조직 배양물에서 분 내지 시간 1,2,3의 시간 척도에서 일어난다. 이러한 현상 중 일부는 타임랩스 현미경4, 생체발광1 또는 기타 방법을 사용하여 자동화된 방식으로 관찰되고 기록될 수 있지만, 화학 분석을 위해 배양 상등액 샘플의 수집을 포함하는 실험은 종종 정적 세포 배양물에서 수동으로 수행됩니다. 수동 샘플링은 빈번한 또는 근무 후 샘플링 시간대의 불편 함으로 인해 특정 연구의 실현 가능성을 제한합니다. 정적 배양 방법의 또 다른 단점은 화학 자극에 대한 통제되고 일시적인 노출을 포함하는 실험을 포함한다. 정적 배양에서, 자극은 수동으로 추가 및 제거되어야 하며, 자극 프로파일은 시간에 따른 단계 변화로 제한되는 반면, 배지 변경은 또한 통제되지 않는 방식으로 세포에 영향을 미칠 수 있는 다른 배지 성분을 추가 및 제거한다5. 유체 시스템은 이러한 문제를 극복 할 수 있지만 기존 장치는 다른 문제를 제기합니다. 미세 유체 장치는 생산 및 사용을위한 특수 장비 및 교육의 엄청난 비용을 수반하며, 샘플을 처리하기 위해 미세 분석 방법이 필요하며 관류 후 세포가 장치에서 복구하기가 어렵습니다6. 7,8,9,10에 설명 된 실험 유형을 위해 매크로 유체 시스템이 거의 만들어지지 않았으며 사내에서 제작 된 여러 맞춤형 부품으로 제작되었으며 여러 펌프 또는 분수 수집기가 필요합니다. 또한, 저자들은 현탁 배양을 위한 교반 탱크 생물반응기 이외의 상업적으로 이용가능한 거대유체 관류 세포 배양 시스템을 알지 못하지만, 이는 생리학을 모델링하고 연구하기 위해 설계되지는 않았지만, 바이오제조에 유용하다.
저자들은 이전에 거의 전적으로 상업적으로 이용가능한 부분들(11)로 구성된 저비용 관류 생물반응기 시스템의 설계에 대해 보고하였다. 시스템의 기본 버전은 웰 플레이트의 여러 배양물을CO2 인큐베이터에 보관하고 시린지 펌프의 배지와 지속적으로 관류할 수 있게 하며, 배양물로부터의 유출 배지 스트림은 맞춤형 변형을 통해 분획 수집기를 사용하여 시간이 지남에 따라 샘플로 자동 분획됩니다. 따라서, 이 시스템은 배양 배지 상청액의 자동 샘플링 및 시간에 따른 배양물에 대한 연속 용질 투입을 가능하게 한다. 이 시스템은 거대 유동적이고 모듈식이며 새로운 실험 설계의 요구를 충족시키기 위해 쉽게 수정할 수 있습니다.
여기에 제시된 방법의 전반적인 목표는 시간에 따른 세포에 의한 물질의 분비 또는 흡수 속도가 측정되고 / 또는 세포가 정확하고 일시적인 용질 신호에 노출되는 실험을 가능하게하는 관류 세포 배양 시스템을 구성, 특성화 및 사용하는 것입니다. 이 비디오 기사에서는 단일 주사기 펌프와 변형된 분획 수집기를 사용하여 최대 여섯 개의 세포 배양물을 동시에 관류할 수 있는 기본 설정을 조립하는 방법을 설명합니다. 짧은 펄스 및 약동학 유사 프로파일(12)을 포함하는 세포를 일시적인 용질 농도 신호에 노출시키는 실험을 허용하기 위해 추가적인 펌프 및 부품을 사용하는 베이스 시스템 상의 두 가지 유용한 변이체가 또한 도 1에 제시된다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig01.jpg"> 그림 1: 관류 시스템 설계의 세 가지 변형 . (Top) 기본 관류 시스템. (중간) 여러 매체 소스에 대한 스톱콕이있는 관류 시스템. (하단) 교반된 탱크를 갖는 관류 시스템은 잘 혼합된 부피의 분포를 모방한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
흐름 내의 분산 및 확산으로 인해 용질 신호는 흐름 시스템을 통과 할 때 왜곡되거나 "번짐"됩니다. 이러한 왜곡은 체류 시간 분포(RTD)13의 사용을 통해 정량화될 수 있다. 이 문서에서는 관류 시스템의 구성 요소에 대한 추적기 실험을 수행하는 방법을 설명하고(그림 2), 측정된 데이터에서 RTD를 생성하는 MATLAB 스크립트를 제공합니다. 이 분석에 대한 자세한 설명은 저자의 이전 논문11에서 찾을 수 있습니다. 추가적인 MATLAB 스크립트는 RTD에 적절한 기능을 적합시키고 물리적 파라미터를 추출하고, RTD를 사용하여 신호 컨볼루션을 수행하여 사용자에 의해 입력된 용질 신호가 관류 시스템(14)을 통해 어떻게 전파되고 왜곡되는지를 예측한다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63935/63935fig02.jpg"> 그림 2: 체류 시간 분포. 이 튜브 길이와 같은 흐름 시스템 구성 요소의 RTD는 트레이서의 펄스를 시스템에 입력하고 수집 된 분획으로 빠져 나올 때까지 "번짐"을 측정하여 측정됩니다. 이 수치는 Erickson et al.11에서 수정되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63935/63935fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>18 게이지 1 1/2 인치 주사기 및 디스펜싱 기계용 일회용 프로브 바늘</td><td>Grainger</td><td>5FVK2</td><td></td></tr><tr><td>293T 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>HEK 293T 셀은 대표 결과 실험에 사용됩니다.</td></tr><tr><td>96-Well Clear Bottom Plates, Corning</td><td>VWR</td><td>89091-010</td><td>Plates는 RTD 실험에서 염료 농도를 측정하기 위한 것이고 대표적인 결과 실험에서 GLuc을 위한 것입니다.</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Luer-Lok 팁이 있는 일회용 주사기, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-829-45</td><td></td></tr><tr><td>BioFrac 분획 수집기&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>7410002</td><td>단일 스트림에 사용하거나 여러 스트림에서 수집할 수 있도록 당사의 방법을 사용하여 수정할 수 있는 분획 수집기입니다.</td></tr><tr><td>투명 고강도 자외선 저항성 아크릴 12" x 12" x 1/8"</td> <td>McMaster-Carr</td><td>4615T93</td><td>이 시트는 보조 자료의 DXF 파일에 따라 레이저 커터를 사용하여 절단하여 BioFrac 분획 수집기에 부착할 수 있는 다중 헤드 디스펜서를 생성합니다.</td></tr><tr><td>대표적인 결과에서 Gaussia luciferase bioluminescence assay에 사용된</td> <td>Coelenterazine native</td><td>NanoLight Technology</td><td>303</td> 기판.</tr><tr><td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates, 크기 48&nbsp; 웰, 폴리스티렌 플레이트, 평평한 바닥 웰</td><td>Millipore Sigma</td><td>CLS3548</td><td>대표적인 결과에서 293T 세포를 성장시키고 관류하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>코닝&nbsp; Costar Flat Bottom Cell Culture Plates, 크기 12</td>웰 <td>Fisher Scientific</td><td>720081</td><td>관류 시 약동학 프로파일을 생성하기 위해 플러그를 꽂고 교반 탱크로 사용할 수 있습니다. 관류를 위해 세포를 포함할 수도 있습니다.</td></tr><tr><td>DMEM, 고포도</td>당 <td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Epilog Zing 24 레이저</td><td>커팅 엣지 시스템</td><td>Epilog Zing 24</td><td>아크릴 시트에서 멀티 헤드 디스펜서를 생산하는 데 사용되는 레이저 커터. 다른 레이저 절단기가 사용될 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 멸균 주사기, Luer-Lock, 20mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-460</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 일회용 멸균 주사기, Luer-Lock, 60mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-461</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 프리미엄 마이크로 원심분리기 튜브: 1.5mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td>분획 수집용 마이크로 원심분리기 튜브.</td></tr><tr><td>피셔브랜드&nbsp; 일반 끝이 있는 둥근 바닥 일회용 붕규산 유리관</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-26</td><td>분획 수집용 유리관.</td></tr><tr><td>피셔브랜드&nbsp; SureOne 마이크로포인트 피펫 팁, 범용 핏, 비필터</td><td>Fisher Scientific</td><td>2707410</td><td>디스펜싱 팁 역할을 하는 멀티 헤드 디스펜서 및 튜빙에 가장 잘 맞는 300ul 피펫 팁.</td></tr><tr><td>기코&nbsp; DPBS, 분말, 칼슘 없음, 마그네슘 없음</td><td>Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td>인산염 완충 식염수.</td></tr><tr><td>Labline 4625 Titer Shaker</td><td>Marshall Scientific</td><td>Labline 4625 Titer Shaker</td><td>교반 탱크를 혼합 상태로 유지하는 데 사용되는 궤도 셰이커.</td></tr><tr><td>Masterflex 피팅, 폴리카보네이트, 4방향 스톱콕, 수 루어 잠금, 비멸균; 10/PK</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-30600-04</td><td>RTD 실험 및 세포 배양 실험을 위해 여러 입구 스트림을 결합하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>Masterflex 피팅, 폴리카보네이트, 스트레이트, 여성 루어 x 캡; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>UX-45501-28</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 피팅, 폴리프로필렌, 스트레이트, 암 루어-호스바브 어댑터, 1/16"</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45508-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 피팅, 폴리프로필렌, 스트레이트, 남성 루어 잠금 장치에서 호스바브 어댑터, 1/16" ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-45518-00</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex 피팅, 폴리프로필렌, 스트레이트, 플러그 어댑터에 대한 수 루어 잠금; 25/PK</td><td>Masterflex</td><td>EW-30800-30</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S 정밀 펌프 튜빙, 백금 경화 실리콘, L/S 14; 25피트</td><td>Masterflex</td><td>EW-96410-14</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2019b</td><td>버전 R2019b. 최신 버전도 사용할 수 있습니다. 일부 이전 버전이 작동할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>NE-1600 6채널 프로그래밍 가능한 주사기 펌프</td><td>New Era 펌프 시스템</td><td>NE-1600</td><td></td></tr><tr><td>랙 세트 F1</td><td>Bio-Rad</td><td>7410010</td><td>랙은 분획 수집기에 수집 튜브를 고정합니다.</td></tr><tr><td>재조합 인간 TNF-알파(HEK293 발현) 단백질, CF</td><td>Bio-Techne</td><td>10291-TA-020</td><td>사이토카인은 293T 세포를 자극하는 데 사용되었습니다.</td></tr><tr><td>Saint Gobain 솔리드 스토퍼, Versilic 실리콘, 크기: 00, 바닥 10.5mm</td><td>Saint Gobain</td><td>DX263015-50</td><td>48-well 플레이트에 맞습니다.</td></tr><tr><td>Saint Gobain 솔리드 스토퍼, Versilic 실리콘, 크기: 4 바닥 21mm</td><td>Saint Gobain</td><td>DX263027-10</td><td>12-웰 플레이트에 맞습니다.</td></tr><tr><td>수산화 나트륨, 10.0 N 수용액 APHA; 1 L</td><td>Spectrum Chemicals</td><td>S-395-1LT</td><td></td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systems</td><td>멀티</td><td>헤드 디스펜서 DXF 파일을 만드는 데 사용되는 SolidWorks CAD 소프트웨어.</td></tr><tr><td>Varioskan LUX 멀티모드 마이크로플레이트 리더</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td>플레이트 리더.</td></tr><tr><td>Wilton Color Right Performance Color System Base Refill, Blue</td><td>Michaels</td><td>10404779</td><td>RTD 실험에서 추적자로 사용되는 Brilliant Blue FCF를 함유한 Blue 식품 염료. 흡광도 스펙트럼은 628nm에서 최고조에 달합니다.</td></tr></tbody></table>

동적 세포 배양을 위한 출구 분별과 통합된 다중 스트림 관류 생물반응기

Multi-Stream Perfusion Bioreactor Integrated with Outlet Fractionation for Dynamic Cell Culture

특정 세포 및 조직 기능은 기존의 배양 시스템에 의해 제대로 해결되지 않는 분에서 시간의 동적 시간 척도 내에서 작동합니다. 이 작업은 배양 배지를 세포 배양 모듈에 지속적으로 관류하고 다운스트림 모듈에서 분획하여이 규모의 역학을 측정 할 수있는 저비용 관류 생물 반응기 시스템을 개발했습니다. 이 시스템은 거의 전적으로 상업적으로 이용 가능한 부품으로 구성되며 병렬화되어 기존의 다중 웰 세포 배양 플레이트에서 동시에 독립적 인 실험을 수행 할 수 있습니다. 이 비디오 기사에서는 단일 다중 채널 주사기 펌프와 최대 여섯 개의 배양물을 병렬로 관류하기 위해 수정된 분획 수집기만 있으면 되는 기본 설정을 조립하는 방법을 보여 줍니다. 모듈형 설계에 유용한 변형이 또한 제시되어 용질 펄스 또는 약동학적 유사 프로파일과 같은 제어된 자극 역학을 허용한다. 중요한 것은 용질 신호가 시스템을 통과할 때 용질 분산으로 인해 왜곡된다는 것입니다. 또한, MATLAB을 사용하여 트레이서를 사용하여 관류 설정의 구성 요소의 체류 시간 분포(RTD)를 측정하는 방법이 설명된다. RTD는 다중 구획 시스템의 흐름에 의해 용질 신호가 어떻게 왜곡되는지 계산하는 데 유용합니다. 이 시스템은 매우 견고하고 재현 가능하므로 기본 연구원은 전문 제조 시설 없이도 쉽게 채택 할 수 있습니다.

상기 프로토콜의 섹션 5로부터의 다중 배지 공급원을 갖는 관류 시스템은 인간 배아 신장 293 (HEK293) 세포에서 활성화된 B 세포 (NF-κB) 전사 인자의 핵 인자 카파-경쇄 인핸서에 의해 구동되는 리포터 유전자의 발현 동역학을 측정하기 위해 사용되었고, 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α)의 1.5 h 펄스에 반응하였다. HEK293 세포는 가우시아 루시퍼라아제 (GLuc)를 함유하는 유전자 작제물을 갖는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 안정적으로 형질도입되었고, NF-κB 반응 요소를 함유하는 NFKB라는 프로모터에 의해 구동되어 NFKB-GLuc HEK293 세포를 생성하고, 형질도입된 세포를 분리하기 위해 형광 활성화 세포 분류 (FACS)를 통해 분류하였다. 분류된 세포는 사용 전까지 동결보존하였다.
각 관류 배양에 대해, 관류 셋업에는 세포를 포함하는 플러그형 48웰 플레이트로 이어지는 1m의 튜빙의 상류 섹션이 포함되었고, 이어서 0.5 mL/h(...

이 논문은 세포 과정에서 용질의 분비 및 흡수 속도의 역학을 측정하기 위한 저비용의 다채널 관류 세포 배양 시스템을 구축하고 운영하는 방법을 제시한다. 시스템은 또한 세포를 동적 자극 프로파일에 노출시킬 수 있다.

Certain cell and tissue functions operate within the dynamic time scale of minutes to hours that are poorly resolved by conventional culture systems. This ...

이 방법은 시간에 따라 분비 속도가 어떻게 변하는지, 그리고 세포가 시간에 따라 변화하는 고체 신호에 어떻게 반응하는지 이해하는 데 도움이됩니다. 이 기술의 주요 장점은 저렴한 비용으로 훈련이 거의 필요하지 않으며 새로운 실험에 profusion 시스템 설정을 적용 할 수 있다는 것입니다. 하나의 주사기를 배경 용액으로 채우고 첫 번째 주사기 펌프에로드하십시오.다른 주사기를 트레이서 용액으로 채우고 두 번째 주사기 펌프에 적재하십시오. 루어 커넥터를 사용하여 두 주사기를 네 방향 스톱콕의 세 포트 중 두 개에 연결합니다. 스톱콕을 배경 용액으로 닫고 트레이서 용액을 열린 포트에서 떨어질 때까지 스톱콕에 펌핑하십시오.펌프를 멈추고 주사기를 더 이상 조정하지 마십시오. 주사기 펌프 이동 막대가 주사기 플런저에 대해 위로 밀려 펌프가 시작될 때 즉시 흐름이 시작되도록하십시오. 트레이서 용액에 스톱콕을 닫고 모든 잔류 트레이서 용액이 열린 포트에서 플러시될 때까지 배경 용액을 스톱콕으로 펌핑합니다.펌프를 멈추고 주사기를 더 이상 조정하지 마십시오. RTD 분석에 원하는 흐름 시스템 구성 요소를 설정합니다. 끝을 피펫 팁 디스펜서에 삽입하고 완전히 채워질 때까지 구성 요소를 통해 배경 용액을 펌핑하십시오.트레이서 용액의 펌프를 원하는 유량으로 설정하십시오. 백그라운드 솔루션에 대한 stopcock을 닫고 트레이서 솔루션의 흐름을 시작하십시오. 동시에 분수 수집기를 시작하십시오.트레이서 솔루션의 흐름을 짧은 시간 동안 계속하여 트레이서의 임펄스 입력을 근사화합니다. RTD의 경우 시간당 1밀리리터의 유속으로 10분의 펄스 지속 시간을 사용하는 것이 좋습니다. 트레이서 용액 펄스 기간이 끝날 때 트레이서 용액 펌프를 정지하십시오.트레이서 솔루션에 대한 스톱콕을 빠르게 닫고 동일한 유속으로 배경 솔루션의 흐름을 시작하십시오. 모든 트레이서가 시스템을 통과하여 수집된 분획으로 들어갈 때까지 배경 솔루션이 흐르고 분수를 수집하도록 허용하십시오. 멸균 조건 하에서, 바늘이 있는 마개를 바늘을 뽑아 웰 플레이트 배양물에 삽입한다.마개가 제자리에 놓인 후, 출구 바늘의 높이가 안정한 액체 수준을 결정함에 따라 관류를 위해 바늘을 원하는 높이로 낮 춥니 다. 바늘을 수컷 루어 캡으로 뚜껑을 덮고 사용할 때까지 섭씨 37도에 설정된 인큐베이터에 전체 웰 플레이트를 보관하십시오. 관류에 사용할 두 개의 배지를 준비하여 먼저 분배 될 배지를 하나로, 다른 배지를 두 개로 표시하십시오.각 배양물이 관류되도록 한 개의 주사기를 배지로 채워 연금의 전체 지속 기간과 관류 시스템을 초기에 채우기에 충분한 부피를 더합니다. 두 번째 주사기를 중간 두 개로 채워 연금의 전체 기간을 지속하십시오. 두 주사기를 네 방향 스톱콕의 세 포트 중 두 개에 연결하십시오.주사기를 스톱콕에 연결하기 위한 튜빙의 길이가 필요할 수 있다. 중간 하나에 대한 스톱콕을 닫고 열린 포트에서 물방울이 떨어지기 시작할 때까지 중간 매체 두 개를 스톱콕에 분배하여 스톱콕을 준비하십시오. 그런 다음 중간 두 개에 대한 스톱콕을 닫고 모든 잔류 매체 두 개가 열린 포트에서 플러시 될 때까지 매체 하나를 스톱콕에 분배하십시오.암-헛간 루어 커넥터를 사용하여 업스트림 튜브를 개방형 스톱콕 포트에 연결합니다. 튜브의 다른 쪽 끝에 있는 미늘 루어 커넥터에 남성을 삽입합니다. 상류 튜브가 배지로 채워질 때까지 주사기로부터 배지 하나를 분배하고 앞서 입증된 바와 같이 하류 튜빙의 준비를 진행한다.수컷 투 바브 루어 커넥터를 다운스트림 튜브의 한쪽 끝에 삽입하고 암 루어 캡으로 캡핑합니다. 준비된 모든 튜브, 주사기 및 웰 플레이트를 관류에 사용할 인큐베이터로 조심스럽게 가져 오십시오. 주사기 펌프와 분획 수집기를 인큐베이터 근처의 원하는 위치에 놓습니다.주사기 펌프를 인큐베이터 위 또는 근처에 놓고 분획 수집기를 포트 근처의 인큐베이터 옆에 놓습니다. 주사기를 펌프에 적재하십시오. 모든 상류 및 하류 튜브의 뚜껑이 덮인 끝을 함께 묶어서 인큐베이터 외부에서 포트를 통해 내부로 밀어 넣으십시오.다운스트림 튜브의 열린 끝을 분수 컬렉터의 다중 헤드 디스펜서의 분배 피펫 팁에 삽입합니다. 인큐베이터 내부에서, 흐르는 매체가 열과 이산화탄소를 받을 수 있는 튜브의 길이를 최대화하기 위해 상류 튜브의 느슨한 부분을 인큐베이터로 가능한 한 많이 당겨 넣는다. 각 꽂힌 우물에 대해 바늘과 상류 및 하류 튜브의 뚜껑을 신속하게 풀고 루어 커넥터와 함께 부착하십시오.모든 부품이 연결되면 주사기 펌프를 비교적 빠른 속도로 간단히 실행하여 모든 스트림이 제대로 흐르고 있는지 확인하십시오. 이 시점에서, 매체로 가득 찬 다운스트림 튜브로 실험을 시작하고자 하는 경우, 모두가 채워질 때까지 펌프를 계속 가동하고, 그렇지 않으면 펌프를 정지시킨다. 중간 하나에 대한 주사기 펌프 유량과 분획 수집 빈도를 설정하고 두 기계를 동시에 시작하여 실험을 시작하십시오.배지 공급원을 변경해야 할 때, 중간 공급원을 위한 주사기 펌프를 신속하게 정지시키십시오. 스톱콕을 중간 크기로 닫은 상태로 돌리고 중간 두 개의 주사기 펌프를 시작하십시오. 나중에 원하는 경우 소스를 다시 중간 소스로 전환하십시오.원하는 실험 기간 동안 분수를 수집합니다. 두 개의 RTD 실험에서 분획의 트레이서 농도를 측정하고 데이터 MATLAB 스크립트에서 RTD에 입력하여 두 개의 RTD를 생성했습니다. 단일 튜브와 직렬로 연결된 여러 개의 튜브 조각이 단일 축 분산 모델에 의해 잘 맞고 관류 된 48 웰 플레이트를 라인에 추가하면 무시할 수있는 편차가 발생하여 한 미터 튜브 RTD와 전체 시스템의 RTD가 축 분산 기능에 맞을 수 있습니다.불량한 모델 적합성의 예는 1미터 튜브 RTD 데이터에 적합된 축방향 분산 모델을 사용하여 입증되었으며 데이터와 함께 플롯팅되었습니다. 초기 파라미터 추측은 타우가 용적 유량으로 나눈 관류 시스템 부피와 거의 동일한 양호한 모델 핏을 생성하도록 변경되었습니다. TNF-알파의 90분 펄스는 시스템에 대한 입력 신호로서 정의되었고, 웰 플레이트 입구에서 TNF-알파 신호를 결정하기 위해 일미터 튜빙 RTD와 컨볼링되었다.입력 신호는 또한 수집된 분획에서 시스템의 출구에서 TNF-알파 신호를 결정하기 위해 전체 시스템의 RTD와 컨볼링되었다. HEK 293 세포는 NF-카파B 반응 요소를 함유하는 프로모터에 의해 구동되는 GLuc를 분비하도록 조작되었다. 실험은 TNF-알파 노출 후 NF-카파B에 의해 구동되는 GLuc 발현의 유의한 발현 증가 및 느린 감소를 밝혀냈다.시스템의 변형은 신호를 입력하고 세포를 제약 후 결합 용질 프로파일에 노출시킬 필요가없는 실험을위한 간단한 설정을 포함하여 첨부 된 논문에 설명되어 있습니다.

multi-stream-perfusion-bioreactor-integrated-with-outlet

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 마이크로 bioreactors에서 세포의 3 차원 배양을위한 칩 기반의 플랫폼을 설명합니다. 하나의 칩 10 미오 최대 집 수 있습니다. 멸균, 폐쇄 순환 루프에서 유체 흐름, 산소 장력 등에 관한 정확하게 정의된 조건 하에서 재배 세포 수 있습니다.

Perfused 마이크로 bioreactors의 칩 기반의 입체 세포 배양

우리는 살균 지속적인 흐름 회로에서 층류 유동 전단 응력에 따라 자기편 세포 수있는 방법을 설명하고 있습니다. 세포 '유착, 형태는 투명 챔버를 통해 신진 대사 분석 및 미래의 실험이나 문화에 대한 전단 노출 후 수확한 세포 회로에서 얻은 샘플을 공부하실 수 있습니다.

층류의 전단 응력에 따라 내피 전구 세포를 평가하기 위해 병렬 플레이트 흐름 회의소와 지속적인 흐름 회로

우리는 마이크로 스케일 세포 자극 실험에 자동 세포 배양 및 심문 플랫폼을 개발했습니다. 플랫폼은 양성 세포의 작은 인구를 자극 분자 분석을위한 해물을 복구하는 간단한 다목적 및 정밀한 컨트롤을 제공합니다. 플랫폼은 물론 귀중한 세포 및 / 또는 시약을 사용하는 연구에 적합합니다.

마이크로 스케일 세포 자극 실험을위한 다목적 자동화 플랫폼

여기에서는 최대 28일 동안 미세유체 다기관 칩에서 일차 세포, 조직 모델 및 펀치 생검을 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 인간 피부 미세혈관 내피 세포, 간 응집체 및 피부 생검이 공통 매체 순환에서 성공적으로 결합되었습니다.

멀티 장기 칩 - 장기 멀티 조직 공 배양을위한 미세 유체 플랫폼

Microbioreactor 시스템에 다양 한 조건에서 48 병렬 세포 배양의 동시 작업에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 셀 문화 과정, 수확 및 후속 항 체 titer 분석을 설명 합니다.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

PDMS 기반의 제조 과정, 다층, 체외 전사 및 번역(IVTT) 반응이 장기간 수행될 수 있도록 하는 미세유체 장치. 또한 장기간 이러한 반응을 자동화하고 유지하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어에 대한 포괄적인 개요가 제공됩니다.

장기간 무세포 유전자 발현의 전도를 위한 다층 미세유체 플랫폼

이 프로토콜은 환자 유래 제노이식(PDX)의 시험관 내 배양을 확장가능하게 하는 방법을 보여 줍니다. 한 단계는 실행 불가능한 단일 셀을 간단하게 제거하여 3D 하이드로겔에서 다세포 클러스터 배양의 전반적인 생존력을 향상시킵니다. 보조 단계는 PERfused 된 미세 유체 플랫폼에서 PDX 문화에 대한 모범 사례를 보여줍니다.

Perfused 마이크로 유체 플랫폼에서 환자 유래 제노이식의 Ex vivo 3D 하이드로겔 배양에 대한 향상된 생존력

이 프로토콜은 맞춤형 관류 생물 반응기에서 플랩 혈관 구조를 통해 나트륨 도데 실 설페이트 세제의 관류에 의한 혈관 화 된 돼지 플랩의 외과 적 조달 및 후속 탈세포화를 설명합니다.

맞춤형 관류 생물 반응기에서 돼지 혈관 플랩의 조달 및 관류-탈세포화

이 프로토콜은 관류 중인 혈관의 체외 배양을 위해 새로 개발된 3D 프린팅 바이오리액터의 설정 및 작동을 제시합니다. 이 시스템은 다른 사용자가 쉽게 채택할 수 있도록 설계되었으며, 실용적이고 저렴하며 기초 생물학 및 약리학 연구와 같은 다양한 실험 응용 분야에 적용할 수 있습니다.

Ex Vivo (체외 주행) 3D 프린팅 생물반응기에서 큰 혈관의 관류 배양

세포외 소포체는 생물의학 응용 분야에 엄청난 가능성을 가지고 있지만, 현재의 분리 방법은 시간이 많이 걸리고 임상적으로 사용하기에는 비실용적입니다. 이 연구에서는 최소한의 단계로 연속적으로 많은 양의 생체 유체에서 세포외 소포체를 직접 분리할 수 있는 미세유체 장치를 제시합니다.

분기된 A4F 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리

학습하세요 다중 스트림 관류 생물반응기를 이용한 동적 세포 배양 방법으로, 저비용으로 분비 및 흡수 동역학을 측정하고 세포에 시간 변화 자극을 적용할 수 있습니다.

동적 세포 배양을 위한 출구 분별과 통합된 다중 스트림 관류 생물반응기

더 많은 동영상 탐색