Name: 미세 소관 선인장체의 자체 조립 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: 배우세요 MAP65와 PEG를 이용한 미세소관 택토이드 자체 조립 방법으로 세포골격 조직화와 분열핵 방추체 형성 메커니즘을 연구하세요. 이 최소화 시스템은 생물학적 및 액정 물리학 연구에 활용됩니다.

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저자는 2021 년 여름 Ross Lab 회원, 특히 K. Alice Lindsay의 도움에 감사드립니다. 이 작업은 NSF BIO-2134215의 보조금으로 S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee 및 J.L. Ross를 지원했습니다. KECK 재단 (Rae Anderson, USD, lead PI)의 보조금은 R. Branch와 P. Chauhan을 부분적으로 지원했습니다.

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저자들은 경쟁적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

여기에 설명 된 방법은 미세 소관 촉각을 만들기 위해 여러 논문에서 사용되었습니다 (그림 2) 22,28. 이러한 실험은 대부분의 세포 유형에서 유사분열 또는 마이오틱 스핀들의 형태와 안정성을 조절하는 조직 원리를 밝히는 데 도움이 되는 생물학적으로 관련이 있다. 또한, 미세 소관은 액정이 등방성 상으로부터 핵을 형성하고 네마틱 상을 성장시키는 방법에 대해 더 많이 배우는 데 도움이되는 모델 액정 메조겐입니다.
여기에 설명 된 절차는 미세 소관 자체 조직을 탐구하기위한 몇 가지 장점이 있습니다. 첫째, 실험실에서 시작하기 전에 예지력이나 훈련이 거의없는 고등학생을 포함한 많은 학생들이 실험실에서 수행 한 것으로 재현 가능성이 높습니다. 촉각은 복굴절성(birefringent)(22)으로, 형광 현미경 검사 이외에 투과광에서 볼 수 있게 되어, 이 방법을 많은 실험실에서 이용할 수 있게 하고, 이 실험 절차는 하이엔드 연구 외에도 교육 목적에 적응할 수 있다. 마지막으로,이 과정은 제거 된 환원 주의적 접근 방식으로 생물학적 시스템을 계속 이해하고 조사 할 수있는 길을 열어 각 추가 조건, 단백질 또는 첨가제가 촉각제의 자체 조직을 어떻게 바꿀 수 있는지, 그리고 궁극적으로 스핀들을 어떻게 바꿀 수 있는지 이해할 수있게합니다. 더 나은 생체모방을 위한 표적은 활성, 유동성 및 필라멘트 극성 분류를 포함한다.
예기치 않은 결과를 제공하는 실험에 영향을 미치는 몇 가지 요인이있을 수 있습니다. 예를 들어, 촉각이 형성되지 않지만(그림 2) 팬형 패턴이 관찰되는 경우, MAP65는 미세소관(22,28)에 존재하지 않거나 결합하지 않을 가능성이 높다. 이것은 GFP-MAP65가 미세소관에 결합하지 않기 때문에 MAP65 형광 채널에서도 명백해야합니다.
촉각이 형성되지 않고 배경이 유리에 얼룩으로 나타나면 표면 코팅 때문일 수 있습니다. 일단 수행되면, 실란화는 커버 슬립에서 1 개월 만 지속됩니다. 그것이 마모 될 때, 튜불린은 노출 된 표면에 비특이적으로 결합 할 수있을 것입니다. 이 바인딩은 이상한 패턴에서 발생합니다.
촉각이 형성되지 않고 튜불린이 다양한 모양과 크기의 응집체에서 관찰된다면, 이것은 품질이 좋지 않은 튜불린 때문일 수 있습니다. 투불린은 미세소관 중합 대신에 이러한 오프 경로 응집을 구동할 수 있는 초기 응집체를 제거하기 위해 원심분리될 수 있다. 표면이 튜불린에 결합하면 용액의 튜불린을 고갈시킬 수도 있습니다. 미세 소관을 중합하는 데 중요한 농도보다 낮은 농도의 튜불린은 응집체를 초래할 수 있습니다.
FRAP 실험에서, MAP65 채널이 어떠한 회복도 나타내지 않으면(도 5), 광표백이 미세소관을 광손상시켰을 가능성이 있다. 광손상은 필라멘트의 국부적 인 파괴를 일으 킵니다. 이것은 전송 된 채널에서 검사에 의해 확인 될 수있다. 미세소관 촉각은 주변 물과의 높은 굴절률 불일치를 통해 투과된 채널에서 볼 수 있다. 광-유도된 광손상은 광표백을 실시한 ROI의 위치에서 투과된 광 이미징에서 화상 마크 또는 콘트라스트 손실로 나타날 것이다. 이런 일이 발생하면 단백질의 광손상을 억제하기 위해 레이저 또는 광력을 줄여야합니다.
이 절차와 접근 방식에서 몇 가지 문제가 발생했습니다. 한 가지 문제는 길이 측정이 현재 이미지를 클릭하여 손으로 수행된다는 것입니다. 이 방법은 간단하지만 불확실성이 높아질 수 있습니다. 횡단면과 가우시안에 피팅을 사용하는 폭 측정은 크기를 정량화하는 더 좋은 방법입니다. 길이에 대해서도 비슷한 방법을 사용할 수 있습니다. 두 번째 문제는 때로는 촉각제가 너무 길고 얇기 때문에 구부러질 수 있다는 것입니다. 이로 인해 길이를 정량화하는 것이 더 어려워집니다. 윤곽선 길이는 세그먼트 선을 사용하여 정량화 할 수 있지만 세그먼트가 추가 될 때마다 불확실성이 추가됩니다.
과학적 관점에서 볼 때,이 접근법은 액정 또는 스핀들의 모델로 사용하기위한 몇 가지 다른 과제를 가지고 있습니다. 첫 번째 과제는 미세 소관이 만드는 촉각의 길고 얇은 모양이었습니다 (그림 3 및 그림 4). 이전 간행물22에서 언급된 바와 같이, 미세소관 촉각제는 양극성이 아닌 균질한 촉각이다. 이것은 모양을 구성하는 미세 소관이 구조의 끝을 가리키도록 방향을 바꾸지 않는다는 것을 의미합니다. 대신, 모든 미세 소관은 장축에 평행하고 "극"은 무한대에 위치합니다. 이것은 분자 액체 결정 또는 액정 메조겐으로도 작용할 수있는 액틴 또는 DNA에 대해 관찰 된 촉각제와 매우 다릅니다. 이러한 다른 시스템에서, 촉각제는 양극성이며, 교차 편광자에서 볼 때, 그들은 막대의 재방향의 명백한 징후를 보여줍니다.
이 시스템의 두 번째 주요 과제는 미세 소관이 촉각 내부에서 움직이지 않는다는 것입니다. 이것은 미세소관의 회수율이 매우 낮기 때문에 FRAP 실험 및 분석으로부터 명백하다. 그들의 고체와 같은 성질은 미세 소관 촉각을 대규모 액정 유사체로서 덜 가치있게 만듭니다. 액정의 네마틱 상은 액체 (유체) 및 결정 (조직화) 특성을 모두 가져야합니다. 모양이 스핀들에 적합한 것처럼 보이지만, 부동성으로 인해 시스템은 모델 유사 분열 스핀들로서 덜 흥미 진진합니다. 반면에이 문제는 시스템에서 더 많은 유동성을 창출하기 위해 실험을 수정하는 방법을 조사 할 수있는 기회를 제공합니다.
이러한 과학적 도전은 시스템에 대한 새로운 지식을 허용하는 흥미로운 기회를 제공합니다. 미세 소관 촉각을 더 양극성으로 만들기 위해, 하나는 더 짧은 미세 소관을 사용할 수 있습니다. 그러나 미세 소관에는 액틴처럼 길이를 조절하는 잘 특성화 된 캡핑 단백질이 많지 않기 때문에 추가적인 도전이 있습니다. 핵형성과 성장의 사용은 짧은 미세 소관을 만들기 위해 매우 높은 농도의 튜불린과 GMPCPP를 사용해야합니다. 높은 튜불린 농도는 시스템에 더 많은 수의 필라멘트를 초래하여 타크토이드를 서로 분리하기가 더 어려워집니다. DARPin33과 같은 새로운 미세 소관 캐퍼의 추가는이 상황에 도움이 될 수 있습니다. 움직이지 않는 미세 소관의 두 번째 문제는 유사 분열에 사용되는 모터의 사량체 인 kinesin-534와 같은 운동 단백질의 첨가에 의해 완화 될 수 있습니다. 대안적으로, 이량체 키네신-1의 인공 이량체(15)가 사용될 수 있다.
더 많은 유동성을 추가하는 또 다른 방법은 미세 소관이 동적 불안정, 미세 소관의 성장 및 수축을 수행 할 수있게하는 것입니다. 현재, 안정한 GMPCPP 필라멘트로 시드되고 동적 불안정을 겪는 미세 소관은 스핀들 또는 촉각을 형성하기 위해 원하는 것보다 훨씬 길며, 이는 팬이나 번들과 같은 매우 긴 조직을 초래할 것입니다. 따라서 미세 소관 동적 불안정성을 추가하는 것은 선인장 모양을 보존하기 위해 신중하게 수행되어야합니다. 길이를 조절할 수 있는 관련 단백질 및 효소의 첨가는 이러한 문제를 완화시킬 수 있다. 예를 들어, kinesin-1335와 같은 탈중합 키네신이나 katanin36과 같은 효소를 절단하는 것이 필요할 수 있습니다. 이 실험은 복잡하고 어렵지만 결과가 밝혀 지더라도 매우 통찰력이 있습니다. 미래의 실험이 어떤 방향으로 나아가든, 미세 소관 촉각을 만들기 위해 여기에서 개발 된 플랫폼은 미세 소관 조직의 물리적 기초에 새로운 정보를 노출 할 수 있습니다.

유사분열을 통한 세포 분열은 생명을 유지하는 가장 중요한 생물학적 과정 중 하나입니다. 튜불린 이량체로 구성된 미세 소관 필라멘트는이 과정의 필수 구조 요소입니다. 염색체가 세포 중심에서 정렬될 때 메타페이즈에서 생성된 과도 기계류는 실로 덮인 직조기의 스핀들과 같은 모양 때문에 유사분열 스핀들이라고 불립니다(그림 1A). 많은 유기체에 걸쳐 미세 소관이 메타 페이즈에서 응축 된 염색체를 세포의 중심으로 밀어 넣고 당겨서 정렬하고 아나 페이즈에서 분리되는 미세 소관에 연결하는 데 사용된다는 것은 잘 알려져 있습니다 (그림 1B, C). 스핀들은 meiosis (그림 1B)와 유사 분열 (그림 1C) 모두에서 형성되며, 스레드처럼 중심축을 감싸지 않고 인터페이스와 평행하게 실행되는 많은 겹치는 미세 소관에서 생성됩니다. 이러한 미세 소관 기반 구조를 만들려면 가교 결합 된 관련 단백질과 염색체1을 밀고 당기는 데 도움이되는 모터 역할을 할 수있는 관련 효소가 필요합니다.
meiotic spindles 에 대한 연구에 따르면 미세 소관은 짧고 동적이며 가교 된 배열 2,3,4,5,6 에서 겹치는 것으로 나타났습니다 (그림 1Di). 이러한 짧은 미세 소관의 물리적 조직으로 인해 meiotic 스핀들은 액정 선탠토이드와 유사합니다 (그림 1E). 실제로, 스핀들은 액정 촉각제5에서 기대할 수 있듯이 합체되고 병합되는 것으로 나타났습니다.
1960 년대로 거슬러 올라가는 많은 연구에서는 고정, 직렬 섹션 및 전자 현미경을 사용하여 유사 분열 스핀들 7,8,9,10 내부에 두 가지 유형의 미세 소관이 있음을 확인했습니다. 첫 번째 유형은 스핀들 극을 키네토코레에 연결하는 kinetochore microtubules라고합니다. 두 번째 유형은 염색체를 지나서 자라며 중간 영역에서 겹치는 극간 또는 극성 미세 소관이라고합니다 (그림 1Dii) 8,9,10. 세 번째 유형은 스핀들 외부에 있고 극을 세포 가장자리에 연결하는 아스트랄 미세 소관이라고합니다. 이러한 미세 소관 조직은 현재 논의의 범위를 벗어납니다. 오그민6과 감마-튜불린 고리 복합체 사이의 상호작용에 대한 최근의 연구가 미세소관의 핵형성 중심에 영향을 미치며, 그 결과 도 1D와 같이 더 짧은 미세소관을 갖는 유사분열 스핀들을 초래한다.
미세 소관은 넓은 것보다 길기 때문에 높은 종횡비와 높은 강성을 가지고 있기 때문에 액정 분자의 확장 된 버전과 같습니다. 연질 물질 물리학에서, 원자와 분자는 핵형성 및 결정(11)의 용융을 포함하는 상전이의 물리적 메카니즘을 추론하기 위해 최소한의 상호작용을 사용하여 근사화되었다. 마찬가지로, 미세 소관은 액정 분자의 확장 된 버전 인 중규모 객체로, 등방성 물질로부터 네마틱 상들의 핵화 및 성장을 포함하여 액정 역학의 물리학에 대한 통찰력을 제공합니다. 또한, 상기 논의된 바와 같이, 마이오틱 스핀들은 액정 분자 3,4,5의 등방성 상태로부터 핵을 형성하고 성장하는 네마틱 상태인 액정 촉각의 것과 같은 특성을 나타낸다. 촉각의 경우, 핵형성 및 성장은 다른 결정의 핵과 같다(즉, 비교적 높은 농도의 메조겐[액정을 형성하는 분자]를 필요로 함). 선인장의 독특한 "스핀들" 모양은 네마틱 상에 정렬되는 액정 메조겐의 국부적 정렬에서 비롯됩니다(그림 1E). 분자가 매우 비대칭적이기 때문에 둥근 결정을 형성 할 수 없습니다. 미세 소관의 특성을 감안할 때, 미세 소관의 높은 국소 농도로 만들어진 유사 분열 스핀들 - 기계가 선인장 또는 스핀들이라고하는 것과 같은 모양이라는 것은 놀라운 일이 아닙니다. Tactoids는 양극성일 수 있으며, 극은 테이퍼 끝(그림 1Ei)에 있거나 균질할 수 있으며, 극은 무한대에서 효과적으로 나타납니다(그림 1Eii).
스핀들 형성의 중요성을 감안할 때, 이온성 종 12,13, 고갈 상호작용을 생성하는 크라우드 제제 14,15, 및 특정 미세 소관가교 단백질 13,16,17,18,19를 통해 다발로 미세소관 축합을 시연함으로써 시험관 내에서 자체 조직화된 스핀들 형성을 향한 노력이 진행되고 있으며, 21. 놀랍게도,이 약제는 모두 미세 소관의 국소 농도를 증가시키기 위해 노력하지만, 종종 긴 미세 소관 다발을 초래하지만 촉각제는 아닙니다. 이러한 번들이 긴 한 가지 이유는 그들을 구성하는 미세 소관도 길기 때문일 수 있습니다. 더 짧은 미세 소관을 사용한 최근의 연구는 또한 끝15에서 테이퍼되지 않는 더 긴 번들을보고했다. 이 경우, 번들은 번들의 확장을 일으키는 모터 단백질과 함께 유지되어 더 길어집니다. 비인장 가교결합제를 갖는 짧은 미세세관은 여기에 설명된 바와 같이 테이퍼링된 스핀들형 어셈블리에 필요하다.
최근에, 우리는 핵을 형성하는 안정한 미세소관(22)의 존재 하에, 항평행 가교결합제인 MAP65를 사용하여 미세소관 촉각의 생성을 가능하게 하는 기술을 개발하였다. 미세소관은 짧을 필요가 있었지만, 미세소관 길이의 알려진 조절제는 거의 없으며, 미세소관은 동적 불안정성 또는 종단간 어닐링에 대항하여 미세소관을 캡핑할 수 있다. 대신, GMPCPP는 성장 후 필라멘트를 핵으로 만들고 안정화시키기 위해 사용되었다. 이것은 촉각으로 자체 조직 할 수있는 짧은 미세 소관의 고밀도를 만들 수있었습니다. 이들 촉각제는 복굴절 하에서 볼 때 동질적이었다. 짧은 미세소관 이외에, 특정 항평행 가교결합제인 MAP65가 촉각을 형성하기 위해 사용되었다(도 2). MAP65는 유사분열성 가교결합제(23)의 PRC1/Ase1 패밀리 내의 식물 미세소관-관련 단백질이다. MAP65는 이량체로서 존재하며, 미세소관(24)뿐만 아니라 그 자체에 결합하는 강한 친화력을 갖는다. 양극성이고 액정의 액체 유사 특성을 갖는 액틴 필라멘트 25,26,27 로 관찰된 마이오틱 스핀들 및 촉각과는 달리, 미세소관 촉각은 고체형22,28인 것으로 관찰되었다.
여기에서는 미세 소관 촉각을 만들고 형광 기반 기술을 사용하여 어셈블리의 모양과 구성 요소의 이동성을 특성화하기위한 프로토콜이 제시됩니다.

<table><tbody><tr><td>2% 디클로로디메틸실란</td><td>GE 헬스케어</td><td>118945</td><td>소수성 실란 표면 처리. 최대 3회까지 재사용할 수 있으며 1년 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>5분 에폭시</td><td>Bob Smith Industries</td><td></td><td>실험 챔버 밀봉용</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>32900HPLC</td><td>100%</td></tr><tr><td>BL21 세포</td><td>Bio Labs</td><td>C2527I</td> MAP65 Catalase Sigma C30-500MG<td>를 발현하는 데 사용되는 유능한 박테리아 세포</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>산소 제거 시스템의 일부. 300 mg/ml 스톡은 ddH2O로 만들어지고 10 &mu에 저장됩니다. l -20&deg의 분취량; C는 최대 1 년 동안.</td></tr><tr><td>커버슬립(22 mm x 22 mm 또는 22 mm x 30 mm)</td><td>Fisher</td><td>12544-AP</td><td>실험용</td></tr><tr><td>디티오트레이톨</td><td>시그마</td><td>43815-5G</td><td>이황화 결합을 끊고 산소를 제거하는 데 사용되는 작은 분자. 1M 스톡은 ddH2O의 분말(시그마)로 만들어집니다. 용액은 분주되어 최대 1년 동안 -20°C에서 보관됩니다. 부분 표본은 7-8회 사용한 후 폐기합니다.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>Tubulin buffer base ingredient</td></tr><tr><td>Eppendorf 0.5 ml tubes</td><td>Eppendorf</td><td>05 402 18</td><td>실험 용액 보유용</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>111000200</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>실험용 챔버를 통한 용액 세척 및 추출용</td></tr><tr><td>NA가 높은 형광 현미경 목적</td><td>Nikon</td><td>Ti-E, W2 Confocal</td><td>이미징 실험용</td></tr><tr><td>냉동고 -20&deg; C</td><td>Fisherbrand</td><td>13986148</td><td>시약 보관용</td></tr><tr><td>냉동고 -80°C; C</td><td>Thermo scientific</td><td>328223H01-C</td><td>단백질 저장용.</td></tr><tr><td>실란화용 유리 용기</td><td>Michaels</td><td></td><td>실험실 준비용 - 커버 유리</td></tr><tr><td>처리 유리 슬라이드</td><td>Fisher</td><td>12544-4</td><td>실험용 챔버용</td></tr><tr><td>포도당</td><td>시그마</td><td>G7528-250G</td><td>산소 소기 시스템의 일부. 300 mg/ml 스톡은 ddH2O로 만들어지고 10 &mu에 저장됩니다. l -20°C의 부분 표본.</td></tr><tr><td>포도당 산화효소</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>산소 제거 시스템의 일부입니다. 이것은 4&deg에 저장됩니다. C는 최대 1 년 동안.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>GTP의 천천히 가수분해 가능한 아날로그는 미세소관 핵형성에 대한 동적 불안정성과 자발적인 임계 농도를 줄여 일정한 길이를 얻어 미세소관을 중합하고 안정화하는 데 사용됩니다. 우리는 Jena Biosciences에서 10mM 재고를 구입하여 -20°C에 보관합니다. C는 최대 1 년 동안.</td></tr><tr><td>현미경 용 발열체</td><td>Okolab 스테이지 상단 인큐베이터</td><td></td><td>이미징 실험 용</td></tr><tr><td>Imidizole</td><td>Sigma</td><td>I2399</td><td>니켈 비드에서 MAP65 단백질을 용리하여 MAP65를 정제하는 데 사용</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>세척 및 실험 챔버를 통해 용액을 끌어 당기는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>1 M ddH2O, 시간이 지남에 따라 산성화를 방지하기 위해 신선하게 제작되었습니다.</td></tr><tr><td>액체 질소</td><td>에어 가스</td><td>NI 230LT22</td><td>동결 분취액을 떨어 뜨립니다. 이것은 또한 저장에 사용할 수 있습니다(권장되지 않음)</td></tr><tr><td>MAP65 단백질</td><td>Ram Dixit</td><td></td><td>반병렬 미세소관 교차결합제인 분자량이 65kD인 미세소관 관련 단백질(MAP). 당사는 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 MAP65-1의 비표지 및 GFP 표지 버전을 정제했습니다. GFP-MAP65와 비표지 MAP65를 혼합하여 단백질의 10%가 표지되도록 합니다. 작업 재고는 10.8 &mu입니다. M 솔루션. 이 작업 솔루션은 4°deg에 저장됩니다. C와 매주 새롭게 리메이크합니다. MAP65 및 GFP-MAP65를 정제하기 위한 프로토콜은 이전 방법 장(26)에 나와 있습니다.</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>시그마</td><td>MKCJ940</td><td>Tubulin 완충 성분</td></tr><tr><td>NTA-니켈 구슬</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>6xHis 태그가 지정된 MAP65 단백질을 정제하는 데 필요한 비드</td></tr><tr><td>Optomicroscan</td><td>Nikon</td><td></td><td>405 nm 레이저 시스템은 관심 영역의 원하는 모양으로 레이저를 집중시킬 수 있습니다</td></tr>. <tr><td>PEM80</td><td></td><td></td><td>80 mM K-PIPES, pH 6.8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA로 만든 용액용 중성 튜불린 중합 염기 완충액, 4°C에 보관됨; C는 최대 1 년 동안.</td></tr><tr><td>영구 양면 테이프</td><td>3M - Scotch</td><td>34-8724-5691-7</td><td>실험용</td></tr><tr><td>페트리 접시</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>습윤 챔버용</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P7643-100G</td><td>튜불린 버퍼 베이스 성분</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>끝 부분에 두 개의 친수성 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 블록이 있고 폴리페닐렌 옥사이드(PPO) 소수성 표면 코팅의 소수성 중앙 블록이 있는 블록 공중합체로, 단백질이 표면에 결합하는 것을 방지하기 위해 사용합니다. Pluronic-F127은 분말(시그마) 형태로 구매하여 하룻밤 동안 ddH2O에 5%(w/v) 용액으로 용해시킵니다. 일단 용해되면 용액은 최대 1년 동안 실온에서 보관할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>폴리에틸렌 글리콜</td><td>Affymetrix Inc</td><td>19966 500 GM</td><td>고갈력을 생성하여 촉각을 표면으로 가져오고 미세소관을 구성하는 데 도움이 되는 밀집제. PEM80에서 100kDa PEG의 5%(w/v) 용액을 생성합니다. 용액은 4°C에 저장됩니다. C를 최대 1 년 동안 사용하고 사용하기 전에 로커에 놓습니다. 점성이 있으므로 용적식 피펫을 사용하여 작업하는 것이 좋습니다.</td></tr><tr><td>용적치환 피펫</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>점성 액체 피펫팅용</td></tr><tr><td>커버 슬립용 랙</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72240</td><td>실험실 준비용 - 커버 유리 처리</td></tr><tr><td>냉장고 4°C; C</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>시약 보관을 위해</td></tr><tr>돼지 뇌에서<td>Tubulin Labeled</td><td>Cytoskeleton</td><td>TL590M</td><td>동결건조 로다민 표지 튜불린을 구입하여 -80°C에 보관합니다. PEM80에서 수화되고 1 년까지 사용될 때까지 C.</td></tr><tr>돼지 뇌에서 추출한 <td>튜불린 단백질</td><td>세포골격</td><td>T240</td><td>동결건조 튜불린 99% 순수 비표지 구매(세포골격) 및 -80°C에 보관; PEM80에서 수화되고 1 년까지 사용될 때까지 C.</td></tr><tr><td>UV-Ozone</td><td>Jelight</td><td>Model 342</td><td>실험실 준비 - 커버 안경 처리</td></tr><tr><td>Stackreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>드리프트</td>를 <td>제거하기 위해 시계열 데이터를 등록하기 위한 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ 플러그인</td></tr><tr><td>Turboreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td> <td>드리프트를 제거하기 위해 시계열 데이터를 등록하기 위한 플러그인</td></tr></tbody></table>

미세 소관 선인장체의 자체 조립

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

세포 골격은 세포 내에서 주요 내부 조직 및 재구성을 담당하며, 모두 변화를 지시 할 관리자없이 이루어집니다. 이것은 특히 유사분열 또는 meiosis 동안 미세 소관이 세포 분열 중에 스핀들을 형성하는 경우입니다. 스핀들은 세포 분열 중에 유전 물질을 분리하는 데 사용되는 기계입니다. 시험관 내에서 자체 조직 된 스핀들을 만들기 위해 우리는 최근에 미세 소관 관련 단백질 및 군중 제제의 최소 세트로 스핀들 모양의 어셈블리로 미세 소관을 재구성하는 기술을 개발했습니다. 구체적으로, MAP65가 사용되었는데, 이는 식물로부터의 항평행 미세소관 가교결합제이며, 효모로부터의 Ase1 및 포유동물 유기체로부터의 PRC1의 상동체이다. 이 가교제는 미세 소관을 길고 얇고 스핀들과 같은 미세 소관 자체 조직 어셈블리로 자체 조직화합니다. 이 어셈블리는 또한 액정 촉각과 유사하며, 미세 소관은 메조 스케일 메조겐으로 사용될 수 있습니다. 여기에서는 이러한 미세 소관 촉각을 만들 뿐만 아니라 형광 현미경을 사용하여 어셈블리의 모양을 특성화하고 광표백 후 형광 회수를 사용하여 구성 요소의 이동성을 특성화하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

소수의 성분, 튜불린 이량체 및 미세소관 가교결합제만 있으면 미세소관 촉각제가 형성될 수 있습니다(그림 2A). 이 프로토콜은 인큐베이터에서 미세 소관을 핵으로 만들고 성장시키기 위한 인큐베이션을 설명하지만, 핵형성 및 성장은 현미경으로 직접 관찰할 수 있습니다(30분 이내에 완료됨)(그림 2B). 튜불린의 농도는 13.6 μm에서 일정하게 유지되고 MAP65-MT 결합은 10 %에서 일정하게 유지된다.
그림 4는 성공적인 데이터를 나타냅니다. 촉각제는 튜불린 채널의 561nm 레이저와 MAP65 채널의 488nm 모두에서 볼 수 있어야 하며, 이는 서로 완벽하게 겹쳐집니다(그림 4A). 이 시스템의 한 가지 수수께끼는 촉각의 폭이 미세 소관 길이, MAP65 농도 및 크라우밍 제제의 변화를 포함한 다양한 실험 변화 하에서 변하지 않는 것으로 보인다는 것입니다 (그림 4B)22,28. 길이는 훨씬 더 가변적이며 미세 소관 길이와 MAP65 농도 (그림 4B)22,28에 따라 다릅니다.
FRAP를 수행할 때 MAP65 신호는 복구되지만 미세소관 신호는 복구되지 않는 것으로 관찰되었습니다(그림 5). FRAP에서의 회복은 표지되고 광표백된 물체의 이동성 및 움직임에 기인한다. MAP65의 경우, 어두워진 분자는 해리되어 미세 소관에서 멀어지고 새로운 분자는 영역으로 이동합니다 (그림 5). MAP65 결합은 평형에 있으므로 결합 및 결합 해제 속도는 동일합니다 (초당 분자로 측정). 미세소관의 경우, 미세소관이 선인장을 떠날 수 없다는 것을 암시하는 회복이 보이지 않았다(도 5A, Bi, C). 또한, 어두워진 영역의 확산이 보이지 않았으며, 이는 미세 소관이 국부적으로 움직이지 않고 선탠토이드 모양 내의 유체가 아니라는 것을 암시합니다.
<img alt="중기 염색체 정렬; 방추 구조 및 미세소관 조직; 현미경 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 그림 1 : 스핀들 형성의 다른 모델. 유사분열 스핀들은 미세소관과 그 관련 단백질과 효소로 만들어진 기계로, 세포 분열 동안 염색체를 두 개의 새로운 딸 세포로 정렬하고 분리합니다. (A) 초기 중세 시대의 이미지는 네덜란드의 고급 원사가있는 스핀들 복제본을 떨어 뜨립니다. 이 그림은 Peter van der Sluijs30에 의해 위키미디어 이미지에서 수정되었습니다. (B) 야생형 meiosis II의 다른 단계에서 미세 소관의 입체 재구성. 미세 소관은 녹색으로 표시되고 염색체는 회색으로 표시됩니다. 스케일 바 = 1 μm. 이 그림은 Lantzsch et al.31에서 수정되었습니다. (c) 분할된 Sf9 세포의 유사분열 스핀들에서의 미세소관의 현미경 이미지. 스핀들 극과 스핀들의 미세소관은 녹색 형광 단백질로 표지된다. 스케일 바 = 5 μm. 이 그림은 Advani et al.32에서 수정되었습니다. (D) 유사분열 및 meiotic 스핀들 미세소관이 어떻게 조직되는지에 대한 상이한 모델. (i) 제노푸스 달걀 추출물로부터 생성된 meiotic 스핀들에 대해 이전에 관찰된 바와 같이, 미세소관(녹색)은 스핀들 전체에 걸쳐 짧고 역동적인 것으로 추론되었다. 이것은 액정 내부의 양극성 선인장 조직과 유사합니다. (ii) 유사분열 스핀들 내부의 미세소관 조직에 대한 정준 모델에는 두 가지 유형의 미세소관이 있습니다: 염색체 주위의 중간 영역에서 교차하는 극간 또는 극성 미세소관(짙은 녹색)과 극에서 키네토코레까지 묶여서 뻗어 염색체를 밀고 당기는 키네토코레 미세소관(연한 녹색)이 있습니다. 모든 이미지에서 염색체는 투명한 파란색으로 표시되고 스핀들 극은 짙은 녹색으로 표시됩니다. (e) (i) 양극성 및 (ii) 균질 촉각에 대한 액정 선에서 메조겐 (녹색 선)의 개략도. 양극성 촉각제는 촉각의 끝에 두 개의 극을 가지고 있으며, 메조겐은 그 극을 가리키기 위해 방향을 바꿉니다. 균질 촉각제는 무한대에서 극을 가지며, 메조겐은 촉각의 길이를 따라 방향을 변화시키지 않는다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="타토이드 형성 방법 개략도 및 시계열; 미세소관, MAP65 가교, 현미경." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 그림 2: 미세소관 축합. (A) 미세소관은 이온성 종, 집요제에 의한 고갈력, MAP65와 같은 특정 미세소관 가교제를 포함한 다양한 방법에 의해 번들링되고 가교될 수 있다. (i) 투불린 이량체와 MAP65 단백질이 혼합되어 미세소관을 핵으로 만들고 성장시킨다. (ii) 미세소관은 튜불린으로부터 핵을 형성하고 성장하며, MAP65는 즉시 미세소관, 또 다른 MAP65 단량체, 또는 둘 다에 결합하고 번들링을 일으킨다. (iii) 가교결합된 다발의 미세소관은 핵을 형성하고 성장한다. (iv) 최종 구성은 스핀들과 유사한 미세소관 전술이다. (B) 105 분 이상 핵을 형성하고 성장하는 미세 소관 촉각의 시계열. 스케일 바 = 5 μm. Edozie et al.22에서 적응한 그림. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="현미경에서 시료 흐름 방향 분석을 위한 실란화된 커버슬립이 있는 유동 챔버 다이어그램." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 그림 3: 유동 챔버 어셈블리. 유동 챔버는 유리 슬라이드, 실란화 된 커버 유리 및 영구적 인 양면 테이프를 사용하여 만들어집니다. 노란색으로 강조 표시된 영역은 샘플이 흐르고 관찰되는 흐름 경로입니다. 유동 챔버의 부피는 ∼20 μL이다. 에폭시는 몇 시간에 걸쳐 장기 이미징 동안 샘플이 증발하는 것을 방지하기 위해 챔버의 끝을 밀봉하는데 사용되었다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="타토이드 분석: 미세소관 및 MAP65 채널, 병합 이미지, 길이-너비 정량화, 그래프." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 그림 4: Tactoid 이미지 및 길이 및 너비 분석. (a) 실시예 기재된 바와 같이 형성된 촉각의 데이터는 (i) 561 nm 레이저를 사용하여 로다민 표지된 튜불린을 미세소관 채널 이미징, (ii) GFP-MAP65 채널 488 nm 레이저를 사용하여 GFP를 이미징하고, (iii) 미세소관 채널(마젠타) 및 GFP-MAP65 채널(cyan)로부터의 병합된 오버레이 이미지를 보여주는 방사 디스크 공초점 이미지를 사용하여 이미지화한다. 겹침 영역은 흰색으로 표시되며 미세 소관과 MAP65가 정확하게 공동 지역화되었음을 보여줍니다. 스케일 바 = (A)의 모든 이미지에 대해 10μm. (B) 선인장 길이와 폭의 정량화. (i) 라벨 없이 분석될 선인장의 이미지. 배율 막대 = 5μm. (ii) (i)에서와 동일한 이미지로, 여기서 길이(선 캡이 있는 실선) 및 너비(점선) 측정값이 표시됩니다. 스케일 바 = 5 μm. (iii) 폭은 (ii)에 표시된 수직 이섹터(점선)에서 선탠토이드를 가로지르는 강도 프로파일을 취함으로써 측정되었다. 강도 프로파일은 촉각의 진폭과 폭을 드러내기 위해 가우시안 함수에 적합했습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="FRAP 분석: 미세소관, MAP65 시계열, 강도 차트. 형광 회복 역학." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> 도 5: 대표적인 FRAP 데이터 및 분석. (A) (i) 미세소관 선탠토이드 및 (ii) GFP-MAP65의 현미경 시계열 데이터, 및 (iii) 63 s에서 광표백시킨 시안 중의 마젠타 및 GFP-MAP65에서 미세소관을 갖는 두 채널의 오버레이 이미지, 및 추가적인 5분 동안 관찰된 (i) 정량화된 강도 (i) ) 표백 영역 (마젠타 원) 및 배경 (진한 회색 원) 및 (ii) 표백 영역 (시안 사각형) 및 배경 (진한 회색 사각형)의 GFP-MAP65 채널에서의 미세 소관 채널. (c) 데이터는 배경 잡음에 대해 보정되고 미세소관 채널(마젠타 원) 및 GFP-MAP65 채널(시안 사각형)에 대해 재스케일링되었다. 미세 소관은 회복되지 않지만 GFP-MAP65는 회복의 진폭과 시간 척도를 찾기 위해 상승하는 지수 붕괴에 적합하고 적합 할 수 있습니다 (진한 회색 선). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 기사는 MAP65, 식물 기반 미세 소관 가교제 및 PEG를 크라우밍 제로 사용하여 촉각제 모양의 미세 소관 어셈블리를 형성하기위한 프로토콜을 제시합니다.

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

이 프로토콜은 항-병렬 가교결합제, MAP65를 사용하여 미세소관 촉각제의 자발적인 자가조직을 가능하게 한다. 이 시스템은 미세 소관 조직과 유사 분열 스핀들과 같은 생물학적 시스템을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 가장 큰 장점은 재현성이 뛰어나고 많은 실험실에서 접근 할 수있는 미세 소관에 스핀들과 같은 모양을 재현 할 수있는 최소한의 시스템이라는 것입니다.이 방법은 세포 시스템에 적용 할 수있을뿐만 아니라 메조 스케일 액정 연구의 모델로도 사용할 수 있습니다. 튜불린을 준비하려면 먼저 영하 80도 냉동고에서 동결 건조 된 튜불린 한 밀리그램을 함유 한 라벨되지 않은 튜불린의 분취량을 꺼내 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 차가운 PEM-80 200 마이크로 리터를 넣으십시오.모든 동결 건조물을 용해시키려면 튜브를 얼음 위에 10 분 동안 보관하십시오. 다음으로, 영하 80도 냉동고에서 동결건조된 튜불린 분말 20마이크로그램이 들어있는 로다민 표지된 튜불린 튜브를 꺼내 얼음 위에 보관하십시오. 그런 다음 네 마이크로 리터의 차가운 PEM-80을 첨가하고 튜브를 얼음 위에 10 분 동안 유지하여 모든 동결 건조물을 용해시킵니다.일단 동결건조된 튜불린이 용해되면, 재현탁된 표지되지 않은 튜불린 용액 100 마이크로리터를 네 마이크로리터 로다민 표지된 튜불린 용액에 첨가한다. 그런 다음 여섯 번에서 일곱 번 매우 천천히 파이핑하여 용액을 혼합하십시오. 나머지 100 마이크로 리터의 표지되지 않은 튜불린 용액을 저장하려면 먼저 튜브를 액체 질소에 삽입하여 용액을 동결 한 다음 튜브를 영하 80 °C로 유지하여 나중에 사용하십시오.다음으로, 튜불린 믹스를 각각 15 마이크로리터를 추가하여 일곱 개의 새로운 튜브에 분배한다. 이전에 입증 된 바와 같이 액체 질소로 튜브를 동결시키고 나중에 사용할 수 있도록 영하 80도에 보관하십시오. 실험을 수행하기 위해 유동 챔버를 조립하려면 먼저 이중 증류수로 유리 슬라이드를 청소하고 보풀이없는 실험실 닦음으로 건조하십시오.다음으로, 슬라이드를 먼저 에탄올로 세척한 다음 이중 증류수로 세척한다. 흐름 경로를 만들려면 40~50mm 길이의 양면 테이프를 자릅니다. 그런 다음 두 개의 더 얇은 테이프 스트립을 만들고 두 개의 스트립을 슬라이드에 다섯 밀리미터에서 여덟 밀리미터 간격으로 놓습니다.그런 다음 실란화 된 커버 슬립을 흐름 경로 위에 놓습니다. 그런 다음 슬라이드를 밀봉하고 펜 뒷면으로 테이프 영역을 부드럽게 눌러 양면 테이프 스트립을 덮었습니다. 씰이 잘 만들어지면 테이프가 반투명에서 투명으로 바뀌어야합니다.가장자리에 있는 여분의 테이프를 제거하려면 면도날로 테이프를 자르고 유량실 입구에서 한 밀리미터만 남겨 둡니다. 그런 다음 챔버에 적절한 실험 매개 변수를 라벨링하여 선탠토이드 실험을 수행하기 위해 먼저 필요한 모든 시약을 얼음에 해동하고 작업 중에 얼음 위에 보관하십시오. 다음으로, PEM-80에 용해 된 20 마이크로 리터의 5 % 비이온성 블록 공중합체 계면 활성제로 유동 챔버를 챔버의 양쪽 끝에서 작은 방울로 코팅하여 내부에 기포가 형성되는 것을 방지하십시오.그런 다음 유동 챔버를 젖은 보풀이없는 실험실 닦음으로 페트리 접시로 만든 습한 챔버에 적어도 다섯 ~ 일곱 분 동안 닦으십시오. 다음으로, PEM-80, GMPPCPP, 플루로닉 F-127, 디티오트레이톨, 글루코스, 폴리에틸렌 글리콜, 튜불린 믹스를 앞서 만든 튜불린 믹스, 그리고 MAP65를 GFP MAP65와 혼합하여 튜브를 얼음 위에 유지하여 멸균 튜브에서 5 ~ 6 번 피펫팅하여 멸균 튜브에서 시각화합니다. 이어서, 글루코스 옥시다제와 카탈라아제의 미리 혼합된 용액 중 한 마이크로리터를 튜불린-MAP 혼합물의 튜브에 첨가하고, 일곱 내지 여덟 번 파이핑하여 다시 혼합한다.용액의 총 부피를 별도의 챔버에서 사용할 두 부분으로 나눕니다. 한편, 유동 챔버에 이전에 첨가된 액체는 튜불린-MAP 믹스를 유동 챔버에 첨가하는 것과 함께 챔버의 다른 쪽 끝에서 보풀이 없는 실험실 와이프를 사용하여 모세관 작용에 의해 제거되어야 한다. 샘플이 챔버 내부에 완전히 들어가면 5 분 에폭시를 사용하여 챔버의 두 끝을 밀봉하고 약 30 분 동안 섭씨 37도에서 유지하여 미세 소관 촉각을 핵으로 만들고 성장시킵니다.형광 현미경으로 촉각을 이미징하려면 형광에서 충분한 빛을 수집하기 위해 60X 이상의 배율에서 1.2 이상의 수치 조리개를 가진 목표를 사용하십시오. 무료 금속 산화물 반도체 또는 전하 결합 장치 카메라로 이미지를 녹화합니다. 샘플을 유지하려면 섭씨 37도로 설정된 환경 챔버에 보관하십시오.대안으로, 열풍 스테이지 히터 및 순환하는 따뜻한 물을 갖는 객관적인 온도 제어 칼라를 포함한 다른 스테이지 히터가 이러한 목적을 위해 사용될 수 있다. 로다민 튜불린의 정확한 형광을 위해 적절한 여기 소스가 필수적이므로 양질의 이미지를 위해 샘플에서 적어도 하나의 밀리와트의 전력을 가진 561나노미터 레이저를 사용하십시오. 그러나 GFP MAP65의 경우 여기 소스를 488 나노 미터 레이저로 변경하십시오.광역 후광 형광 현미경을 사용하는 경우 540 12.5 나노 미터의 여기, 545 나노 미터의 이색성 12.5 나노 미터 컷오프 및 575 나노 미터 길이의 방출을 가진 로다민 필터 큐브를 사용하십시오. GFP MAP의 경우, 480 15 나노미터의 여기, 505 나노미터의 이색성 15 나노미터의 컷오프 및 515 나노미터 롱 패스의 방출이 있는 GFP 필터 큐브를 사용하십시오. 카메라의 강도 스케일이 포화되지 않도록 조명 전력과 노출 시간이 되도록 한 후 서로 다른 영역의 최소 10개 이상의 이미지를 촬영하여 적색 및 녹색 채널 모두에서 100개 이상의 촉각을 촬영하고 분석을 위해 16비트 TIFF 이미지로 저장합니다.이 프로토콜을 사용하면 30 분 이내에 형성이 완료된 미세 소관 촉각류를 현미경으로 직접 시각화 할 수 있습니다. 촉각은 튜불린 채널의 561 나노 미터 레이저와 MAP65 채널의 488 나노 미터 레이저로 볼 수 있습니다. 이미지는 또한 서로 완벽하게 겹칩니다.이 방법에서는 촉각제의 길이와 너비도 측정 할 수 있습니다. 선인장의 강도 프로파일은 폭에 따라 달라지는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 미세소관 촉각의 불이동성 성질은 광표백 또는 FRAP 실험 후의 형광 회복에 의해 입증되었으며, 이는 광표백 후 형광의 어떠한 회복도 나타내지 않았다.한편, FRAP 실험은 MAP65의 이동성 특성을 밝혀 냈으며, 이는 광표백 후 점진적인 회복과 형광을 관찰 할 수있었습니다. MAP65에 의한 이러한 형광 회복은 회복의 진폭 및 시간 척도를 찾기 위해 상승하는 지수 붕괴에 적합할 수 있다. 선인장 실험 부분은 튜불린이 얼음에서 빨리 나빠질 수 있으므로 10 ~ 12 분 이내에 완료되어야하며, 이는 촉각의 핵에 해로울 수 있습니다.다른 미세 소관 가교 단백질과 가교 운동 단백질, 미세 소관을 움직일 수있는 효소와의 향후 연구는 유사 분열 스핀들의 자기 조직에 대한 새로운 정보를 계속 노출 할 것입니다.

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이 동영상은 액틴 및 미세소관 중합 역학을 시각화하기 위한 전반사 현미경 기반 기술인 TIRF에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 액틴과 미세소관 결합 역학의 고해상도 이미징을 실시간으로 수행할 수 있으며, 이는 세포 누화를 이해하는 데 필수적입니다.

액틴과 미세소관 결합 역학을 시각화하기 위한 TIRF 현미경 검사

미세 소관은 본질적으로 불안정 폴리머, 그리고 성장과 단축 사이에 자신의 전환 확률 통제하기가 어렵습니다. 여기에서 우리는 photoablatable 안정 캡으로 분할 미세 소관을 사용하여 프로토콜을 설명합니다. 분할 된 미세 소관 해중합함으로써 분해 미세 소관의 끝 동작의 분석을 지원, 높은 공간적 해상도로 트리거 될 수 있습니다.

분해 미세 소관 엔드에 힘 입어 모션을 연구하기 위해 분단 미세 소관의 준비

여기서, TIRF 현미경 기반 시험관내 재구성 분석법이 제시되어 두 미세소관 집단의 역학을 동시에 정량화하고 비교한다. 가교된 미세소관 다발 및 단일 미세소관 상에서 다수의 미세소관-관련 단백질의 집단 활성을 동시에 보는 방법이 기술된다.

TIRF 현미경에 의한 시험관 내에서 가교 및 단일 미세 소 관 의 역학의 동시 시각화

여기에서는 시험관 내에서 미세소관 다발을 재구성하고 동시 광학 트래핑 및 전반사 형광 현미경을 사용하여 그 안에 가해지는 힘을 직접 정량화하는 프로토콜을 제시합니다. 이 분석은 활성 미세소관 네트워크 내에서 단백질 앙상블에 의해 생성된 힘과 변위의 나노스케일 수준 측정을 허용합니다.

재구성된 활성 미세소관 다발 내의 힘을 직접 측정

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

액틴과 미세소관 커플링 다이내믹스 를 총 내부 반사 형광(TIRF) 현미경으로 시각화

여기에는 단백질 준비 및 구성과 활성 네마틱 감금을위한 우물 사용을 포함하여 미세 소관 및 키네신 모터에서 활성 네마틱스를 준비하는 방법이 제시됩니다.

미세소관 기반 활성 네마틱스의 형성, 제한 및 관찰

이 원고는 타우 hyperphosphorylation, 타우에 바인딩 microtubules, 및 약물 치료에 따라 세포내의 지역화를 측정을 측정 하기 위한 표준 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 약물 또는 다른 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩 대상 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다.

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

이 논문에서 초파리의 permeabilized 직업적인의 고해상도 respirometry를 사용 하 여 산소 소비량을 측정 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 조직의 고전적인 미토 콘 드 리아 격리 기술에 비해 최소한의 금액을 요구 하 고 얻은 결과 더 순수 관련.

조직의 최소 금액을 사용 하 여 초파리의 Permeabilized 섬유에 미토 콘 드리 아 산소 소비량의 측정

여기 선물이 murine 비보에 biotin과 사 세포 표면 단백질의 라벨에 대 한 프로토콜. 이 프로토콜은 마우스 신장 perfuse glomeruli, 격리 하 고, 관심사의 단백질의 생 immunoprecipitation를 수행 하는 방법에 대 한 정보를 포함 합니다.

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

우리는 X 선 결정학에 의하여 NEMO의 IKK 결합 도메인의 구조 결정에 대한 프로토콜을 기술합니다. 이 방법은 단백질 발현, 정제 및 특성화뿐만 아니라 단백질의 성공적인 결정 최적화 및 단백질의 구조 측정을 위한 전략을 포함합니다.

NEMO의 IKK 결합 도메인의 생산, 결정화 및 구조 결정

배우세요 MAP65와 PEG를 이용한 미세소관 택토이드 자체 조립 방법으로 세포골격 조직화와 분열핵 방추체 형성 메커니즘을 연구하세요. 이 최소화 시스템은 생물학적 및 액정 물리학 연구에 활용됩니다.

미세 소관 선인장체의 자체 조립

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