Name: 쥐 내측 위장근에서 신경근 접합부의 형태학적 특성 시각화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: 학습하세요 쥐 내측 위장근에서 형광 면역조직화학법을 이용한 신경근 접합부 형태학적 특성 분석 방법을. 이 기술은 정상 및 병리적 상태에서 신경근 접합부의 구조와 가소성을 평가하는 데 활용됩니다.

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이 연구는 CACMS 혁신 기금 (아니오. CI2021A03407), 중국 국립자연과학재단(제82004299호), 중앙공공복지연구소 기초연구기금(제호. ZZ13-YQ-068; ZZ14-YQ-032; ZZ14-YQ-034; ZZ201914001; ZZ202017006; ZZ202017015).

이 연구는 중국 의학 아카데미 침술 및 Moxibustion 연구소의 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 (승인 번호 2021-04-15-1). 모든 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용을위한 국립 보건원 가이드 (National Academy Press, Washington, D.C., 1996)에 따라 수행되었습니다. 세 마리의 성인 수컷 래트(Sprague-Dawley, 체중 230 ± 15 g)를 사용하였다. 쥐는 온도와 습도가 조절되고 음식과 물에 자유롭게 접근 할 수있는 12 시간의 빛 / 어두운주기에 보관되었습니다. 이 연구를 위한 장비 및 재료는 그림 1에 나와 있습니다.
1. 관류
<ol><li>쥐의 안락사를 유도하기 위해 250 mg / kg 트리브로모 에탄올 용액을 복강내 주입하십시오.</li>
	<li>호흡이 멈추면 흉강을 열어 가위와 포셉을 사용하여 심장에 접근하십시오. 왼쪽 심장 심실에서 대동맥쪽으로 정맥 내 카테터를 삽입 한 다음 오른쪽 귀를 자릅니다.</li>
	<li>실험용 쥐를 후드에 퍼퓨즈하십시오. 우측 귀에서 빠져 나오는 혈액이 맑을 때까지 0.9% 정상 식염수 100mL로 관류한 다음, 꼬리가 구부러지기 어려울 때까지 약 10분 동안 0.1M 인산염 완충액(PB, pH 7.4) 중의 4% 파라포름알데히드 250-300mL로 계속 관류시킨다.</li>
</ol>2. 지역 해부학
<ol><li>관류 후, 수술용 블레이드(도 2A)를 이용하여 양측 뒷다리의 피부를 제거하고 양측 좌골 신경과 내측 위장관근을 노출시킨다(도 2B).</li>
	<li>블레이드 (그림 2C)를 사용하여 뒷다리에서 양측 내측 위장관 근육을 조심스럽게 해부하고 2 시간 동안 0.1 M PB 중의 4 % 파라포름 알데히드 10 mL에 전체 근육을 고정시킨 후 고정시킨다.</li>
	<li>용액으로부터 근육을 제거하고 근육이 용액에 완전히 침지될 때까지 4°C에서 1일 동안 0.1 M PB 중의 25% 수크로오스 10 mL에서 근육을 냉동보호한다.</li>
</ol>3. 근육의 주름 절제술
<ol><li>근육 조직이 용액에 침지되면 냉동 부분 배지를 사용하여 슬라이딩 마이크로톰 시스템의 동결 단계에 고정하십시오. 80 μm 두께로 근육의 긴 축을 따라 근육을 수평으로 슬라이스하십시오.</li>
	<li>브러시를 사용하여 10 mL의 0.1 M PB (pH 7.4)가 있는 6-웰 배양 플레이트에 웰 당 7개의 냉동 절편을 질서 정연한 방식으로 배치한다. 참고: 섹션은 서로 다른 웰의 섹션이 인접하도록 순서대로 배치되므로 다른 얼룩에 사용되는 섹션을보다 일관되게 만듭니다.</li>
</ol>4. NF200, VAChT, α-BTX 및 Pha를 사용한 다중 형광 염색
참고: NF200, VAChT, α-BTX 및 Pha를 사용한 다중 형광 염색을 적용하여 신경 섬유, 시냅스 전 말단, 시냅스 후 니코틴성 아세틸콜린 수용체 및 근육 섬유를 각각 밝혀냈습니다.
<ol><li>웰당 4개의 절편을 10% 트리톤 X-100(0.5%)과 45μL의 정상 당나귀 혈청(3%)의 75μL를 함유하는 0.1 M PB 1.5mL와 함께 20 rpm의 오비탈 진탕기 상에서 30분 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>절편을 토끼 항-NF200 (1:1,000), 염소 항-VAChT (1:500)를 함유하는 1차 항체의 혼합 용액 1.5 mL를 1% 정상 당나귀 혈청, 및 0.5% 트리톤 X-100과 함께 0.1 M PB (pH 7.4) 중의 전사하고, 4°C에서 밤새 인큐베이션한다. 다음날, 절편을 20 rpm에서 오비탈 진탕기 상에서 각각 0.1 M PB (pH 7.4) 중에서 5분 동안 3x 세척한다.</li>
	<li>절편을 당나귀 항-토끼 AF488 (1:500) 및 당나귀 항-염소 AF546 (1:500)을 함유하는 이차 항체의 혼합 용액 1.5 mL에서 실온에서 1시간 동안 1시간 동안 인큐베이션하고, α-BTX, AF647 (1:500) 및 남표로이드 350 (1:500)의 바이오마커를 1% 정상 당나귀 혈청 및 0.5% 트리톤 X-100을 함유하는 0.1 M PB (pH 7.4) 중의 바이오마커를 인큐베이션한다. 빛으로부터 보호하십시오.</li>
	<li>0.1 M PB (pH 7.4)로 각각 5분 동안 3x 세척한 후, 절편을 현미경 슬라이드에 장착하였다. 관찰을 위해 증류수에 50 % 글리세린을 사용하여 커버 글라스를 섹션에 바르십시오.</li>
</ol>5. NF200, S100, α-BTX 및 DAPI를 사용한 다중 형광 염색
참고: 절차는 단계 4의 절차와 유사합니다. 주요 차이점은 일차 항체와 상응하는 이차 항체 사이입니다.
<ol><li>단계 4.2에서 닭 항-NF200 (1:6,000), 토끼 항-S100 (1:2,500) 및 이들의 상응하는 2차 항체: 당나귀 항-닭 AF488 (1:500) 및 당나귀 항토끼 AF546 (1:500), 뿐만 아니라 단계 4.3에서 α-BTX AF647 (1:500) 및 DAPI (1:50000)의 바이오마커를 사용한다.</li>
</ol>6. 관찰 및 분석
<ol><li>시편을 관찰하고 다음과 같은 대물 렌즈가 장착 된 공초점 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 촬영하십시오 : 0.75의 NA가있는 20x 렌즈와 0.95의 NA가있는 40x 렌즈.</li>
	<li>다중 형광 염색에 상응하는 350 nm (Pha), 488 nm (NF200), 546 nm (VAChT 및 S100), 647 nm (α-BTX) 또는 DAPI의 여기 및 방출 파장을 사용한다. 이미지 캡처 해상도를 640 x 640 픽셀로 설정합니다. 참고: 640 x 640 픽셀 해상도는 이미지가 Z 스택으로 캡처되었기 때문에 선택됩니다. 1024 x 1024 픽셀 해상도로 Z 스택에서 이미징 및 광표백이 느려집니다.</li>
	<li>시작 초점 평면과 끝 초점 평면을 설정합니다. 스텝 크기를 1μm 또는 2μm로 설정합니다. 깊이 패턴, 이미지 캡처 및 Z 시리즈를 선택합니다.</li>
	<li>20x에서 촬영된 하부 배율 이미지의 경우, 105 μm 핀홀을 사용하여 각 80 μm 두께의 섹션으로부터 2 μm 스텝 크기로 40개의 이미지(Z-스택)를 캡처한다. Z축을 통한 프로젝션/지형 모드와 강도 투영을 선택하여 모든 이미지를 단일 초점으로 통합합니다.</li>
	<li>40x에서 촬영된 더 높은 배율 이미지의 경우, 줌을 2로 설정하고 105μm 핀홀을 사용하여 각 80μm 두께의 섹션에서 1μm 스텝 크기로 80개의 이미지(Z-스택)를 캡처합니다. 모든 이미지를 단일 초점으로 통합합니다.</li>
	<li>도27에서 앞서 설명된 바와 같이 이미지 처리 시스템을 이용하여 입체 패턴의 이미지를 재구성한다.</li>
</ol>

<ol><li>Kawabuchi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spatiotemporal+relationship+among+Schwann+cells%2C+axons+and+postsynaptic+acetylcholine+receptor+regions+during+muscle+reinnervation+in+aged+rats%5BTitle%5D)+AND+%22TheAnatomical+Record%22%5BJournal%5D)">The spatiotemporal relationship among Schwann cells, axons and postsynaptic acetylcholine receptor regions during muscle reinnervation in aged rats.</a> TheAnatomical Record. 264 (2), 183-202 (2001).</li>
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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

우리는 근육 절편의 성공적인 다중 염색을 수행하고 쥐 내측 위장관 근육의 두꺼운 절편에서 NMJ의 형태학적 특성을 드러내기 위한 형광 면역조직화학의 사용에 필요한 기술적 세부사항을 기술하였다. 이 접근법을 사용함으로써, PSCs와 사전 및 사후 시냅스 요소의 미세한 세부 사항 및 공간 상관관계가 공초점 현미경 하에서 분석되고 평가될 수 있고, 입체 패턴으로 추가로 재구성될 수 있다. 여기서, NMJ의 형태학적 특성을 밝히기 위해 다양한 종류의 바이오마커가 사용되었는데, 여기서, NF200은 수초화된 축삭 20,21 상에서 고도로 발현되고, 시냅스 전 말단(22)에서 축적된 VAChT는 α시냅스 후 AchRs 23,24, 및 S100은 PSCs 25,26에 도시되어 있다....

신경 근 접합부(NMJ)1,2,3,4의 3가지 필수 구조적 성분으로서, 시냅스 전 운동 축삭 말단의 형태학적 측면, 니코틴성 아세틸콜린 수용체(AchRs)를 함유하는 시냅스 후 막, 및 시냅스 주위 슈완 세포(PSCs)가 광범위하게 조사되었다. 골격근의 얇은 절편 및 전체 탑재 표본은 전자 현미경 5,6, 공초점 현미경 7,8 및 광 시트 현미경 9,10과 같은 다른 조직학적 기술로 검사되었습니다. NMJ의 형태학적 특성이 상이한 측면에서의 이들 기술에 의해 입증되었지만, 비교로서, 공초점 현미경은 여전히 NMJ의 상세한 형태학의 이미징을 위한 이상적인 선택이다.
최근에는 NMJ의 구조적 성분을 보여주기 위한 많은 신기술이 개발되고 있다. 예를 들어, thy1-YFP 트랜스제닉 형광 마우스는 생체내 및 시험관내10,11에서 운동 축삭 및 운동 말단 플레이트를 관찰하는데 직접 사용되어 왔다. 추가적으로, 형광 α-BTX의 정맥내 주사는 광시트 현미경 9,12로 검사하기 위해 조직 광학 클리어링 치료를 사용하여 야생형 및 트랜스제닉 형광 마우스의 전체 탑재 골격근에서 모터 엔드 플레이트의 공간적 분포를 밝히기 위해 적용되었다. 그러나 이러한 고급 방법으로 볼 수있는 시냅스 전후 요소 외에도 PSC를 동시에 시연 할 수 없습니다.
축적 증거는 말초 신경교 세포로서 PSCs가 NMJ의 발달 및 안정성, 생리적 조건 하에서 NMJ의 시냅스 활성의 조절, 신경 손상 후 NMJ의 재생에 기여하는 시냅스 전 말단과 밀접하게 관련되어 있음을 나타냅니다13,14,15 . NMJ의 세포 구조를 고려할 때, 이 프로토콜은 PSC, 시냅스 전후 및 사후 요소를 동시에 표지하는 적절한 후보이며, 정상 및 병리학적 조건 하에서 NMJ의 완전성 및 가소성을 평가하는데 잠재적으로 사용된다. 예를 들어, NMJ의 강도, 시냅스 후 운동 말단판의 형태학 및 부피, NMJ의 신경과민 및 탈핵, 생리적 및 병리학적 상태의 근육에서의 PSC의 수를 비교한다.
위장관 근육은 종아리에서 부풀어 오르는 가장 큰 근육으로, 사지에서 피부와 이두박근 대퇴골 근육을 제거하여 쉽게 해부됩니다. 근육은 종종 근육 위축, 신경근 변성, 근육 성능 및 운동 유닛 힘을 생체외 또는 생체내 16,17,18에서 평가하기 위해 선택된다. 그러나, 상기 기술은 또한 다양한 골격근으로부터 NMJ의 형태학적 특성을 드러내는데 적합하다. 동시에, 두꺼운 근육 절편은 얇은 절편(7,8) 및 놀린 근섬유(19)에 비해 NMJ의 더 완전한 형태학 및 양을 나타낼 수 있다.
이들 연구에 따라, 래트 내측 위장관 근육을 본 연구에서 표적 조직으로 선택하였고, NMJ의 구조적 성분에 따라 다양한 종류의 바이오마커로 다중 형광 염색을 위해 80 μm의 두께로 슬라이스하였다. 여기서, 뉴로필라멘트 200(NF200)20,21, 수포아세틸콜린 수송체(VAChT)22, 알파-분가로톡신(α-BTX)23,24, 및 S10025,26을 각각 신경섬유, 시냅스 전 말단, 시냅스 후 AchRs, 및 PSCs를 표지하는데 사용하였다. 또한, 근육 조직 및 세포 핵의 배경은 팔로이드인 및 DAPI로 추가로 역염색되었다.
이 연구에서, 우리는 NMJ의 세포 구조를 더 두꺼운 고정 표본에 상응하는 바이오마커와 동시에 염색하기위한 정제 된 프로토콜을 개발할 것으로 기대하며, 이는 공초점 현미경 검사에 사용하기에 더 편리하며 PSC의 상세한 구조, 시냅스 전후 요소의 세부 구조 및 서로에 대한 공간적 상관 관계에 대한 훨씬 더 많은 정보를 얻는 데 도움이됩니다. 방법론의 관점에서, 이 프로토콜은 정상 및 병리학적 조건 하에서 NMJ의 형태학적 특성을 평가하는 데 도움이 될 수 있다.

<table><tbody><tr><td>4',6-디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로</td>라이드 <td>ThermoFisher</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td><td>올림푸스</td><td>FV1200</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 치킨 AF488</td><td>잭슨</td><td>149973 (703-545-155)</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 염소 AF546</td><td>ThermoFisher</td><td>A11056</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 AF488</td><td>ThermoFisher</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>당나귀 안티 토끼 AF546</td><td>ThermoFisher</td><td>A10040</td><td></td></tr><tr><td>냉동 단면 매체</td><td>ThermoFisher</td><td>Neg-50</td><td>무색</td></tr><tr><td>현미경 커버 유리</td><td>Citotest</td><td>10212450C</td><td></td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Yamato</td><td>REM-710</td><td></td></tr><tr><td>Neurofilament 200</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N4142</td><td>토끼</td></tr><tr><td>뉴로 필라멘트 200</td><td>Abcam</td><td>ab4680</td><td>닭</td></tr><tr><td>일반 당나귀 혈청</td><td>잭슨 면역 연구소</td><td>017-000-12</td><td>10ml</td></tr><tr><td>일반 식염수</td><td>산동 Hualu 제약 Co.Ltd</td><td></td><td>H37022750 250ml</td></tr><tr><td>파라포름알데히드</td><td>맥클린</td><td>P804536</td><td>500g</td></tr><tr><td>팔로이딘 AF350</td><td>ThermoFisher</td><td>A22281</td><td></td></tr><tr><td>정밀 연동 펌프</td><td>더 긴</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>S100-&beta;</td><td>Abcam</td><td>ab52642</td><td>토끼</td></tr><tr><td>인산나트륨 dbasic 십이수화물</td><td>맥클린</td><td>S818118</td><td>500g</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 이수화물</td><td>맥클린</td><td>S817463</td><td>500g</td></tr><tr><td>자당</td><td>맥클린</td><td>S818046</td><td>500g</td></tr><tr><td>Superfrost plus 현미경 슬라이드</td><td>ThermoFisher</td><td>4951PLUS-001E</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>Solarbio 생명 과학</td><td>9002-93-1</td><td>100 ml</td></tr><tr><td>소포 아세틸 콜린 수송체</td><td>Milipore</td><td>ANB100</td><td>염소</td></tr> <tr><td>및 알파; - bungarotoxin AF647 접합체</td><td>ThermoFisher</td><td>B35450</td><td></td></tr></tbody></table>

쥐 내측 위장근에서 신경근 접합부의 형태학적 특성 시각화

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

신경근 접합부 (NMJ)는 운동 뉴런에서 골격근으로의 신호 전달을 담당하는 복잡한 구조이며 시냅스 전 운동 축삭 말단, 시냅스 후 니코틴 아세틸 콜린 수용체 (AchRs) 및 시냅스 주위 슈완 세포 (PSCs)의 세 가지 필수 조직 학적 구성 요소로 구성됩니다. NMJ의 형태학적 특성을 입증하기 위하여, 래트 내측 위장관근을 표적 조직으로 선정하고, 운동 신경 섬유 및 이들의 시냅스 전 말단에 대한 뉴로필라멘트 200(NF200) 및 수포성 아세틸콜린 수송체(VAChT)를 포함하는 다양한 종류의 바이오마커와 함께 다중 형광 염색을 사용하여 시냅스 후 니코틴 AchRs에 대한 알파-분가로톡신(α-BTX)을 조사하고, 및 PSC에 대한 S100. 이 연구에서, 염색은 두 그룹으로 수행되었다: 첫 번째 그룹에서, 샘플은 NF200, VAChT, 및 α-BTX로 염색되었고, 두 번째 그룹에서는 샘플을 NF200, α-BTX 및 S100으로 염색하였다. 두 프로토콜 모두 NMJ의 상세한 구조를 효과적으로 입증할 수 있음을 보여주었다. 공초점 현미경을 사용하여 시냅스 전 말단, 시냅스 후 수용체 및 PSC의 형태 학적 특성을 관찰하고 Z 스택 이미지를 입체 패턴으로 재구성하여 다른 라벨링 간의 공간 상관 관계를 추가로 분석했습니다. 방법론의 관점에서, 이들 프로토콜은 생리학적 조건 하에서 NMJ의 형태학적 특성을 조사하기 위한 유용한 참고문헌을 제공하며, 이는 또한 말초 신경 손상 및 재생과 같은 NMJ의 병리학적 변경을 평가하는데 적합할 수 있다.

다중 형광 염색 후, 상응하는 표지는 NF200 양성 신경 섬유, VAChT 양성 시냅스 전 시냅스 말단, α-BTX 양성 시냅스 후 AchRs, S100 양성 PSCs, 팔로이드 양성 근육 섬유, 및 DAPI 표지된 세포 핵을 갖는 래트 내측 위장관 근육의 80 μm 두께 절편에서 질서 정연하게 입증되었다 (도 3 및 도 4).
NF200 양성 신경 섬유가 다발로 달리고 VAChT 양성 사전 시냅스 말단에 분기하여 α-BTX 양성 후 시냅스 후 AchRs와 미러 관계를 형성하는 것으로 나타났습니다 (그림 3). 또한, S100 양성 PSCs는 시냅스 전 말단에 가까운 NF200 양성 신경 섬유 주위에서 검출되었다(도 4).
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상기 프로토콜은 상이한 바이오마커, 즉, 뉴로필라멘트 200, 수포성 아세틸콜린 수송체, 알파-분가로톡신 및 S100을 갖는 형광 면역조직화학을 사용하여 래트 내측 위장관근에서 시냅스 전 말단, 시냅스 후 수용체, 및 시냅스 주변 슈완 세포 사이의 공간적 상관관계를 조사하는 방법을 나타낸다.

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...

이 프로토콜은 정상 및 병리학 적 조건 하에서 신경 근육 접합부의 완전성 및 가소성을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 Schwann 세포를 동시에 라벨링하고 단일 근육 섹션에 실험실 동물을 사전 및 게시하는 것입니다. 성인 수컷 쥐를 안락사 한 후, 쥐를 후드에 넣고 흉강을 열어 가위와 포셉을 사용하여 심장에 접근하십시오.왼쪽 심장 심실에서 대동맥쪽으로 정맥 내 카테터를 삽입하고 오른쪽 오라클을 자릅니다. 다음으로, 오른쪽 신탁에서 나오는 혈액이 맑을 때까지 0.9 % 정상 식염수 100 밀리리터로 관류를 시작하십시오. 그 후 250 내지 300 밀리리터의 4% 파라포름알데히드와 0.1 몰 포스페이트 완충액 또는 PB pH 7.4에서 10분 동안 계속 관류시킨다.관류 후, 수술 블레이드를 사용하여 양측 뒷다리의 피부를 제거하고 양측 좌골 신경과 내측 위장관 근육을 노출시킵니다. 칼날을 사용하여 뒷다리에서 양측 내측 위장관 근육을 조심스럽게 해부하고 전체 근육을 4 % 파라 포름 알데히드의 10 밀리리터에 접히십시오. 2시간 후, 용액으로부터 근육을 제거하고 섭씨 4도에서 1일 동안 0.1몰 PB의 25%수크로오스 10밀리리터에 냉동보호한다.일단 근육 조직이 수크로오스 용액에 침지되면, 동결 섹션 배지를 사용하여 슬라이딩 마이크로톰 시스템의 동결 단계 상에 고정시킨다. 근육을 80 미크론 두께로 근육의 긴 축을 따라 수평으로 슬라이스하십시오. 브러시를 사용하여 웰 당 일곱 개의 냉동 섹션을 0.1 몰 PB 10 밀리리터의 여섯 웰 배양 접시에 질서 정연하게 배치하십시오. 형광 염색을 위해, 20 rpm의 오비탈 진탕기 상에서 75 마이크로리터의 10%Triton X 100 및 45 마이크로리터의 정상 당나귀 혈청을 함유하는 0.1몰 PB의 1.5 밀리리터로 웰당 4개의 절편을 인큐베이션한다.30분 후, 절편을 토끼 항신경 필라멘트 200, 염소 항소포성 아세틸콜린 수송체 중의 0.1몰 PB, 1% 정상 당나귀 혈청, 및 0.5%Triton X 100을 함유하는 1차 항체의 혼합 용액 1.5밀리리터 내로 옮기고 섭씨 4도에서 밤새 인큐베이션한다. 다음날, 절편을 20 rpm의 오비탈 쉐이커에서 0.1 몰 PB로 각각 5분 동안 세 번 세척한다. 마지막 세척 후, 절편을 당나귀 항토끼 AF 488 및 당나귀 항염소 AF 546을 함유하는 이차 항체의 혼합 용액에서 인큐베이션하고, 뿐만 아니라 알파 분가로독소 AF 647 및 팔로이딘 350을 함유하는 바이오마커를 1% 정상 당나귀 혈청 및 0.5 트리톤 x 100을 함유하는 0.1 M PB에 1시간 동안 인큐베이션하고, 빛으로부터 그들을 보호하십시오.인큐베이션 후, 절편을 PB로 세척하고 현미경 슬라이드에 장착한다. 증류수에 50 % 글리세린을 사용하여 커버 글라스를 섹션에 바르십시오. 수치 조리개가 0.75인 20 x 주관적 렌즈와 0.95의 수치 조리개를 가진 40 x 렌즈가 장착된 con focal 이미징 시스템을 사용하여 시편을 관찰하고 이미지화합니다.다중 형광 영상화의 경우, 텍스트 원고에 설명된 대로 각 바이오마커의 여기 및 방출 파장을 설정한다. 이미지 캡처의 해상도를 640 x 640 픽셀로 설정합니다. 그런 다음 시작 및 끝 초점면을 설정합니다.단계 크기를 하나 또는 두 미크론으로 설정합니다. 그런 다음 깊이 패턴, 이미지 캡처 및 Z 시리즈를 선택합니다. 20X에서 낮은 배율 이미지의 경우 105미크론 핀홀을 사용하여 두 미크론 스텝 크기로 40Z 스택 이미지를 캡처합니다.Z축을 통한 프로젝션 또는 지형 모드와 강도 프로젝션을 선택하여 모든 이미지를 하나의 초점으로 통합합니다. 40X에서 더 높은 배율 이미지의 경우 줌을 두 개로 설정하고 105미크론 핀홀로 설정하여 한 미크론 스텝 크기로 80Z 스택 이미지를 캡처합니다. 모든 이미지를 하나의 초점으로 통합합니다.이미지 처리 시스템을 사용하여 삼차원 패턴의 이미지를 재구성합니다. 내측 위장관 근육과 신경 필라멘트 200 양성 신경 섬유, 수포성 아세틸콜린 수송체 양성 프리-시냅스 말단, 알파분가로독소 양성 시냅스 후 아세틸콜린 수용체, S100 양성 시냅스 후 슈완 세포, 팔로이드 양성 근육 섬유, 및 DAPI 표지된 세포 핵의 대표적인 공간적 상관관계가 여기에서 입증된다. 뉴로필라멘트 200개의 양성 신경 섬유가 번들로 달렸다.이들 신경 섬유는 수포성 아세틸콜린 수송체 양성 시냅스 전 말단에 분지를 주었고, 이는 알파 분가로독소 양성 시냅스 후 아세틸콜린 수용체와 거울 관계를 형성하였다. 또한, S100 양성 시냅스 주위 슈완 세포는 시냅스 전 말단에 가까운 뉴로필라멘트 200 양성 신경섬유 주변에서 검출되었다. 공간적 상관관계는 상이한 관점에서 신경근 접합부의 상세한 형태학적 특성을 나타내는 삼차원 패턴으로 추가로 나타내었다.근육 섹션에서 더 많은 이미징을 관찰하기 위해서는 80 미크론의 두께로 긴 축을 따라 근육을 수평으로 슬라이스하는 것이 중요합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이러한 신경 근육 접합 (NMJs)에서 터미널 Schwann 세포 (SCS)과 같은 밀도가 높은 포장 조직에 개별 셀을 표시하는 것은 도전입니다. "선형 사진 표백"표백 순서는 시간 경과 영상과 결합 할 수있는 triangularis sterni의 근육 explant, 편리하게 신경 근육 준비에 예를 들어, 단일 터미널 SCS를 delineating 수...

연속 신경 근육 분기점에서 싱글 Schwann 세포를 윤곽을 그리다하는 사진 표백

초파리 신경근 접합부(NMJ)는 시냅스의 형태와 기능을 연구하기 위한 모델로 사용됩니다. 이 비디오는 연구자들이 NMJ를 특성화하기 위해 정량화하는 중요한 특징에 대해 설명합니다. 예제 프로토콜은 정량화를 자동으로 수행할 수 있는 소프트웨어를 보여줍니다.

초파리 신경근접합부(NMJ) 정량화: 시냅스 형태 및 기능을 평가하는 방법

출처: Marinello, M., et al. 결합된 공초점 현미경과 초고해상도 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부의 특성화. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 시냅스 전 및 시냅스 후 구조를 시각화하고 분석하기 위해 공초점 및 초고해상도 현미경을 사용하여 쥐 근육 조직의 신경근 접합부의 준비, 면역염색 및 이미징을 보여줍니다.

결합된 공초점 현미경과 초고해상도 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부의 특성화

이 비디오에서 우리는 마우스의 트랜스 대 복부 근육의 해부에 대한 프로토콜을 시연하고 신경 근육 접합을 시각화하기 위해 면역 형광 및 현미경 검사를 사용합니다.

전신 탈염 신경 근육 정션 분석을위한 트랜스 대 복부 근육의 해부

신경근 접합부(NMJ)는 때때로 시냅스 실패로 이어질 수 있는 다양한 조건에서 변경됩니다. 이 보고서는 이러한 구조적 변화를 정량화하기 위한 형광 현미경 기반 방법을 설명합니다.

신경 근육 접합 : 측정 시냅스 크기, 공 초점 형광 현미경을 사용하여 시냅스 단백질 농도의 분열 및 변경

두 이미지 분석 알고리즘, "초파리 NMJ Morphometrics"및 "초파리 NMJ Bouton은 Morphometrics"가 자동 초파리 신경근 접합부 (NMJ)의 구 개 형태 적 특징을 정량화하기 위해 만들어졌다.

높은 처리량 및 다중 파라 메트릭 정량화를위한 ​​두 알고리즘<em&gt; 초파리</em&gt; 신경 근육 접합 형태학

여기서 우리는 인간 유도만능 줄기 세포 (iPSC)에서 시험관 내 NMJs를 생성하는 프로토콜을 제공합니다. 이 방법은 단일 우물에서 1 개월에 성숙한 형태와 기능을 가진 NMJs를 유도할 수 있다. 결과 NMJs 잠재적으로 관련 질병을 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다., 병리학 메커니즘을 공부 하거나 치료에 대 한 약물 화합물을 검사.

인체 유발 만능 줄기 세포에서 유도 된 체외 신경 근육 정션

신경 근육 접합 구성 요소를 정확하게 검출하는 능력은 병리학적 또는 발달 과정으로 인해 아키텍처의 수정을 평가하는 데 중요합니다. 여기서 우리는 정량 적 측정을 수행하는 데 사용할 수있는 전산 신경 근육 접합의 고품질 이미지를 얻기 위해 간단한 방법에 대한 완전한 설명을 제시합니다.

면역형광및 전체산 신경근육 접합의 형태 분석에 대한 단일 골격 근육 섬유의 해부

당사는 인간 원발성 메소포스트 유래 근투와 인간 유도만능 줄기 세포 유래 모터 뉴런을 공동 배양하여 상업적으로 이용 가능한 미세유체 장치에서 인간 모터 유닛을 생성하는 방법을 설명하며, 이로 인해 기능적으로 활성 신경 근육 접합이 형성된다.

미세 유체 장치에서 기능성 신경 근육 접합을 갖춘 인간 모터 유닛 생성

이 프로토콜은 SMA 및 ColQ 관련 CMS의 마우스 모델에서 병리학 적 변화를 정량화하는 데 사용되는 컨 포칼 및 STED 현미경을 결합하여 신경근 접합부의 형태 측정 분석 방법을 설명합니다.

결합된 공초점 및 초분해능 현미경에 의한 마우스의 신경근 접합부 특성 분석

여기에서는 신경근 접합부와 근육 세포의 미세소관 네트워크를 시각화하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다. Drosophila melanogaster의 강력한 유전 도구와 결합된 이 프로토콜은 신경계에서 미세소관 네트워크 조절 단백질의 역할에 대한 유전자 스크리닝 및 미세소관 역학 분석을 크게 용이하게 합니다.

초파리 유충 신경근 접합부 및 근육 세포를 사용하여 미세소관 네트워크 시각화

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쥐 내측 위장근에서 신경근 접합부의 형태학적 특성 시각화

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