Name: 장기 재배를 위한 인간 심근 조직의 제조 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: 학습하세요 생체 모방 챔버를 이용한 인간 좌심실 심근 조직의 장기 배양 방법을. 전하 및 후하를 적용하여 생리학적 환경을 재현하고 수축력과 운동학을 분석하는 이 기술은 심혈관 약물 효과 선별에 활용됩니다.

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연구는 DZHK 보조금 81Z0600207 (JH, PS 및 DM) 및 81X2600253 (AD 및 TS)이 자금을 지원했습니다.
저자들은 Claudia Fahney, Mei-Ping Wu 및 Matthias Semisch에게 셋업 준비와 조직 재배의 정기적 인 유지 보수에 대한 지원에 감사드립니다.

여기에 설명 된 실험을위한 조직 수집은 뮌헨 대학 (University of Munich)과 루르 대학 보훔 (Ruhr-University Bochum)의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board)의 승인을 받았다. 연구는 헬싱키 선언 지침에 따라 수행되었습니다. 환자들은 조직 수집 전에 서면 정보에 입각 한 동의를했습니다.
1. 조직 획득
<ol><li>심장 이식 또는 심장 수술을받는 환자로부터 인간 조직을 얻습니다.</li>
	<li>조직을 조달하기 전에 2 L의 심흉막 용액 (슬라이스 버퍼 (표 1)이라고도 함)을 준비하십시오.</li>
	<li>4 cm x 4 cm 크기의 경막 좌심실 (LV) 생검을 얻은 후, 조직을 즉시 (절제 후 5 분 이내) 대략 70 mL의 차가운 (4°C) 슬라이스 완충액을 함유하는 클로서블 플라스틱 일회용 멸균 비이커에 넣는다. 4°C에서 유지하십시오. 참고: 이 프로토콜에 사용되는 슬라이싱 버퍼는 최대 36시간 동안 조직의 냉장 보관(4°C)을 허용합니다. 이것은 실험실에 가깝지 않은 클리닉에서 조직의 차가운 수송을 허용합니다. 그러나 24 시간≤ 운송 시간이 최적 인 것으로 입증되었습니다.</li>
</ol>2. 아가로스와 비브라톰 준비
<ol><li>충분한 재배 챔버가 준비되고 멸균되었는지 확인하십시오 (그림 1A).<ol>
<li>챔버 및 흑연 전극을 1 L의 10% 이소프로판올 용액에 침지시키고 밤새 교반한다. 다음날, 챔버를 3분 동안 100% 이소프로판올 용액으로 옮기고 흑연 전극을 120°C에서 10분 동안 오토클레이브한다.</li>
		<li>챔버와 흑연 전극을 층류 후드 아래에서 공기 건조시키십시오.</li>
		<li>로커의 사용 가능한 위치에 따라 회로 기판을 각 챔버에 부착하십시오. 제조업체의 지침에 따라 두 개의 흑연 전극을 회로 기판에 놓습니다.</li>
		<li>오염을 방지하기 위해 챔버 위에 35mm 페트리 접시 뚜껑을 놓습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>시스템을 컴퓨터에 연결하여 37°C 및 5%CO2의 인큐베이터에서 Myodish 재배 시스템(재료 표 참조)을 설정합니다(그림 1B).</li>
	<li>4% 저용융 아가로스를 슬라이싱 완충액 (글루코스 없이; 표 2). 상기 아가로오스는 4°C에서 6개월 동안 보관될 수 있다.<ol>
<li>실험 당일에, 80°C에서 설정된 수조를 사용하여 스톡 부피의 아가로스 용액을 용융시킨다. 양에 따라 녹는 데 약 30 분이 걸립니다.</li>
		<li>아가로스가 액체일 때, 액체 아가로스 8 mL를 10 mL 주사기에 넣고 2 mL의 공기를 추가로 넣는다. 주사기를 멸균 캡으로 닫고 37°C 수조에 20분 동안 거꾸로 놓고, 아가로오스가 응고되는 것을 방지하고, 그 온도를 평형화시켜 샘플의 온열 손상을 방지한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>존재하는 경우, 조직 슬라이싱 적어도 30분 전에 비브라톰의 수냉 장치를 켜서 충분한 냉각 용량을 허용한다. 물 순환의 온도를 4 °C로 설정하십시오. 참고: 여기에 사용된 절단 트레이와 냉각판에는 모두 물 순환 기능이 내장되어 있었습니다. 이는 냉각 및 오염 위험을 낮추기 위해 적극 권장됩니다. 그러나 얼음을 냉각 기술로 사용하는 것도 가능합니다. 또한, 수냉 장치는 프로토콜의 이 시점에서 비브라톰의 절단 트레이 및/또는 냉각 플레이트에 연결될 필요가 없다.</li>
	<li>비브라톰의 슬라이싱 트레이와 샘플 플레이트를 청소하려면 모든 표면을 100% 이소프로판올로 3분 이상 플러싱합니다. 참고: 사용되는 비브라톰 시스템에 따라 비브라톰 설정이 다를 수 있습니다. 설치 및 블레이드 교정 방법에 대한 정보는 실험실에 있는 비브라톰의 설명서를 참조하십시오.</li>
	<li>절단 트레이를 최대 90 % -95 %까지 슬라이싱 버퍼로 채 웁니다. 현재 사용되는 셋업에서, 이것은 대략 400 mL에 해당한다. 수냉 장치의 튜브를 비브라톰의 절단 트레이 및 냉각 플레이트의 밸브에 연결합니다.</li>
	<li>준비에 필요한 모든 도구를 5 초 동안 100 % 이소프로판올 용액에 담그면 소독됩니다. 이소프로판올 용액에서 공구를 제거하고 층류 후드 아래에서 공기 건조하십시오.</li>
</ol>3. 트리밍 및 샘플 임베딩
<ol><li>조직 샘플을 차가운 슬라이싱 버퍼로 채워진 100 mm 페트리 접시에 옮깁니다. 접시를 4 °C의 냉각 플레이트 위에 보관하십시오 (냉각기에 연결하거나 얼음 위에 놓으십시오).</li>
	<li>핀셋으로 심내막을 잡고 가위를 사용하여 약 3mm의 심내막 조직을 잘라내어 심내막 섬유주를 제거합니다. 같은 방법으로, 심외막 아래의 과도한 지방 조직이있는 경우 제거하십시오.</li>
	<li>절단된 조직 샘플을 상향 조정하고, 정사각형 위치에 고정되는 네 개의 0.9 mm x 70 mm 20 G 바늘을 사용하여 2 cm x 2 cm 고무 패치로 고정시킨다 (0.9 cm x 0.9 cm; 그림 1C, D). 각 바늘 팁의 대각선 가장자리가 안쪽을 향하고 있는지 확인하십시오. 이것은 고정을 강화하고 심근의 손상을 방지합니다. 주의: 위에서 언급한 사각형의 방향은 예상되는 우세한 근섬유 방향에 직교해야 합니다.</li>
	<li>메스를 사용하여 네 바늘 사각형 외부의 모든 과도한 조직을 잘라냅니다. 원래 샘플의 크기가 허용하는 경우 동일한 원시 샘플에서이 준비 중에 두 개의 심근 조직 샘플을 사용하십시오.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 트리밍된 샘플을 멸균된 조직 조각에 올려 놓고 샘플에 남아 있는 과도한 슬라이싱 버퍼를 제거합니다. 샘플이 건조되는 것을 방지하려면 샘플을 10초 이상 조직에 보관하지 마십시오.</li>
	<li>샘플을 35mm 페트리 접시에 넣어 블레이드가 심근세포 정렬에 수직으로 절단되고 심외막이 아래쪽을 향하도록 합니다. 준비물에 두 개의 샘플이 포함되어 있는 경우 샘플이 가운데에 있는지 확인하고 서로 만지지 마십시오.</li>
	<li>수조에서 아가로스 주사기를 가져 와서 샘플을 아가로스에 담그십시오. (그림 2A). 아가로스를 냉각판에서 5 분 동안 응고시키십시오. 샘플은 페트리 접시와 접촉해야합니다.이 접시는 절단면이 지배적 인 심근 섬유 방향과 평행 할 수 있도록합니다. 주의: 기포를 방지하기 위해 주사기를 완전히 비우지 마십시오. 샘플의 침수 중에 주사기에 남아있는 아가로스의 양에주의하십시오. 샘플이있는 접시에 기포가있는 경우 조심스럽게 기포를 주사기로 다시 당깁니다.</li>
</ol>4. 절단 트레이에 샘플을 배치
<ol><li>주걱 또는 유사한 도구를 사용하여 35 mm 페트리 접시로부터 샘플(들)을 함유하는 고형화된 아가로스를 제거하고, 이를 샘플과 페트리 접시의 측면 사이에 엮어서 제거한다. 샘플을 덮은 채로 메스를 사용하여 아가로스 중 일부를 잘라냅니다. 주의: 아가로스를 너무 많이 제거하지 마십시오. X/Z 평면의 길고 짧은 면에 최소 5mm의 아가로오스가 남아 있어야 합니다. 참고: 4.2-4.4단계는 빠른 연속(즉, 최대 5초)으로 수행해야 합니다. 시작하기 전에 필요한 모든 도구를 손이 닿는 곳에 두십시오. 배치 후 샘플의 재배치는 불가능합니다. 접착제의 공기와 습기에 대한 노출을 제한하십시오. 공기 또는 유체와의 접촉은 접착제를 응고시켜 사용할 수 없게 만듭니다.</li>
	<li>피펫으로 60μL의 접착제를 절단 플랫폼의 중앙 안팎에 놓고 분배합니다.</li>
	<li>족집게를 사용하여 접착 된 부위 위에 아가로스에 포함 된 샘플의 심외경면을 놓습니다. 위치를 바꾸지 마십시오. 샘플의 심내막 측면은 아가로스에서 볼 수 있어야합니다. 접착제가 1 분 동안 굳어지게하십시오. 상단으로부터 샘플을 함유하는 아가로스를 무딘 도구(예를 들어, 핀셋)로 부드럽게 누르면서 아가로스로 절단되거나 손상되는 것을 방지한다.</li>
	<li>샘플 플랫폼을 슬라이싱 버퍼로 채워진 비브라톰의 절단 트레이에 지정된 위치에 놓습니다.</li>
</ol>5. 비브라톰 시작
<ol><li>진동 진폭을 1mm로 설정하고 초기 절삭 속도를 0.07mm/s로 설정합니다. 슬라이스의 두께를 300μm로 설정하여 슬라이스를 절단합니다.</li>
	<li>블레이드가 아가로오스 만 자르는 한, 절삭 속도를 최대로 높이십시오.이 경우 1.50mm / s입니다. 비브라톰이 조직을 절단하기 시작하자마자 즉시 속도를 0.07 mm / s로 줄이십시오. 참고: 조직이 매끄럽게 슬라이스되지 않은 경우(예: 샘플에 섬유성 영역이 큰 경우) 절단 진폭을 최대 1.5mm까지 높이고 절삭 속도를 0.04mm/s로 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.</li>
</ol>6. 슬라이싱 절차 중 중간 및 인큐베이터 준비
<ol><li>각 배양 챔버를 2.4 mL의 완전한 배양 배지로 채운다(표 3).</li>
	<li>배지가 채워진 배양 챔버를 37°C, 5%CO2, 21% O2, 및 80%의 습도로 설정된 배양기에서 배양 시스템 위에 놓는다. 배지를 적어도 20분 동안 평형화시킨다.</li>
	<li>재배 시스템을 컴퓨터와 연결하고 해당 소프트웨어 프로그램을 시작하십시오.</li>
	<li>로커 속도를 60rpm으로 설정하고 자극 파라미터(자극 펄스 및 주파수)를 미리 설정합니다. 인간의 심장 조각의 경우, 표준 자극을 50mA 전류로 설정하고, 각각 3ms 포지티브 전류, 1ms 일시 중지 및 반전 전류의 3ms 펄스로 구성된 이단계 임펄스로 분당 30비트(BPM)의 페이싱 속도로 설정합니다. 참고: 잘 보존된 조직에서 일반적인 자극 임계값은 약 15mA입니다. 신뢰할 수 있는 자극을 보장하고 자극 역치의 임의의 가능한 증가를 설명하기 위해, 자극 역치를 두 배 내지 세 배로 초과하는 값으로 전류를 설정하는 것이 좋다.</li>
	<li>소프트웨어의 전극 표시기를 확인하여 재배 챔버의 전극이 올바르게 작동하는지 확인하십시오. 참고: 재배 소프트웨어의 채널 표시기가 빨간색으로 바뀔 때마다 조치가 필요합니다. 이 경우, 바이폴라 펄스 전하들은 균형이 잡히지 않는다.</li>
</ol>7. 슬라이스 준비
참고 : 초기 심내막 하부 조각은 일반적으로 조직 배양에 적합하지 않으며 고르지 않은 형태 때문에 폐기해야합니다. 처음 다섯 개에서 10 개의 슬라이스 후에 슬라이스 텍스처와 형태가 향상됩니다. 이상적인 슬라이스는 적어도 1 cm x 1 cm이고, 섬유성 패치가 없거나 단지 제한되고, 단편화되지 않으며, 균질한 섬유 정렬을 갖는다 (도 2B, D). 심근 세포 섬유 사이에 위치한 간질성 섬유증은 종종 실패한 인간 심근에 존재합니다. 놀랍게도, 이것은 재배 성공의 부정적인 예측 인자가 아닙니다.
<ol><li>5cm 페트리 접시 뚜껑에 적절한 양의 차가운 슬라이싱 버퍼를 부어 조각이 마르지 않도록하십시오. 차가운 슬라이싱 버퍼가 들어있는 페트리 접시 뚜껑에 조각을 넣으십시오.</li>
	<li>핀셋을 사용하여 조직에서 아가로스를 분리하십시오. 조직에 닿지 않도록하십시오. 조직에 대한 손상이 배양의 성공률을 감소시킬 것이므로 조직을 조심스럽게 다루십시오.</li>
	<li>광원에 대한 면밀한 검사로 심근 섬유의 방향을 결정하십시오. 이는 7.6단계에서 플라스틱 삼각형을 조직에 부착할 때 중요합니다. 참고: 7.4단계와 7.5단계는 5초 이내에 연속해서 빠르게 수행해야 합니다.</li>
	<li>재배 챔버 내부의 조직을 고정시키기 위해 접착제를 사용하여 샘플에 두 개의 플라스틱 삼각형을 부착하십시오.<ol>
<li>멸균 된 페트리 접시 뚜껑에 접착제 1 μL를 놓습니다. 후크 핀셋을 사용하여 오토클레이브 플라스틱 삼각형 중 하나를 집어 들으십시오. 삼각형의 앞 가장자리를 접착제에 빠르게 담그고 삼각형을 심근 세포 정렬에 수직인 샘플에 붙여 넣으십시오. 다른 삼각형에 대해 반복합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>삼각형 너비를 초과하는 조직을 메스로 다듬습니다(그림 2C). 두 개의 장착된 삼각형이 있는 슬라이스를 절단 트레이의 슬라이스 버퍼에 다시 넣습니다. 참고: 재배실을 채우기에 충분한 조각이 준비될 때까지 7.2~7.5단계를 반복합니다. 슬라이스를 수축이 불량한 상태로 교체할 수 있도록 몇 가지 추가 슬라이스를 준비하는 것이 좋습니다.</li>
</ol>8. 슬라이스 장착
참고 : 후하중은 재배 챔버의 스프링 와이어의 강성에 의해 결정됩니다. 스프링 와이어의 두께에 따라 세 가지 유형을 사용할 수 있습니다.
<ol><li>인큐베이터에서 배지가 채워진 재배 챔버를 가져 가라. 준비된 슬라이스 중 하나를 선택하고 각 핀에 삼각형 하나를 연결하여 챔버에 삽입하십시오.</li>
	<li>샘플 크기에 따라 장착 핀 사이의 거리를 조정합니다. 샘플이 중간체에 잠겨 있는지 확인합니다. 챔버를 인큐베이터의 재배 시스템의 지정된 소켓에 다시 넣으십시오. 주의: 조직을 과도하게 펴지 말고 스프링 와이어를 과도하게 구부리지 마십시오!</li>
	<li>접시를 로커에 놓은 후 프리로드 장력을 설정하십시오.<ol>
<li>조정 나사를 시계 반대 방향으로 돌려 프리로드를 줄입니다. 컴퓨터 화면의 해당 그래프의 기준선이 더 이상 변경되지 않을 때까지 이 작업을 수행하십시오.</li>
		<li>조정 나사를 시계 방향으로 돌려 프리로드를 조심스럽게 증가시킵니다 (즉, 장력을 높입니다). 강성이 가장 높은 챔버의 경우, 그래프의 해당 기준선이 1mN의 프리로드에 해당하는 1000-1200 단위만큼 증가할 때까지 계속하십시오. 참고 : 정확한 조정은 재배 챔버의 개별 스프링 상수에 따라 다르며, 이는 제조업체의 지침에 따라 실험 전에 교정을 통해 결정할 수 있습니다. 기록 소프트웨어는 힘이 μN으로 균일하게 표시되도록 개별 챔버 교정을 고려할 수 있도록 합니다. 재배 시작부터 전기 자극을 적용하는 것이 좋습니다. 따라서 슬라이스가 프리로드 조정 중에 수축을 시작할 가능성이 큽니다. 이 경우, 이완기 기준선에 초점을 맞추어 예비하중을 평가한다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>9. 매체 변경
<ol><li>표 3의 제조법에 따라 배양배지를 준비한다. 배지를 사용하기 직전에 50 μL의 β-메르캅토에탄올 (50 mM)을 50 mL 튜브에 첨가한다. 4°C에서 보관한다.</li>
	<li>2 일에 한 번씩 재배 배지를 부분적으로 교환하십시오. 심근 조각의 장기 재배가 필요한 경우 2 일마다 배지를 새로 고칩니다.</li>
	<li>신선한 배지를 30-45분 동안 37°C의 수조 또는 열풍 인큐베이터에서 예열한다. 인큐베이터에서 배양 챔버를 제거하고 층류 후드 아래에 놓습니다. 주의: 저온으로 인한 과수축을 방지하기 위해 챔버뿐만 아니라 매체를 37°C(> 35°C)에서 따뜻하게 유지하는 것이 중요합니다. 덜 뚜렷한 손상은 중간 교환 후 몇 시간 이내에 이완기 긴장의 증가로 존재할 수 있습니다. 이것은 회복되는 것처럼 보일지 모르지만 반복적 인 스트레스는 악화를 축적 할 수 있습니다.</li>
	<li>배양 챔버에서 배지를 제거하고 챔버에 약 0.8 mL를 남겨 둡니다. 1.6 mL의 신선한 배지를 동일한 챔버에 넣으십시오. 배지의 총 부피는 챔버 당 약 2.4 mL이어야합니다.</li>
	<li>챔버의 덮개를 다시 놓고 재배 챔버를 다시 각각의 위치에 놓습니다.</li>
</ol>

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<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> The Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>de Weille, J. R., Schweitz, H., Maes, P., Tartar, A., Lazdunski, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calciseptine%2C+a+peptide+isolated+from+black+mamba+venom%2C+is+a+specific+blocker+of+the+L-type+calcium+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Calciseptine, a peptide isolated from black mamba venom, is a specific blocker of the L-type calcium channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 88 (6), 2437-2440 (1991).</li>
<li>Schleifer, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+molecular+modelling+study+of+the+calcium+channel+blockers+nifedipine+and+black+mamba+toxin+FS2%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Computer-Aided+Molecular+Design%22%5BJournal%5D)">Comparative molecular modelling study of the calcium channel blockers nifedipine and black mamba toxin FS2.</a> Journal of Computer-Aided Molecular Design. 11 (5), 491-501 (1997).</li>
<li>Thomas, G., Chung, M., Cohen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dihydropyridine+%28Bay-K8644%29+that+enhances+calcium+currents+in+guinea+pig+and+calf+myocardial+cells.+A+new+type+of+positive+inotropic+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">A dihydropyridine (Bay-K8644) that enhances calcium currents in guinea pig and calf myocardial cells. A new type of positive inotropic agent.</a> Circulation Research. 56 (1), 87-96 (1985).</li>
<li>Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+slices+come+to+age%3A+an+intermediate+complexity+in+vitro+cardiac+model+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research.</a> Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).</li>
<li>Watson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+viable+adult+ventricular+myocardial+slices+from+large+and+small+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals.</a> Nature Protocols. 12 (12), 2623-2639 (2017).</li>
</ol>

JH, PS, DM 및 KL은 공개 할 것이 없습니다. AD와 TS는 Myodish 재배 시스템을 제공하는 InVitroSys GmbH의 주주입니다.

과거에는 심혈관 연구가 심근 세포 배양에 큰 발전을 이루었습니다. 그러나 손상되지 않은 기하학을 가진 심근 세포의 3D 배양은 아직 잘 확립되지 않았습니다. 심근 조직의 생체 외 배양에 적용된 이전의 프로토콜과 비교하여, 우리가 여기서 기술한 프로토콜은 조직의 생체내 환경과 더 밀접하게 닮았다. 또한, 사전 및 후부하의 적용은 더 많은 생체 모방 환경을 허용합니다. 우리는 조직의 수축 데이터 및 수축 매개 변수의 지속적인 기록을 완전히 분석하고 이해할 수 있습니다.
유사한 셋업을 이용한 생체외 심혈관계 조직 배양 기술의 수는11,21,22개로 제한된다. 발표된 심근 슬라이스 재배를 위한 유사한 기술은 심근 슬라이스(10)의 ...

지난 10년 동안, 심근 세포의 시험관내 배양은 2D 및 3차원(3D) 기술에서부터 심장 심근세포 1,2,3으로 분화된 오가노이드 및 유도만능 줄기 세포의 사용에 이르기까지 큰 발전을 이루었다. Ex vivo 및 일차 세포 배양은 특히 유전 연구 및 약물 개발 4,5,6에 큰 가치를 지닌다. 인간 조직을 사용하면 결과의 번역 값이 향상됩니다. 그러나 손상되지 않은 기하학을 가진 심근 조직의 장기적인 3D 배양은 잘 확립되어 있지 않습니다. 손상되지 않은 기하학은 적절한 심장 기능, 다른 세포 간의 의사 소통 및 세포 - 매트릭스 상호 작용이 전제 조건이기 때문에 생체 내 조건을 모방하는 핵심 기능입니다. 심근 조직 재배는 다양한 발달 단계를 거쳤습니다. 생체외 심근 조직 배양의 성공률과 안정성은 처음에는 상당히 낮았지만, 최근의 접근법은 유망한 결과 7,8,9,10,11을 산출했다.
그 중에서도, Fischer 등은 인간 심근 조직의 생존력 및 수축성 성능이수년 7주 동안 생체외 세포 배양에서 유지될 수 있다는 것을 최초로 입증하였다. 그들의 기술은 외래 된 인간 심근에서 절단 된 얇은 조직 조각을 기반으로했으며, 이는 정의 된 생체 역학 조건과 지속적인 전기 자극을 제공하는 새로 개발 된 재배 챔버에 장착되었습니다. 이 배양 방법은 심근 조직의 생체 내 기능과 매우 유사하며 여러 독립적 인 연구 그룹2,12,13,14,15에 의해 재현되었습니다. 중요하게도, Fischer et al.이 사용하는 챔버는 또한 최대 4 개월 동안 개발 된 힘의 지속적인 등록을 가능하게하여 손상되지 않은 인간 심근에 대한 생리 학적 및 약리학 적 연구를위한 전례없는 기회를 열었습니다7.
유사한 기술이 다른 그룹에 의해 독립적으로 개발되어 인간, 래트, 돼지 및 토끼 심근7,10,11에 적용되었다. Pitoulis et al.은 수축 사이클 동안 정상적인 힘-길이 관계를 재현하는 보다 생리학적인 방법을 개발했지만, 고처리량 분석(16)에는 덜 적합하다. 이와 같이, 생체모방 재배의 일반적인 접근법은 동물 실험의 감소, 정제 및 대체(3R)를 위한 추가의 단계로 간주될 수 있다.
그러나 이러한 잠재력을 활용하려면 표준화된 절차, 높은 콘텐츠 분석 및 높은 처리량 수준이 필요합니다. 우리는 상용화 된 생체 모방 재배 시스템에서 살아있는 인간 심근의 자동화 된 슬라이싱과 시험관 내 유지 보수를 결합한 기술을 제시합니다 ( 재료 표 참조). 제안된 접근법으로, 단일 경막 심근 표본으로부터 생성될 수 있는 개별 슬라이스의 수는 처리 시간에 의해서만 제한된다. 충분한 크기와 품질 (3cm x 3cm)의 표본은 종종 자동화 된 vibratome으로 편리하게 절단되는 20-40 개의 조직 조각을 산출합니다. 이들 슬라이스는 시스템에 속하는 재배 챔버에 배치될 수 있다. 챔버는 전기 자극을 허용하며, 그 파라미터는 변조 될 수 있습니다 (즉, 펄스 지속 시간, 극성, 속도 및 전류), 챔버 내부의 스프링 와이어를 사용하여 사전 및 후부하의 조정. 각 슬라이스의 수축은 스프링 와이어에 부착 된 작은 자석의 움직임으로부터 등록되고 해석 가능한 그래프로 표시됩니다. 데이터는 항상 기록되고 자유롭게 사용 가능한 소프트웨어를 사용하여 분석 할 수 있습니다. 일정한 기준선 페이싱을 제외하고, 스케줄링된 프로토콜은 그들의 내화 기간, 자극 임계치, 포스트-일시정지-강화 및 힘-주파수 관계를 기능적으로 평가하기 위해 수행될 수 있다.
개별 심장에서 여러 심근 절편의 이러한 장기간의 생체 모방 배양은 인간과 동물 조직 모두에서 미래의 생체 외 연구를위한 길을 열어주고 심혈관 의학에서 치료 및 심장 독성 약물 효과에 대한 스크리닝을 용이하게합니다. 이미 다양한 실험적 접근법 2,12,13,15에 적용되었다. 여기에서는 인간 조직 준비에 대한 자세한 단계별 설명을 제공하고 자주 발생하는 재배 문제에 대한 솔루션을 제공합니다.

<table><tbody><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose 저융점</td><td>Roth</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Bay-K8644</td><td>Cayman Chemical</td><td>19988</td><td></td></tr><tr><td>BDM(2,3-Butanedione monoxime)</td><td>Sigma</td><td>B0753-1kg</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*H2O</td><td>Merck</td><td>2382.1</td><td></td></tr><tr><td>Calciseptine</td><td>Alomone Labs</td><td>SPC-500</td><td></td></tr><tr><td>포도당 * H2O</td><td>AppliChem</td><td>A3730.0500</td><td></td></tr><tr><td>H2O</td><td>BBraun</td><td>3703452</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>AppliChem</td><td>A1069.0500</td><td></td></tr><tr><td>Histoacryl</td><td>BBraun</td><td>1050052</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올 100 %</td> <td>SAV LP GmbH</td><td>UN1219</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X- 보충제</td><td>Gibco</td><td>5150056</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1.04933.0500</td><td></td></tr><tr><td>중간 199</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2*6H2O</td><td>AppliChem</td><td>A1036.0500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4*H2O</td><td>Merck</td><td>1.06346.0500</td><td></td></tr><tr><td>니페디핀</td><td>시그마</td><td>N7634-1G</td><td></td></tr><tr><td>페니실린 / 스트렙토마이신 x100</td><td>Sigma</td><td>P0781-100ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoethanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108.0100</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow cabinet</td><td>Thermo Scientific</td><td>KS15</td><td></td></tr><tr><td>Frigomix 워터펌프 및 냉각 + BBraun Thermomix BM</td><td>BBraun</td><td></td><td>자체 제작 냉각 및 가열 솔루션의 조합.</td></tr><tr><td>인큐베이터</td><td>바인더</td><td>CB240</td><td></td></tr><tr><td>MyoDish 배양 시스템</td><td>InVitroSys GmbH</td><td>MyoDish 1</td><td>Myodish 컬트 시스템</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1200s</td><td></td></tr><tr><td>수조 37도</td><td>Haake</td><td>SWB25</td><td></td></tr><tr><td>수조 80도</td><td>Daglef Patz KG</td><td>7070</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100mL 플라스틱 일회용 비커</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>여과 장치, Steritop 퀵 릴리스</td><td>Millipore</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>바늘 0.9 x 70mm 20G</td><td>BBraun</td><td>4665791</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 삼각형</td><td></td><td></td><td>자체 제작</td></tr><tr><td>Razor Derby 프리미엄</td><td>Derby Tokai</td><td>B072HJCFK6</td><td></td></tr><tr><td>면도기 질레트 실버 블루</td><td>질레트</td><td>7393560010170</td><td></td></tr><tr><td>메스 일회용</td><td>깃털</td><td>02.001.30.020</td><td></td></tr><tr><td>주사기 10mL 루어 팁 BD Discardit</td><td>BBraun</td><td>309110</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 10cm</td><td>팔콘</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 3.5cm</td><td>팔콘</td><td>353001</td><td></td></tr>관 <tr><td>50mL</td><td>팔콘</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

장기 재배를 위한 인간 심근 조직의 제조

Preparation of Human Myocardial Tissue for Long-Term Cultivation

심근세포 배양은 2차원(2D) 세포 배양에서 iPSC 유래 오가노이드에 이르기까지 방대한 수의 발전을 이뤘다. 2019 년에는 심근 수축의 생체 내 상태에 접근하면서 인간 심장 샘플에서 얻은 심근 절편을 배양하는 생체 외 방법이 입증되었습니다. 이 샘플은 주로 심장 이식 또는 좌심실 보조 장치 배치에서 비롯됩니다. 비브라톰과 특별히 개발된 재배 시스템을 사용하여 300μm 두께의 슬라이스를 고정된 와이어와 스프링 와이어 사이에 배치하여 몇 주 동안 안정적이고 재현 가능한 재배가 가능합니다. 재배하는 동안 조각은 개별 설정에 따라 지속적으로 자극됩니다. 수축은 실시간으로 표시되고 기록 될 수 있으며 약리학 적 제제를 쉽게 적용 할 수 있습니다. 사용자-정의된 자극 프로토콜은 일시정지-강화, 자극 임계값, 힘-주파수 관계, 내화 기간과 같은 중요한 수축 파라미터를 평가하기 위해 스케줄링되고 수행될 수 있다. 더욱이, 상기 시스템은 보다 생리학적 재배를 위한 가변 사전-후 하중 설정을 가능하게 한다.
여기에서, 우리는 상업적 생체 모방 재배 용액을 사용하여 인간 좌심실 심근 절편의 성공적인 장기 배양을 생성하는 방법에 대한 단계별 가이드를 제시합니다.

심근 조각의 수축은 재배 챔버를 해당 커넥터에 삽입 한 후 컴퓨터 화면에 표시되었습니다 (그림 3). 인간 심근 조각의 수축은 자극 즉시 시작되었습니다. 조각은 5-10 분 동안 과도하게 수축되었습니다. 이것은 손상된 조직 분획의 강장제 수축으로 인한 이완기 힘의 증가로 나타났습니다. 이 과정은 1-1.5 h 내에서 다양한 정도로 되돌렸다. 안정화 후, 인간 LV 조직 절편은 자극시 1 mN과 3 mN 사이에서 변하는 트위치 힘을 나타내었다. 수축력의 강한 증가로 수축력이 증가한 것으로 나타나며, 수축력의 똑같이 가파른 감소와 함께 디아스톨이 뒤 따른다.
심근 조각의 수축은 재배 소프트웨어에 의해 기록되고 지정된 파일에 저장되었습니다. 생성된 각 원시 데이터 파일은 데이터를 쉽게 분석하고 정량화할 수 있도록 읽을 수 있는 Axon 바이너리 파일 형식(.abf)으로 변환되었습니다. 초기 분석을 위해 .abf 파일이 적절한 프로그...

우리는 인간 심실 심근 조직의 생체 외 배양을 위한 프로토콜을 제시한다. 수축력 및 동역학에 대한 상세한 분석뿐만 아니라 생체 내 생리 환경을보다 면밀히 모방하기 위해 사전 및 후부하의 적용을 허용합니다.

Cardiomyocyte cultivation has seen a vast number of developments, ranging from two-dimensional (2D) cell cultivation to iPSC derived organoids. In 2019, ...

이 프로토콜을 사용하여, 인간 좌심실 조직 절편은 생체모방 챔버에서 생체외 배양될 수 있다. 사전 및 후부하의 적용은 생리 환경의 유사성을 향상시킵니다. 이 기술은 조직 수축의 지속적인 등록을 허용합니다.사용자 정의 자극 프로토콜은 일시정지 후 강화, 자극 임계값, 힘-주파수 관계, 내화 기간과 같은 중요한 수축 파라미터의 평가를 허용한다. 이 설정을 사용하여 심근 조각의 장기간 재배는 심혈관 의학에서 치료 및 심장 독성 약물 효과에 대한이 스크리닝을 용이하게하여 향후 생체 외 연구를위한 길을 열어 줄 것입니다. 시작하려면 배양 챔버와 흑연 전극을 10 % 이소프로판올 용액 1 리터에 담그고 밤새 교반하십시오.다음날 챔버를 100 % 이소프로판올 용액으로 3 분 동안 옮긴 다음 챔버 및 흑연 전극을 층류 후드 하에서 공기 건조시킵니다. 로커의 사용 가능한 위치에 따라 회로 기판을 각 챔버에 부착하십시오. 제조업체의 지침에 따라 회로 기판에 두 개의 흑연 전극을 놓은 다음 감염을 예방하기 위해 챔버에 35mm 페트리 접시 뚜껑을 놓습니다.그런 다음 절단 트레이를 슬라이싱 버퍼로 최대 90 ~ 95 %까지 채 웁니다. 조직 샘플을 차가운 슬라이싱 버퍼로 채워진 100 밀리미터 페트리 접시에 옮기고 접시를 섭씨 4도의 냉각 플레이트에 놓습니다. 핀셋으로 심내막을 잡고 심내막 섬유주를 제거한 다음 가위를 사용하여 약 3mm의 심내막 조직을 잘라냅니다.절단된 조직 샘플, 심내막 측면을 정사각형 위치에 고정된 네 개의 0.9x70밀리미터 20게이지 바늘을 사용하여 2x2센티미터 고무 패치까지 고정시킨다. 각 바늘 팁의 대각선 가장자리가 안쪽을 향하고 있는지 확인하여 고정력을 강화하고 심근 손상을 방지하십시오. 메스를 사용하여 네 개의 바늘 사각형 외부의 모든 과도한 조직을 잘라냅니다.핀셋을 사용하여 트리밍된 샘플을 멸균된 조직 조각에 10초 동안 올려 놓고 과도한 슬라이싱 버퍼를 제거합니다. 다음으로, 수조에서 아가로스 주사기를 제거하고 샘플을 아가로스에 침수시킨다. 아가로스를 냉각판에서 다섯 분 동안 응고시키십시오.샘플의 심내막 측면은 아가로스에서 볼 수 있어야합니다. 핀셋을 사용하여 아가로스에 포함 된 샘플의 심외경면을 접착 된 부위 위에 놓은 다음 아가로스를 자르거나 손상시키지 않고 무딘 도구로 상단에서 아가로스 함유 샘플을 부드럽게 누릅니다. 접착제가 1 분 동안 굳어지게하십시오.진동 진폭을 1mm로, 초기 절삭

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

성인 심장 myocytes 동물 마음으로부터 격리하고 며칠 동안 교양 수있는 기본 세포입니다. 이 문화가 기간 내에 adenoviral 유전자 전송은 유전자 인코딩 bi​​osensors (GEBs) 또는 형광 융합 단백질을 표현하는 데 사용할 수 있습니다. 두 접근 방법 공촛점 현미경에 의해 세포 조사를 허용합니다.

공촛점 이미징에 대한 분리 및 성인 심장 Myocytes의 유전자 조작

우리는 성인 마우스 심근의 분리를 위해 신뢰할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 심근의 문화에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다.

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

이 원고는 표면 마커 발현과 세포 분류를 사용하여 정의된 공학적 심장 조직의 생성을 설명합니다. 그런 다음 정의된 조직을 다중 조직 생물반응기에서 사용하여 심장 세포 치료의 메커니즘을 조사하여 기능적이면서도 제어된 인간 심장 모델 시스템을 제공할 수 있습니다.

정의 인간 공학 심장 조직의 건설 심장 세포 치료의 메커니즘을 연구하는

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

이 프로토콜의 세포 외 기질 구성 요소를 유지 하면서 인간의 심근의 완전 한 decellularization에 설명 합니다. 더 미와 cytoprotective 자가 조립 하이드로 겔의 생산에서 기질 결과의 처리.

기질 자체 히드로 생체 외에서 그리고 Vivo에서 응용 프로그램에 대 한 조립으로 인간의 심장 조직 처리

이 프로토콜은 6 일 동안 생리적 조건 하에서 심장 조직을 슬라이스하고 배양하는 방법을 설명합니다. 이 배양 시스템은 3D 심장 모델에서 급성 심장 중독의 신뢰할 수있는 테스트뿐만 아니라 새로운 심부전 치료제의 효능을 테스트하기위한 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

생리적 조건하에서 돼지 하트 를 자르고 배양

제시는 진동기 절단 심근 조각에서 인간과 동물 심실 심근 세포의 격리를위한 프로토콜이다. 칼슘 내성 세포의 높은 수율 (최대 200 세포/mg) 조직의 소량에서 얻을 수 있습니다 (&amp;50 mg). 프로토콜은 감기 허혈에 노출된 심근에 최대 36시간 동안 적용됩니다.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

단일 성인 마우스 심장의 심실과 심실 모두에서 심근세포 및 비근구의 동시 절연을 위한 방법이 설명된다. 이 프로토콜은 매우 실행 가능한 심장 심근세포 및 비 근구세포의 일관된 수율을 초래하고 페노티핑 및 체외 분석을 위한 최적의 세포 별 배양 조건을 자세히 설명합니다.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

심근 보호에 저체온증의 다른 정도의 뚜렷한 영향은 철저하게 평가되지 않았습니다. 본 연구의 목표는 인간 심근세포 기반 모델에서 다른 저체온증 치료에 따른 세포 사멸 의 수준을 정량화하여 미래의 심층 분자 연구의 토대를 마련하는 것이었습니다.

인간 심장 근세포 모델에서 저체온증-사전 조절 에 따른 심근 보호의 체외 평가

여기에서 우리는 심근 경색 후(MI) 마우스 심장에서 높은 생존력을 가진 충분한 양의 단일 비심근 세포를 분리하는 프로토콜을 설명합니다. 이는 후속 단일 세포 시퀀싱, 유세포 분석 및 일차 세포 배양에 사용할 수 있습니다.

심근경색 후 성인 마우스 심장에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 비심근세포 세포 현탁액의 제조

줄기 세포 유래 심근 세포를 사용하여 생체 공학적으로 설계된 3차원 심장 조직은 건강한 심근과 병든 인간 심근 을 체외 에서 연구하는 동시에 천연 심장 틈새 시장의 주요 측면을 요약하기 위한 유망한 모델로 부상했습니다. 이 원고는 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근세포에서 생성된 high-content engineered 심장 조직을 제작하고 분석하기 위한 프로토콜을 설명합니다.

공학적 심장 조직의 데이터 수집 및 모델 처리량을 개선하기 위한 바이오리액터 설계

학습하세요 생체 모방 챔버를 이용한 인간 좌심실 심근 조직의 장기 배양 방법을. 전하 및 후하를 적용하여 생리학적 환경을 재현하고 수축력과 운동학을 분석하는 이 기술은 심혈관 약물 효과 선별에 활용됩니다.

장기 재배를 위한 인간 심근 조직의 제조

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