Name: Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: 학습하세요 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자 유전자 스크리닝 방법을. ell1 결실 돌연변이에서 유전적 억제자를 식별하고 생물학적 경로를 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

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이 연구는 인도 정부 생명공학부의 연구 보조금(보조금 번호. BT / PR12568 / BRB / 10 / 1369 / 2015)를 Nimisha Sharma로. 저자는 S. pombe cDNA 라이브러리를 선물한 Charles Hoffman 교수(미국 보스턴 칼리지)와 효모 플라스미드에 대해 Susan Forsburg 교수에게 감사를 표합니다.

1. cDNA 라이브러리를 질의 S. pombe 돌연변이 균주로 형질전환하여 멀티카피 억제인자를 스크리닝하는 방법
참고: 표준 리튬-아세테이트 방법27을 따라 S. pombe cDNA 라이브러리를 몇 가지 수정을 통해 질의 S. pombe ell1Δ 균주로 변환했습니다.
<ol><li>S. pombe ell1 Δ균주를 아데닌, 류신 및 우라실의 각각 225μg/mL가 보충된 YE 배지(표 1) 플레이트에서 32°C에서 성장시킨다. 위의 플레이트에서 ell1Δ 균주의 접종물로 가득 찬 루프를 아데닌, 류신 및 우라실이 각각 225μg/mL가 보충된 15-20mL의 YE 배지에 접종합니다. 이를 진탕(200-250 rpm)하면서 32°C에서 밤새 배양한다.</li>
	<li>다음날, 원하는 보충제와 함께 100mL의 새로운 YE 배지에서 밤새 배양물을 0.3의 OD 600nm(600nm에서의 광학 밀도)로 희석하고, OD600nm가 중간 로그 상에 도달할 때까지 200-250rpm에서 진탕하면서 32°C에서 배양한다.</li>
	<li>100mL 배양액을 2개의 50mL 원심분리 튜브로 나눈 다음 실온에서 4,000× g에서 10분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 버리고 세포 펠릿을 1mL의 멸균수로 세척하고, 즉, 세포를 1mL의 멸균수에 재현탁시키고, 실온에서 5분 동안 4,000× g 에서 원심분리한다.</li>
	<li>상청액을 버리고 단계 1.4에 기재된 바와 같이 각 세포 펠릿을 1mL의 1x LiAc-TE(100mM 리튬 아세테이트, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5) 용액으로 세척한다.</li>
	<li>상청액을 제거하고 각 세포 펠렛을 250μL의 1x LiAc-TE에 재현탁시킨다. 관심 DNA로 형질전환하기 위해 이러한 S. pombe 적격 세포(500μL)를 사용하십시오. 후속 변형 단계를 위해 125μL의 적격 세포를 4개의 서로 다른 멸균 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>연어 고환이나 청어 정자의 운반체 DNA를 1 분 동안 끓여서 즉시 얼음 위에 놓습니다. 각 형질전환에 대해 10μL의 10mg/mL 변성 단일 가닥 담체 DNA를 125μL의 적격 세포가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 추가한 다음 마이크로피펫 팁을 사용하여 부드럽게 혼합합니다. 이어서, 50 μg의 S. pombe cDNA 라이브러리를 유능한 세포-담체 DNA 혼합물-함유 미세원심분리 튜브에 첨가한다.</li>
	<li>마이크로 원심 분리 튜브를 실온에서 10 분 동안 배양 한 다음 260μL의 폴리에틸렌 글리콜-리튬 아세테이트 용액 (40 % [w / v] PEG 4,000, 100mM 리튬 아세테이트, 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5)을 튜브에 넣고 마이크로 피펫 팁을 사용하여 부드럽게 혼합합니다.</li>
	<li>변형 혼합물이 포함된 미세원심분리 튜브를 흔들지 않고 32°C에서 2시간 동안 인큐베이션합니다. 예열된 디메틸설폭사이드(DMSO) 43μL를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 부드럽게 혼합합니다. 그 후, 튜브를 42°C에서 5분 동안 열 충격에 노출시킵니다.</li>
	<li>실온에서 5분 동안 4,000× g 의 세포를 펠릿화합니다. 상청액을 버리고 마이크로피펫 팁을 사용하여 잔류 PEG-LiAc-TE 용액을 제거합니다.</li>
	<li>세포를 100μL의 멸균수에 재현탁하고 필요한 보충제와 0.2μg/mL의 4-NQO를 사용하여 하나의 EMM2(표 1) 플레이트(150mm)에 플레이트합니다.</li>
	<li>플레이트를 32°C에서 5-6일 동안 배양하여 플레이트에 콜로니가 나타나도록 합니다. 0.2 μg/mL의 4-NQO가 있는 상태에서 동일한 배지 플레이트에 획득한 콜로니를 줄무늬로 만들고 추가 스크리닝에 사용합니다.</li>
	<li>하나의 라이브러리 형질전환 실험의 경우, 상기 단계 1.8 내지 1.14에 설명된 바와 같이 형질전환에 500μL의 적격 세포(125μL의 적격 세포 x 4개의 마이크로원심분리 튜브)를 사용한다.</li>
	<li>대조군으로서, 하나의 EMM2 플레이트(150mm)에 형질전환 혼합물의 1/10을 플레이트하고, 필요한 보충제를 포함하되 4-NQO가 결여된 상태에서, 라이브러리의 형질전환 후 수득된 라이브러리 클론의 총 수를 계산하고, 억제자클론의 단 리를 스크리닝한다.</li>
</ol>2. 추정 억제기에 의한 질의 돌연변이 균주와 관련된 표현형의 구조/억제를 테스트하고 검증합니다.
참고: 스트레스 스팟 분석은 추정 억제기에 의한 ell1 결실 관련 4-NQO 응력 민감도의 구조/억제를 테스트하고 검증하기 위해 아래에 설명된 대로 수행되었습니다.
<ol><li>멸균 96웰 마이크로타이터 플레이트의 서로 다른 웰 각각에 100-200μL의 멸균수를 추가합니다.</li>
	<li>멸균 이쑤시개 또는 20-200 μL 마이크로피펫 팁을 사용하여 4-NQO를 함유하는 플레이트 상에서 cDNA 라이브러리 형질전환 후 수득된 각각의 상이한 콜로니로부터 소량의 접종물을 선택한다. 각각의 다른 콜로니로부터의 접종물을 100-200 μL의 멸균수를 함유하는 마이크로타이터 플레이트의 분리된 독립적인 웰에 첨가한다. 철저히 섞는다.</li>
	<li>각 웰에서 세포 현탁액 3μL를 아데닌(225μg/mL) 및 우라실(225μg/mL)을 포함하지만 류신(이 작업에 사용된 라이브러리 구성에 사용되는 플라스미드 벡터에 존재하는 선택 가능한 영양 요구성 마커)이 부족한 EMM2 한천 플레이트에 스팟합니다. 필요에 따라 플레이트에 적절한 농도의 4-NQO를 추가합니다.</li>
	<li>플레이트를 32°C에서 3-4일 동안 배양하여 세포가 성장할 수 있도록 합니다. 추정 억제 인자로서 다양한 농도의 4-NQO가있는 상태에서 성장을 보이는 콜로니를 식별하십시오.</li>
	<li>억제인자를 추가로 검증하려면 선택된 억제 균주와 함께 적절한 대조 균주를 32°C에서 밤새 진탕(200-250rpm)하여 각각 225μg/mL의 아데닌과 우라실을 포함하지만 류신이 부족한 EMM2 배지에서 성장시킵니다.</li>
	<li>다음날, 세포를 신선한 EMM2 배지에서 0.3의 OD 600 nm로 희석하고, 중간 로그 단계(0.6-0.8의 대략 OD600 nm)까지 진탕하면서 32°C에서 성장시킨다.</li>
	<li>0.4μM 4-NQO 또는 0.01% MMS를 함유한 필수 보충제를 사용하여 EMM2 플레이트에서 배양물의 적절한 연속 희석액(1:10 또는 1:5)을 찾아냅니다. 통제를 위해 EMM2 플레이트에서 필요한 보충제가 있지만 DNA 손상 물질이 없는 균주를 발견하십시오.</li>
	<li>플레이트를 32°C에서 3-5일 동안 배양하여 성장을 모니터링합니다. 참고: 질의 돌연변이 균주와 관련된 표현형에 기초한 적합한 분석은 표현형의 구조 또는 억제를 시험하기 위해 사용되어야 한다. 예를 들어, 질의 돌연변이 균주의 감기에 민감한 표현형의 억제자가 확인될 필요가 있는 경우, 억제자 클론의 시험 및 검증을 위한 분석은 저온에서 형질전환체를 성장시키는 것을 포함할 것이다.</li>
	<li>관심 유전자(이 경우 Spell1 ) 또는 빈 벡터로 형질전환된 돌연변이 균주를 라이브러리 형질전환체와 함께 각각 양성 및 음성 대조군으로 스팟합니다.</li>
</ol>3. S. pombe 서프레서 클론으로부터 플라스미드의 분리
참고: S. pombe 로부터의 플라스미드 분리는 핵분열 효모: 실험실 매뉴얼28 에 설명된 프로토콜에 따라 수행되었으며 몇 가지 수정이 있었습니다.
<ol><li>225μg/mL의 아데닌과 우라실을 포함하는 EMM2 배지에 단일 효모 콜로니를 접종하고 200-250rpm에서 흔들면서 32°C에서 밤새 세포를 성장시킵니다. 다음날, 실온에서 4,000 × g 에서 2분 동안 원심분리하여 5개의 O.D. 세포(즉, O.D. 0.5의 10mL 배양물)를 수확한다.</li>
	<li>상청액을 제거하고, 세포 펠렛을 0.2 mL의 용해 완충액 (2% 트리톤 X-100, 1% SDS, 100 mM NaCl, 10 mM 트리스 HCl (pH 8.0), 및 1 mMNa2EDTA)에 재현탁시킨다.</li>
	<li>0.2mL의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1)과 0.3g의 산 세척 유리 비드를 미세 원심분리 튜브에 추가합니다. 마이크로 원심 분리 튜브를 4 ° C에서 2 분 동안 와동시키고 얼음 위에서 1 분 동안 배양합니다. 이 단계를 6x 반복합니다.</li>
	<li>튜브를 10,000×g에서 실온에서 15 분 동안 원 심분리합니다. 상부 수성 층을 새로운 미세 원심분리 튜브로 옮기고 200μL의 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올(25:24:1)을 추가합니다.</li>
	<li>튜브를 10,000×g에서 10 분 동안 원 심분리합니다. 상부 수성 층을 새로운 튜브로 옮기고 2 부피의 100 % 에탄올 (~ 400 μL)과 1/10 부피의 아세트산 나트륨 (3 M, pH 5.8) (~ 20 μL)을 튜브에 추가합니다. 마이크로 원심분리 튜브를 -70°C에서 1시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>4°C에서 15 분 동안 10,000×g에서 원심분리하여 DNA를 침전시키고 상층액을 제거한다. DNA 펠릿을 70% 에탄올(~500μL)로 세척하고 실온에서 공기 건조시킵니다.</li>
	<li>20 μL의 멸균수에 DNA를 재현탁시킨다. 유능한 대장균 세포의 형질전환을 위해 2-5μL의 플라스미드 DNA를 사용하십시오. 참고: 플라스미드는 또한 상업적으로 입수가능한 임의의 효모 플라스미드 분리 키트를 사용하여 효모 세포로부터 분리될 수 있다.</li>
</ol>4. 서프레서 클론에 의해 코딩되는 유전자의 동정
<ol><li>분리된 효모 플라스미드를 표준 프로토콜29를 사용하여 대장균 Top10 균주[F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG]로 형질전환시키고 필요한 항생제가 있는 LB(루리아 브로스) 플레이트에 세포를 퍼뜨립니다.</li>
	<li>표준 알칼리 용해 프로토콜29를 사용하여 대장균 형질전환체로부터 플라스미드를 분리하고, 제한 효소의 적절한 조합을 따라 제한 분해에 의한 삽입된 DNA 단편의 방출을 확인합니다. 참고: 억제기 플라스미드 84는 Bam HI 제한 효소로 소화되었고, 억제기 플라스미드 104는 PstI/BamHI 제한 효소로 소화되었습니다.</li>
	<li>ell1Δ균주에서 제한 소화 후 삽입 방출을 나타내는 플라스미드를 재변환하여 ell1Δ 균주의 유전독성 스트레스 민감성 표현형을 구출하는 능력을 확인하였다.</li>
	<li>유전독성 스트레스 민감도의 억제를 나타내는 플라스미드 클론을 선택하고, 벡터 특이적 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 이들 플라스미드 클론에 존재하는 삽입된 DNA 단편을 서열분석한다. 참고: 본 연구에서, adh1 프로모터 특이적 유니버셜 포워드 프라이머 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3')를30 번 사용하였다.</li>
	<li>억제를 담당하는 유전자를 확인하기 위해, NCBI 뉴클레오티드 블라스트 (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) 또는 Pombase 서열 정렬 도구 (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core)를 사용하여 수득한 서열을 정렬한다. 최대 정렬을 나타내는 서열을 선택하고 다중 복제 억제 플라스미드에 대한 유전자로 식별합니다.</li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충이 없습니다.

효모는 진핵 생물에 걸쳐 진화 적으로 보존되는 기본적인 생물학적 과정과 경로를 조사하는 데 널리 사용되었습니다. 다양한 생화학적, 유전적 및 분자적 절차에 대한 순응성과 함께 유전 및 게놈 도구의 가용성은 효모를 유전 연구를 위한 훌륭한 모델 유기체로 만듭니다34,35,36. 수년에 걸쳐, 효모 연구자들은 개별 유전자의 기능뿐만 아니라 이들이 관여 할 수있는 경로 및 생물학적 과정을 밝힐 수있는 유전 적 상호 작용을 식별하기 위해 다양한 유전자 스크리닝을 설계했습니다10,11,17,37. 유전적 상호작용을 식별하는 일반적이고 유용한 스크...

유전적 상호작용의 네트워크는 유전자에 대한 기능적 정보를 제공하고 이러한 유전자가 생체 내에서 관여할 수 있는 경로와 생물학적 과정을 설명합니다. 또한 서로 다른 유전자가 서로 상호 작용하는 방식에 대한 통찰력을 제공하여 특정 표현형 1,2,3을 생성 할 수도 있습니다. 수년에 걸쳐 연구자들은 근본적인 생물학적 질문에 답하고 인간의 질병을 연구하기 위해 다양한 유전자 검사를 설계했습니다. 유전적 상호작용의 확인을 위한 스크리닝은 여러 가지 방법으로 수행될 수 있다. 서로 다른 유전자 스크리닝에서 확인된 유전적 상호작용은 유전자 간의 뚜렷한 기계론적 관계를 나타낼 수 있다. 또한 연구에 따르면 공통된 유전 적 상호 작용 세트는 동일한 경로 또는 복합체 4,5에 속하는 단백질을 암호화하는 유전자에 의해 공유됩니다. 따라서, 유전적 상호작용 네트워크는 세포에서 기능적 조직을 확립하는데 사용될 수 있으며, 여기서 가장 유사한 프로파일을 공유하는 유전자는 동일한 복합체 또는 경로에 속하고, 다소 덜 유사한 프로파일을 공유하는 유전자는 동일한 생물학적 과정에 속하며, 중복되지만 더 다양한 프로파일을 나타내는 유전자는 동일한 세포 구획에 속하는 구성원을 반영한다(6).
용량 억제('고복제 또는 다중 복제 억제')에 기반한 유전적 상호 작용 스크리닝은 일반적으로 사용되는 접근 방식 중 하나입니다. 이러한 스크리닝은 질의 돌연변이 균주를 높은 복제 수 게놈 또는 cDNA 라이브러리로 형질전환한 다음, 유전적 상호작용을 억제하거나 향상시키는 것을 식별하기 위한 적절한 분석/선택 기술을 수행함으로써 수행될 수 있다7,8,9. 포괄적인 게놈 전체 커버리지를 보장하기 위해, 이러한 스크리닝은 또한 게놈 전체 기능 상실 돌연변이체 모음에서 관심 있는 특정 유전자를 과발현하거나 기능 손실 쿼리 돌연변이체에서 높은 카피 수의 플라스미드로 인코딩된 게놈 또는 cDNA 라이브러리를 과발현함으로써 수행되었습니다. 9,10,11,12,13,14,15 . 다중 복제 전략은 조절 가능한 프로모터를 사용하는 우성/과발현 접근 방식을 사용하여 작동할 수도 있습니다.
억제기 기반 스크린을 사용하는 주요 이점은 다른 유전자에 의한 돌연변이 균주에서 기존 표현형의 억제가 다른 접근법을 사용하여 입증되지 않았을 수 있는 이 두 유전자 산물 간의 유전적 관계를 설정한다는 것입니다. 둘째, 기존 돌연변이의 존재는 특정 경로를 민감하게 하여 보다 직접적인 유전적 선택에 의해 확인되지 않았을 수 있는 억제인자의 분리에 의해 해당 경로의 추가 구성 요소를 식별할 수 있도록 하는 것으로 관찰되었습니다. 더욱이, 이 스크린은 상이한 억제 메커니즘(16)을 갖는 억제인자를 식별하는데 사용될 수 있다. 억제 자 상호 작용은 일반적으로 기능적으로 관련되고 경로의 계층 구조를 설명하는 데 사용할 수있는 유전자 사이에서 발생합니다. 억제의 정확한 기본 메커니즘은 스크린에 사용된 질의 돌연변이의 유형, 실험 조건 및 유전자 발현 수준을 포함한 여러 요인에 따라 다를 수 있습니다. 일반적인 투여 억제 메커니즘 중 하나는 동일한 복합체에서 또는 동일한 세포 / 생물학적 과정에서 병렬로 기능하는 제품을 암호화하는 유전자를 포함합니다. 효모와 같은 더 단순한 모델 유기체에서 이러한 스크리닝의 결과는 대부분의 기본적인 생물학적 경로와 과정이 진화를 통해 보존되기 때문에 고등 진핵 생물로 확장 될 수 있습니다.
이러한 유전자 스크리닝은 다양한 생물학적 질문에 답하기 위해 여러 가지 방법으로 수정할 수도 있습니다. 예를 들어, 질의 돌연변이 균주의 표현형을 억제할 수 있는 상이한 유기체로부터의 동종 유전자가 확인될 수 있다. 또한 잠재적인 내성 메커니즘을 설명하고 새로운 항균17,18, 항진균제19,20, 구충제 21 및 항암 22 화합물의 단백질 표적을 결정하는 데 사용되었습니다. 이 스크린은 또한 작용 메커니즘이 알려지지 않은 의약품의 활성 억제 인자를 식별하기 위해 악용되었습니다. 따라서, 원칙적으로, 이들 멀티카피 서프레서 스크린은 상이한 유기체에서의 다양한 어플리케이션에서 최적화되고 사용될 수 있다. 효모 연구자들에 의해 사용되는 대부분의 유전자 스크리닝은 초기에 S. cerevisiae에서 개발되었지만, S. pombe는 다양한 유전자 스크리닝 및 분석을 수행하기 위한 보완적인 모델 시스템으로 등장했다(23). 더욱이, 더 많은 유전자에서 인트론의 발생, DNA 복제 기원의 복잡성, 중심체 구조, 세포주기의 조직 및 RNAi 기계의 존재와 같은 S. pombe의 게놈 조직 및 생물학적 과정은 S. pombe와 고등 진핵 생물23,24 사이의 더 큰 유사성을 보여 주며, S. pombe에서 유전 도구를 설계하고 사용하는 것의 중요성을 강조합니다. 
이 논문은 S. pombe에서 기능 상실 돌연변이 표현형의 '용량 억제'를 기반으로 유전 적 상호 작용을 식별하는 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 기본은 멀티카피 플라스미드 및/또는 강력한 프로모터로부터 야생형 유전자를 과발현하는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것이 빠르고 효율적인 방법이라는 것입니다. 이 프로토콜에는 4가지 주요 단계가 있습니다: 라이브러리를 쿼리 돌연변이 균주로 형질전환, 쿼리 돌연변이 균주의 원하는 표현형을 억제하는 플라스미드 클론 선택, 이러한 억제 클론에서 플라스미드 검색, 표현형 억제를 담당하는 유전자 식별. 라이브러리로부터 cDNA의 선택 및 식별에 기초한 임의의 방법에 대해 사실인 것처럼, 스크린의 성공은 스크린이 라이브러리에 존재하는 이들 cDNA 클론만을 검색할 수 있기 때문에 고품질 및 고복잡성 라이브러리를 사용하는 것에 의존한다.
이 프로토콜을 사용하여, 우리는 질의 S. pombe ell1 널 돌연변이체의 유전독성 스트레스 민감성 표현형의 2개의 신규한 억제인자를 성공적으로 확인하였다. 전사 신장 인자의 ELL (11 Nineteen Lysine Rich Leukemia) 계열은 시험관 내 생화학 분석에서 DNA 주형에서 RNA 중합 효소 II의 일시적인 일시 중지를 억제하고 핵분열 효모에서 인간25에 이르기까지 다양한 유기체에 걸쳐 보존됩니다. 이전 연구는 S. pombe ell1 null 돌연변이가 4- 니트로 퀴놀린 1- 옥사이드 (4-NQO) 및 메틸 메탄 설포 네이트 (MMS) 26의 존재하에 유전 독성 스트레스 민감도를 나타낸다는 증거를 제공했습니다. 따라서, S. pombe 플라스미드로 암호화된 멀티카피 cDNA 라이브러리를 질의 S. pombe ell1 null 돌연변이체로 변환하고, DNA 병변을 유도하는 화합물인 4-NQO의 존재 하에서 S. pombe ell1 null 돌연변이체의 유전독성 스트레스 민감도를 억제하는 능력을 나타내는 2개의 추정 클론을 확인하였다. 플라스미드 클론에 존재하는 삽입물의 후속 시퀀싱은 rax2+ 및 osh6+를 코딩하는 유전자가 ell1 null 돌연변이체에서 과발현될 때 ell1 null 돌연변이체의 유전 독성 스트레스 민감도를 억제하는 역할을 한다는 것을 확인했습니다.

<table><tbody><tr><td>4-NQO</td><td>시그마</td><td>N8141</td><td></td></tr><tr><td>아세트산, 빙하</td><td>시그마</td><td>1371301000</td><td></td></tr><tr><td>아데닌 황산염</td><td>Himedia</td><td>GRM033</td><td></td></tr><tr><td>한천</td><td>Himedia</td><td>GRM026</td><td></td></tr><tr><td>아가로 로즈</td><td>Lonza</td><td>50004L</td><td></td></tr><tr><td>염화 암모늄</td><td>Himedia</td><td>MB054</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Fermentas</td><td>ER0051</td><td></td></tr><tr><td>비오틴</td><td>Himedia</td><td>RM095</td><td></td></tr><tr><td>붕산</td><td>Himedia</td><td>MB007</td><td></td></tr><tr><td>염화칼슘&nbsp;</td><td>시그마</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름 : 이소 아밀 알코올 24 : 1</td><td>시그마</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>구연산</td><td>Himedia</td><td>RM1023</td><td></td></tr> 연<tr><td>어 고환의 단일 가닥 DNA</td><td></td> 인 인산 나트륨 무수 히메디아 GRM3960 <td></td> 시그마 D7656 <td></td></tr><tr><td>EDTA 시</td><td>그마</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>염화제이철 육수화물</td><td>Himedia</td><td>RM6353</td><td></td></tr><tr><td>포도당</td><td>Amresco</td><td>188</td><td></td></tr><tr><td>이오노시톨</td><td>Himedia</td><td>GRM102</td><td></td></tr><tr><td>이소프로판올</td><td>퀄리겐</td><td>Q26897</td><td></td></tr><tr><td>류신</td><td>Himedia</td><td>GRM054</td><td></td></tr><tr><td>리튬 아세타태</td><td>시그마</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>염화마그네슘 육수화물</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>몰리브딕산</td><td>Himedia</td><td>RM690</td><td></td></tr><tr><td>니코틴산</td><td>Himedia</td><td>CMS177</td><td></td></tr><tr><td>PEG, MW 4000</td><td>Sigma</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>펜토틴산</td><td>Himedia</td><td>TC159</td><td></td></tr><tr><td>페놀</td><td>Himedia</td><td>MB082</td><td></td></tr><tr><td>플라스미드 추출 키트</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>염화칼</td>륨 <td>시그마</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>칼륨 수소 프탈레이트</td><td>머크</td><td>DDD7D670815</td><td></td></tr><tr><td>요오드화 칼륨</td><td>히메디아</td><td>RM1086</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>발효</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>히미디어</td><td>GRM205</td><td></td></tr><tr><td>수산화나트륨</td><td>히메디</td>아 <td>GRM1183</td><td></td></tr><tr><td>황산나트륨</td><td>Himedia</td><td>RM1037</td><td></td></tr><tr><td>Tris free Base</td><td>Himedia</td><td>MB209</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Himedia</td><td>GRM264</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물 분말</td><td>Himedia</td><td>RM668</td><td></td></tr><tr><td>아연 황산염 Heptahydrate</td><td>Merc</td><td>DJ9D692580</td><td></td></tr></tbody></table>

schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

유전적 상호작용의 식별은 다른 유전자와의 기능적 관계 및 생물학적 경로 및 과정에 대한 조직에 대한 통찰력을 제공함으로써 유전자의 기능을 해독하는 강력한 도구입니다. 대부분의 유전자 스크리닝은 처음에 사카로마이세스 세레비시아에에서 개발되었지만, 이러한 유전자 스크리닝을 수행하기 위한 보완적인 플랫폼은 Schizosaccharomyces pombe에 의해 제공되었다. 유전적 상호작용을 확인하는 데 사용되는 일반적인 접근법 중 하나는 기능 상실 돌연변이에서 게놈 전체의 높은 복제 수 플라스미드 라이브러리에서 클론을 과발현한 다음 돌연변이 표현형을 억제하는 클론을 선택하는 것입니다.
이 논문은 S. pombe에서 이 '다중 복제 억제' 기반 유전자 스크리닝을 수행하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 S. pombe 에서 Ell1 전사 신장 인자의 부재와 관련된 유전 독성 스트레스 민감성 표현형의 다중 복제 억제 인자를 식별하는 데 도움이되었습니다. 스크리닝은 질의 ell1 널 돌연변이 균주를 높은 카피 수 S. 폼베 cDNA 플라스미드 라이브러리로 형질전환하고, 유전독성 스트레스 유도 화합물인 4-니트로퀴놀린 1-옥사이드(4-NQO)를 함유하는 EMM2 플레이트 상에서 억제인자를 선택함으로써 시작되었다. 이어서, 플라스미드를 2개의 후보 억제 콜로니로부터 분리하고, 제한 효소에 의해 분해하여 삽입 DNA를 방출하였다. 삽입 DNA 단편을 방출하는 플라스미드를 ell1 결실 균주로 재변형시켜 4-NQO 및 기타 유전독성 화합물의 존재 하에 ell1 결실 돌연변이체의 성장을 회복시키는 이들 억제 플라스미드 클론의 능력을 확인하였다. 결실 표현형의 구조를 보여주는 플라스미드는 ell1 결실 관련 유전독성 스트레스 민감성 표현형의 억제를 담당하는 유전자(들)를 확인하기 위해 시퀀싱되었습니다.

S. pombe에서 ell1 결실 관련 유전독성 스트레스 민감도의 다중 복제 억제인자에 대한 스크리닝 질의 ell1 결실 돌연변이 균주의 기능 상실 표현형의 멀티카피 억제인자를 확인하기 위해 위에서 설명한 프로토콜을 사용하여 유전자 스크리닝을 수행하였다. 4-NQO 유전독성제의 존재 하에서 관찰된 ell1 결실 균주의 성장 관련 민감도를 멀티카피 억제인자를 선택하기 위해 기능 상실 표현형으로서 채택하였다. 도 1은 유전자 스크린의 개략적인 표현을 나타낸다. 스크린을 시작하기 위해, 4-NQO의 존재 하에 그의 이소제닉 야생형 균주 (h-ura4-D18 leu1-32 ade6-M210 can1-1 ell1Δ::kanMX6)의 유전독성 스트레스 민감도를 그의 이소제닉 야생형...

이 연구는 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 유전자 스크리닝을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 스크린은 게놈 전체 플라스미드 라이브러리를 사용하여 질의 돌연변이 균주와 관련된 기능 상실 표현형의 억제인자 클론(들)을 식별합니다. ell1 null 돌연변이체의 신규한 유전자 억제인자를 이 스크린을 사용하여 확인하였다.

Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships ...

억제기 스크린은 관심 유전자의 기능뿐만 아니라 생체 내에서 관여할 수 있는 경로 및 생물학적 과정을 밝혀줄 유전적 상호 작용을 식별합니다. 이 기술은 다른 접근법을 사용하여 입증되지 않았을 수있는 두 유전자 산물 간의 유전 적 관계를 식별 할 수 있습니다. 효모에서 이러한 스크리닝의 결과는 대부분의 기본적인 생물학적 경로와 과정이 진화를 통해 보존되기 때문에 높은 진핵 생물로 확장 될 수 있습니다.이 계획의 성공 여부는 효모 세포로의 변형의 가용성, 고품질 및 고효율에 달려 있습니다. 따라서, 형질전환 프로토콜을 YE 배지 플레이트 상에서 섭씨 32도에서 오미자락 폼베엘1 결실 균주를 성장시키기 전에 플라스미드를 갖는다. 플레이트에서 ell1 돌연변이 균주로 가득 찬 루프를 가져와 보충된 YE 배지 5밀리리터를 접종한 다음 섭씨 32도에서 밤새 흔들면서 바이알을 배양합니다.배양 후, 600 나노미터에서 0.3 광학 밀도를 달성하기 위해 원하는 보충제를 함유하는 100 밀리리터의 신선한 YE 배지에서 밤새 성장 배양물을 희석한다. 600 나노미터의 광학 밀도가 중간 로그 단계에 도달할 때까지 200 내지 550 RPM으로 흔들면서 섭씨 32도에서 배지를 배양한다. 배양물 100 밀리리터를 두 개의 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 나눈 후, 실온에서 10 분 동안 4, 000 배 G에서 세포를 펠릿화한다.상청액이 폐기되면 세포 펠릿을 멸균수 1ml에 재현탁합니다. 원심분리하여 상청액을 다시 한 번 버린 다음, 세포 펠렛을 1밀리리터의 리튬 아세테이트 TE에 재현탁시킨다. 원심분리에 의해 세포를 펠렛하고, 각 세포 펠렛을 250 마이크로리터의 리튬 아세테이트 TE에 재현탁시킨다. 다음으로, 후속 형질전환 단계를 위해 125마이크로리터의 적격 세포를 4개의 서로 다른 멸균 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 연어 고환이나 청어 정자의 운반체 DNA를 1 분 동안 끓여서 즉시 튜브를 얼음 위에 놓습니다.각 형질전환에 대해 10마이크로리터의 단일 가닥 캐리어 DNA를 125마이크로리터의 적격 세포가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 이어서, 50 마이크로그램의 오미자당류의 폼베 cDNA 라이브러리를 유능한 세포 및 운반체 DNA 혼합물을 함유하는 튜브에 첨가한다. 튜브를 실온에서 10분 동안 배양한 후 260마이크로리터의 폴리에틸렌 글리콜-리튬 아세테이트 용액을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.변형 혼합물이 들어있는 튜브를 흔들지 않고 섭씨 32도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 43 마이크로 리터의 예열 된 디메틸 설폭 시드를 튜브에 넣고 부드럽게 혼합하십시오. 이제 튜브를 섭씨 42도에서 5분 동안 열 충격에 노출시킵니다.세포를 펠렛화하고 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 버리고 이어서 잔류 폴리에틸렌 글리콜 리튬 아세테이트 TE 용액을 피펫팅한다. 세포를 100 마이크로 리터의 멸균 수에 재현탁하고 필요한 보충제와 0.2-NQO 밀리리터 당 4 마이크로 그램이 들어있는 하나의 EMM2 플레이트에 플레이트합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 32도에서 5-6일 동안 배양하여 플레이트에 콜로니가 나타나도록 합니다.추가 스크리닝을 위해, 수득된 콜로니를 4-NQO 밀리리터당 0.2마이크로그램의 존재하에 동일한 배지 플레이트에 줄무늬를 떨어뜨린다. 하나의 라이브러리 형질전환 실험의 경우, 형질전환에 500마이크로리터의 적격 세포를 사용하고 형질전환 혼합물의 1x10분의 1을 EMM2 플레이트에 4-NQO가 결여된 필수 보충제와 함께 플레이트하여 형질전환 후 얻은 라이브러리 클론의 총 수를 계산하고 억제 클론을 스크리닝합니다. 100 내지 200 마이크로리터의 멸균수를 멸균 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 첨가한다.멸균 이쑤시개 또는 20-200-마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 4-NQO를 함유하는 플레이트에서 cDNA 라이브러리 형질전환 후 얻은 각 콜로니에서 소량의 접종물을 선택합니다. 각각의 다른 콜로니의 접종 물을 멸균 수가 들어있는 플레이트의 각 웰에 넣고 완전히 혼합하십시오. 각 웰에서 3마이크로리터의 세포 현탁액을 EMM2 한천 플레이트에 스팟하고 플레이트에 적절한 농도의 4-NQO를 추가합니다.세포를 섭씨 32도에서 3-4 일 동안 성장시킨 후 추정 억제 인자로 다양한 농도의 4-NQO에서 성장을 보이는 콜로니를 확인하십시오. 억제기를 추가로 검증하려면 선택된 억제기 및 적절한 대조 균주를 밀리리터당 225마이크로그램의 아데닌과 우라실을 포함하는 EMM2 배지에서 섭씨 32도에서 밤새 흔들면서 성장시킵니다. 배양이 끝난 후 세포를 신선한 EMM2 배지에서 0.3의 광학 밀도로 희석하고 중간 로그 단계까지 섭씨 32도에서 흔들면서 성장시킵니다.0.4 마이크로몰 4-NQO 또는 0.01%MMS를 포함하는 필수 보충제를 사용하여 EMM2 플레이트에서 배양물의 적절한 연속 희석액을 찾아냅니다. 통제를 위해 EMM2 플레이트에서 필요한 보충제가 있지만 DNA 손상 물질이 없는 균주를 발견하십시오. 성장을 모니터링하기 위해 플레이트를 섭씨 32도에서 3-5일 동안 배양합니다.관심 유전자 또는 빈 벡터로 형질전환된 돌연변이 균주를 라이브러리 형질전환체와 함께 각각 양성 및 음성 대조군으로 발견합니다. 아데닌 및 우라실의 밀리리터당 225 마이크로그램을 함유하는 EMM2 배지에 단일 효모 콜로니를 접종하고, 200 내지 250 RPM에서 진탕하면서 밤새 섭씨 32도에서 세포를 성장시킨다. 배양이 끝나면 실온에서 2 분 동안 4, 000 배 G에서 원심 분리하여 광학 밀도 0.5의 배양 물 10 밀리리터를 수확합니다.상청액을 제거하고 세포 펠릿을 0.2 밀리리터의 용해 완충액에 재현탁시킨다. 0.2 밀리리터의 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올과 0.3 그램의 산 세척 유리 비드를 미세 원심 분리 튜브에 첨가합니다. 튜브를 2 분 동안 볼텍싱하여 혼합 한 다음 1 분 동안 얼음 위에서 배양합니다.실온에서 15 분 동안 튜브를 10, 000 회 G로 원심 분리하십시오. 상부 수층을 새로운 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 200 마이크로 리터의 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올을 첨가합니다. 다시 10, 000회 G에서 10분 동안 원심분리한 후, 상부 수층을 새로운 튜브로 옮긴다.그런 다음 2 부피의 100 % 에탄올과 1x10 부피의 아세트산 나트륨을 튜브에 넣고 섭씨 영하 70도에서 1 시간 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 G에서 10, 000배 G로 원심분리하여 DNA를 침전시키고 상층액을 제거한다. DNA 펠릿을 70 % 에탄올로 씻고 실온에서 자연 건조시킵니다.20 마이크로 리터의 멸균 된 물에 DNA를 재현 탁하고 3-5 마이크로 리터의 플라스미드 DNA를 사용하여 유능한 대장균 세포를 변형시킵니다. 표준 프로토콜을 사용하여 분리된 효모 플라스미드를 대장균 TOP10 균주로 변환하고 필요한 항생제로 LB 플레이트에 세포를 퍼뜨립니다. 표준 알칼리성 용해 프로토콜을 사용하여 대장균 형질전환체로부터 플라스미드를 분리한 후, 제한 효소의 적절한 조합을 따라 제한 분해에 의한 삽입 DNA 단편의 방출을 확인합니다.다음으로, ell1 결실 균주에서 제한 소화 후 삽입 방출을 보이는 플라스미드를 재변형하여 ell1 결실 균주의 유전독성 스트레스 민감성 표현형을 구제하는 능력을 확인하였다. ell1-결실된 오미자충 폼베 균주는 야생형 균주에 비해 4-NQO에 대한 민감도를 보였다. 4-NQO가없는 판에서 많은 수의 콜로니가 얻어진다.그러나, 4-NQO 플레이트에서 더 적은 형질전환체가 얻어졌는데, 이는 이들이 ell1 널 돌연변이체의 4-NQO 민감도의 징벌적 억제인자로서 작용하기 때문이다. 620개의 형질전환체 중, 74개는 0.4-마이크로몰 4-NQO에서 성장을 보였다. 74 개 중 16 개만이 0.8- 마이크로 몰 4-NQO의 존재 하에서 성장을 보였다.빈 벡터로 형질전환된 ell1 결실 균주와 16개의 형질전환체 모두가 4-NQO가 결여된 플레이트 상에서 성장을 보였다. 빈 벡터만을 함유하는 ell1 결실 돌연변이체는 0.8-마이크로몰 4-NQO에서 성장을 나타내지 않았고, 6개의 형질전환체는 0.8-마이크로몰 4-NQO에서 성장을 나타내었으며, 이는 이들 안에 존재하는 라이브러리 클론이 ell1 널 돌연변이체의 유전독성 스트레스 표현형을 억제할 수 있음을 시사한다. 억제 플라스미드 84 및 104의 제한 소화는 각각 1 킬로베이스 및 800 염기쌍의 삽입물을 방출하였다.억제인자 플라스미드 클론을 ell1 널 돌연변이체 내로 재도입하는 것은 4-NQO 관련 성장 민감도의 억제를 초래하였다. 그러나, MMS의 존재하에, ell1 결실 돌연변이체를 함유하는 서프레서 플라스미드는 빈 벡터를 갖는 플라스미드보다 더 많은 성장을 보였다. 이러한 유전자 스크리닝은 잠재적인 내성 메커니즘을 설명하고 새로운 항균, 항진균, 항기생충 또는 항암 화합물의 단백질 표적을 식별할 수 있습니다.그들은 또한 의약품의 작용 메커니즘을 확인할 수 있습니다.

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생물학

우리는 유전자 - 약물 및 유전자 - 환경 상호 작용을 이해하는 포괄적인 불편 게놈 - 와이드 스크린을 개발했습니다. 이러한 돌연변이 컬렉션을 검사 방법이 제공됩니다.

Barcoded 효모 게놈 라이브러리의 경쟁력 화면

여기에서는 발아 효모에서 화학적-유전적 상호 작용을 정의하기 위한 비용 효율적인 방법을 제시합니다. 이 접근 방식은 효모 분자 생물학의 기본 기술을 기반으로 하며 중소 규모의 화학 물질 및 기타 매체 환경에 대한 기계론적 조사에 매우 적합합니다.

화학 유전자 상호 작용의 신속한 식별<em&gt; 사카로 미세스 세 레비 시아</em

스트레스 저항은 장수의 특징 중 하나이며 유 전적으로 규율하는 것으로 알려져있다. 여기, 우리는 장수 연구에 마우스 모델을 개발하기 위해있는 배아 줄기 세포에 스트레스 저항을 부여 돌연변이 선별 편견 높은 처리량 방법을 개발했다.

앞으로 유전 접근은 마우스의 스트레스 저항성 유전자를 밝히기 위해서 - ES 세포에서 높은 처리량 화면

이 프로토콜 기능 S. cerevisiae에 단백질 기반 상속에 대 한 화면을 높은 처리량 방법을 설명 합니다.

S. cerevisiae 에 단백질 기반 상속에 대 한 높은 처리량 검열

선물이 분열에 간단한 억압 화면 프로토콜 효 모. 이 방법은 효율적, 돌연 무료이 고 단일 게놈 소재 시에 자주 발생 하는 돌연변이 대 한 선택적입니다.  프로토콜은 진압 완화 돌연변이 또는 약물에 의해 발생 하는 액체 문화에서 성장 결함 격리 적합 합니다.

분열 효 모 Schizosaccharomyces pombe 에 깊은 시퀀싱 지원, 자발적인 억압 화면

CRISPR-Cas9 기술은 모든 세포 유형에서 포유류 게놈을 정밀하게 편집하는 효율적인 방법을 제공하며 게놈 전체의 유전 적 스크린을 수행하는 새로운 수단을 나타냅니다. 풀링된 게놈 전체 CRISPR-Cas9 스크린의 성공적인 성능을 위해 필요한 단계를 논의하는 상세한 프로토콜이 여기에 제공됩니다.

포유류 세포에 있는 풀린 CRISPR 기지를 둔 유전 스크린

세균성 병원체는 중요한 생물학 프로세스를 표적으로 하는 호스트로 단백질을 은닉합니다. 세균성 이펙터 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로를 확인하는 것은 분자 병인을 해결하는 열쇠입니다. 여기서, 독성 세균 이펙터 단백질에 의해 표적화된 숙주 경로를 해명하기 위해 변형된 효모 억제기 및 독성 스크린을 사용하는 방법이 기재되어 있다.

효모 독성 및 억제기 스크린을 사용하여 세균 효과 단백질에 의해 표적으로 한 호스트 통로의 확인

다음은 Saccharomyces cerevisiae에서증가 된 복사 번호 억제기 화면을 통해 유전 적 상호 작용을 식별하는 프로토콜입니다. 이 방법을 통해 연구자들은 단명한 효모 돌연변이체에서 억제제를 식별, 복제 및 테스트할 수 있습니다. 우리는 autophagy null 돌연변이의 수명에 SIR2의 복사 수 증가의 효과를 테스트합니다.

사카로미세스 cerevisiae에서 연대 수명을 조절하는 유전 링크의 특성화를 위한 억제기 스크린

우리는 유전자 조작 마우스 모델에서 발생하는 종양과 해당 인간 종양 유형에서 발생하는 종양의 치료 표적을 식별하고 비교하기 위해 게놈 분석 및 기능적 게놈 스크리닝을 활용하는 종간 비교 종양유전체학 접근 방식을 개발했습니다.

악성 말초 신경초 종양의 마우스 모델에서 치료 표적을 식별하기 위한 유전자 프로파일링 및 게놈 규모 드롭아웃 스크리닝

어둠 / 빛으로 전환 시험은 마우스의 동작과 같은 불안을 측정하기 위하여 가장 널리 사용되는 검사 중 하나입니다. 여기, 우리가 테스트를 실시하는 방법에 대한 자세한 절차를 보여주는 동영상을 제시한다.

마우스에 대한 진한 / 라이트 전환 테스트

학습하세요 Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자 유전자 스크리닝 방법을. ell1 결실 돌연변이에서 유전적 억제자를 식별하고 생물학적 경로를 연구하는 데 활용할 수 있습니다.

Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝

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