Schizosaccharomyces pombe에서 다중 복제 억제 인자의 식별을위한 유전자 스크리닝

억제기 스크린은 관심 유전자의 기능뿐만 아니라 생체 내에서 관여할 수 있는 경로 및 생물학적 과정을 밝혀줄 유전적 상호 작용을 식별합니다. 이 기술은 다른 접근법을 사용하여 입증되지 않았을 수있는 두 유전자 산물 간의 유전 적 관계를 식별 할 수 있습니다. 효모에서 이러한 스크리닝의 결과는 대부분의 기본적인 생물학적 경로와 과정이 진화를 통해 보존되기 때문에 높은 진핵 생물로 확장 될 수 있습니다.

이 계획의 성공 여부는 효모 세포로의 변형의 가용성, 고품질 및 고효율에 달려 있습니다. 따라서, 형질전환 프로토콜을 YE 배지 플레이트 상에서 섭씨 32도에서 오미자락 폼베엘1 결실 균주를 성장시키기 전에 플라스미드를 갖는다. 플레이트에서 ell1 돌연변이 균주로 가득 찬 루프를 가져와 보충된 YE 배지 5밀리리터를 접종한 다음 섭씨 32도에서 밤새 흔들면서 바이알을 배양합니다.

배양 후, 600 나노미터에서 0.3 광학 밀도를 달성하기 위해 원하는 보충제를 함유하는 100 밀리리터의 신선한 YE 배지에서 밤새 성장 배양물을 희석한다. 600 나노미터의 광학 밀도가 중간 로그 단계에 도달할 때까지 200 내지 550 RPM으로 흔들면서 섭씨 32도에서 배지를 배양한다. 배양물 100 밀리리터를 두 개의 50 밀리리터 원심 분리 튜브로 나눈 후, 실온에서 10 분 동안 4, 000 배 G에서 세포를 펠릿화한다.

상청액이 폐기되면 세포 펠릿을 멸균수 1ml에 재현탁합니다. 원심분리하여 상청액을 다시 한 번 버린 다음, 세포 펠렛을 1밀리리터의 리튬 아세테이트 TE에 재현탁시킨다. 원심분리에 의해 세포를 펠렛하고, 각 세포 펠렛을 250 마이크로리터의 리튬 아세테이트 TE에 재현탁시킨다. 다음으로, 후속 형질전환 단계를 위해 125마이크로리터의 적격 세포를 4개의 서로 다른 멸균 마이크로원심분리 튜브로 옮깁니다. 연어 고환이나 청어 정자의 운반체 DNA를 1 분 동안 끓여서 즉시 튜브를 얼음 위에 놓습니다.

각 형질전환에 대해 10마이크로리터의 단일 가닥 캐리어 DNA를 125마이크로리터의 적격 세포가 들어 있는 마이크로원심분리 튜브에 추가하고 피펫팅으로 부드럽게 혼합합니다. 이어서, 50 마이크로그램의 오미자당류의 폼베 cDNA 라이브러리를 유능한 세포 및 운반체 DNA 혼합물을 함유하는 튜브에 첨가한다. 튜브를 실온에서 10분 동안 배양한 후 260마이크로리터의 폴리에틸렌 글리콜-리튬 아세테이트 용액을 추가하고 피펫팅으로 혼합합니다.

변형 혼합물이 들어있는 튜브를 흔들지 않고 섭씨 32도에서 2 시간 동안 배양하십시오. 43 마이크로 리터의 예열 된 디메틸 설폭 시드를 튜브에 넣고 부드럽게 혼합하십시오. 이제 튜브를 섭씨 42도에서 5분 동안 열 충격에 노출시킵니다.

세포를 펠렛화하고 이전에 입증된 바와 같이 상청액을 버리고 이어서 잔류 폴리에틸렌 글리콜 리튬 아세테이트 TE 용액을 피펫팅한다. 세포를 100 마이크로 리터의 멸균 수에 재현탁하고 필요한 보충제와 0.2-NQO 밀리리터 당 4 마이크로 그램이 들어있는 하나의 EMM2 플레이트에 플레이트합니다. 그런 다음 플레이트를 섭씨 32도에서 5-6일 동안 배양하여 플레이트에 콜로니가 나타나도록 합니다.

추가 스크리닝을 위해, 수득된 콜로니를 4-NQO 밀리리터당 0.2마이크로그램의 존재하에 동일한 배지 플레이트에 줄무늬를 떨어뜨린다. 하나의 라이브러리 형질전환 실험의 경우, 형질전환에 500마이크로리터의 적격 세포를 사용하고 형질전환 혼합물의 1x10분의 1을 EMM2 플레이트에 4-NQO가 결여된 필수 보충제와 함께 플레이트하여 형질전환 후 얻은 라이브러리 클론의 총 수를 계산하고 억제 클론을 스크리닝합니다. 100 내지 200 마이크로리터의 멸균수를 멸균 96-웰 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 첨가한다.

멸균 이쑤시개 또는 20-200-마이크로리터 마이크로피펫 팁을 사용하여 4-NQO를 함유하는 플레이트에서 cDNA 라이브러리 형질전환 후 얻은 각 콜로니에서 소량의 접종물을 선택합니다. 각각의 다른 콜로니의 접종 물을 멸균 수가 들어있는 플레이트의 각 웰에 넣고 완전히 혼합하십시오. 각 웰에서 3마이크로리터의 세포 현탁액을 EMM2 한천 플레이트에 스팟하고 플레이트에 적절한 농도의 4-NQO를 추가합니다.

세포를 섭씨 32도에서 3-4 일 동안 성장시킨 후 추정 억제 인자로 다양한 농도의 4-NQO에서 성장을 보이는 콜로니를 확인하십시오. 억제기를 추가로 검증하려면 선택된 억제기 및 적절한 대조 균주를 밀리리터당 225마이크로그램의 아데닌과 우라실을 포함하는 EMM2 배지에서 섭씨 32도에서 밤새 흔들면서 성장시킵니다. 배양이 끝난 후 세포를 신선한 EMM2 배지에서 0.3의 광학 밀도로 희석하고 중간 로그 단계까지 섭씨 32도에서 흔들면서 성장시킵니다.

0.4 마이크로몰 4-NQO 또는 0.01%MMS를 포함하는 필수 보충제를 사용하여 EMM2 플레이트에서 배양물의 적절한 연속 희석액을 찾아냅니다. 통제를 위해 EMM2 플레이트에서 필요한 보충제가 있지만 DNA 손상 물질이 없는 균주를 발견하십시오. 성장을 모니터링하기 위해 플레이트를 섭씨 32도에서 3-5일 동안 배양합니다.

관심 유전자 또는 빈 벡터로 형질전환된 돌연변이 균주를 라이브러리 형질전환체와 함께 각각 양성 및 음성 대조군으로 발견합니다. 아데닌 및 우라실의 밀리리터당 225 마이크로그램을 함유하는 EMM2 배지에 단일 효모 콜로니를 접종하고, 200 내지 250 RPM에서 진탕하면서 밤새 섭씨 32도에서 세포를 성장시킨다. 배양이 끝나면 실온에서 2 분 동안 4, 000 배 G에서 원심 분리하여 광학 밀도 0.5의 배양 물 10 밀리리터를 수확합니다.

상청액을 제거하고 세포 펠릿을 0.2 밀리리터의 용해 완충액에 재현탁시킨다. 0.2 밀리리터의 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올과 0.3 그램의 산 세척 유리 비드를 미세 원심 분리 튜브에 첨가합니다. 튜브를 2 분 동안 볼텍싱하여 혼합 한 다음 1 분 동안 얼음 위에서 배양합니다.

실온에서 15 분 동안 튜브를 10, 000 회 G로 원심 분리하십시오. 상부 수층을 새로운 마이크로 원심 분리 튜브로 옮기고 200 마이크로 리터의 페놀 클로로포름 이소아밀 알코올을 첨가합니다. 다시 10, 000회 G에서 10분 동안 원심분리한 후, 상부 수층을 새로운 튜브로 옮긴다.

그런 다음 2 부피의 100 % 에탄올과 1x10 부피의 아세트산 나트륨을 튜브에 넣고 섭씨 영하 70도에서 1 시간 동안 배양합니다. 섭씨 4도에서 15분 동안 G에서 10, 000배 G로 원심분리하여 DNA를 침전시키고 상층액을 제거한다. DNA 펠릿을 70 % 에탄올로 씻고 실온에서 자연 건조시킵니다.

20 마이크로 리터의 멸균 된 물에 DNA를 재현 탁하고 3-5 마이크로 리터의 플라스미드 DNA를 사용하여 유능한 대장균 세포를 변형시킵니다. 표준 프로토콜을 사용하여 분리된 효모 플라스미드를 대장균 TOP10 균주로 변환하고 필요한 항생제로 LB 플레이트에 세포를 퍼뜨립니다. 표준 알칼리성 용해 프로토콜을 사용하여 대장균 형질전환체로부터 플라스미드를 분리한 후, 제한 효소의 적절한 조합을 따라 제한 분해에 의한 삽입 DNA 단편의 방출을 확인합니다.

다음으로, ell1 결실 균주에서 제한 소화 후 삽입 방출을 보이는 플라스미드를 재변형하여 ell1 결실 균주의 유전독성 스트레스 민감성 표현형을 구제하는 능력을 확인하였다. ell1-결실된 오미자충 폼베 균주는 야생형 균주에 비해 4-NQO에 대한 민감도를 보였다. 4-NQO가없는 판에서 많은 수의 콜로니가 얻어진다.

그러나, 4-NQO 플레이트에서 더 적은 형질전환체가 얻어졌는데, 이는 이들이 ell1 널 돌연변이체의 4-NQO 민감도의 징벌적 억제인자로서 작용하기 때문이다. 620개의 형질전환체 중, 74개는 0.4-마이크로몰 4-NQO에서 성장을 보였다. 74 개 중 16 개만이 0.8- 마이크로 몰 4-NQO의 존재 하에서 성장을 보였다.

빈 벡터로 형질전환된 ell1 결실 균주와 16개의 형질전환체 모두가 4-NQO가 결여된 플레이트 상에서 성장을 보였다. 빈 벡터만을 함유하는 ell1 결실 돌연변이체는 0.8-마이크로몰 4-NQO에서 성장을 나타내지 않았고, 6개의 형질전환체는 0.8-마이크로몰 4-NQO에서 성장을 나타내었으며, 이는 이들 안에 존재하는 라이브러리 클론이 ell1 널 돌연변이체의 유전독성 스트레스 표현형을 억제할 수 있음을 시사한다. 억제 플라스미드 84 및 104의 제한 소화는 각각 1 킬로베이스 및 800 염기쌍의 삽입물을 방출하였다.

억제인자 플라스미드 클론을 ell1 널 돌연변이체 내로 재도입하는 것은 4-NQO 관련 성장 민감도의 억제를 초래하였다. 그러나, MMS의 존재하에, ell1 결실 돌연변이체를 함유하는 서프레서 플라스미드는 빈 벡터를 갖는 플라스미드보다 더 많은 성장을 보였다. 이러한 유전자 스크리닝은 잠재적인 내성 메커니즘을 설명하고 새로운 항균, 항진균, 항기생충 또는 항암 화합물의 단백질 표적을 식별할 수 있습니다.

그들은 또한 의약품의 작용 메커니즘을 확인할 수 있습니다.