Name: 지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: 배우세요 지지된 지질 이중층에 막으로 묶인 액틴-미오신 네트워크를 조립하여 고급 형광 현미경으로 역학을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 세포골격 단백질을 순차적으로 첨가할 수 있어 다양한 세포생물학 연구에 활용 가능합니다.

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이 연구는 AXA 연구 기금과 DVK의 경우 Warwick-Wellcome Quantitative Biomedicine Program (Wellcome ISSF, RMRCB0058), AB 및 ST의 경우 NCBS-TIFR, SM의 경우 Wellcome-DBT Margdarshi 펠로우십 (IA / M / 15 / 1 / 502018)의 지원을 받았습니다. DVK는 또한 가상 네트워킹 이벤트 "분자에서 중간 규모에 이르는 다중 성분 세포 골격 네트워크 이해의 과제"를 가능하게 한 생물 물리학 학회에 감사드립니다. 이 프로토콜 컬렉션의 생성에 기여했습니다.

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
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저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.

이 프로토콜은 세포의 막-피질 인터페이스를 연구하기 위한 실험을 설계하기 위한 다목적 플랫폼과 출발점을 제공합니다. 중요한 단계는 깨끗한 유리 슬라이드를 준비하고, 효율적인 SUV 형성을 위해 신선한 지질을 사용하고(둘 다 SLB의 품질에 영향을 미침), 동적 액틴 필라멘트 재구성을 위해 새로 재활용된 미오신 II 단백질을 사용하는 것입니다. 장기간에 걸친 이미징 역학을 수행할 때 산소 제거제 시스템(예: 프로토카테추산 및 프로토카테추에이트 3 4-디옥시게나제 5,31)을 통합하는 것이 매우 중요합니다.
개방형 챔버 설계는 지질 흐름을 유도하지 않고 기존 시스템에 구성 요소를 순차적으로 추가할 수 있습니다. 이는 일반적으로 사용되는 폐쇄 챔버 접근법 또는 리포솜(36) 내에서 캡슐화된 단백질을 사용하는 작업에 비해 중요한 이점이 될 수 있다. 단백질 유도 막 변형과 같은 반대 효과는 유리 흡착 지질 이중층으로 연구 할 수 없습니다.
지질 이중층은 광범위한 지질 조성물로 형성될 수 있다. 그것은 친수성 유리 표면에 대한 지질 소포의 흡착으로 시작하여 표면-소포 및 직접 소포-소포 상호 작용으로 인한 자발적인 소포 파열 또는 흡착 된 소포가 임계 범위에 도달 한 후 소포의 작은 부분이 파열되어 활성 가장자리를 형성하여 결국 이중층 형성으로 이어진다32 . 유리 외에, 다양한 기판이 지지된 지질 이중층을 형성하는데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 운모 (예를 들어, 원자력 현미경을 위해), 연질 기판 (예를 들어, 폴리-디메틸-실록산), 중합체 쿠션(33,34,35), 전자 현미경 그리드 (14)의 구멍 사이에 걸쳐있다. 액적 계면 이중층은 안정하고 독립된 지질 이중층(36)을 생성하는 또 다른 흥미로운 방법이다. 소포 또는 에멀젼 내로의 액토-미오신 네트워크의 포함은 세포-유사 기하학적 37, 38에서 이러한 최소 시스템을 연구하는 매우 강력한 방법이며, 이는 다른 곳(39)에서 상세히 기재되어 있다.

살아있는 동물 세포의 원형질막은 인접한 액틴 세포 골격과 지속적으로 상호 작용하며, 함께 다양한 세포 기능을 수행하는 활성 복합 물질을 형성합니다 1,2. 이 지질막-액틴 계면에서의 공정을 연구하기 위해, 지원되는 지질 이중층(SLB) 위에 세포골격 네트워크를 재구성하는 것이 매우 유용한 것으로 입증되었습니다. 이 최소 시스템 접근 방식을 통해 세포 골격 네트워크 구성 요소와 지질 구성을 정밀하게 제어 할 수 있습니다. SLB의 평면 형상은 거대한 단층 소포의 독립형 지질막과 비교하여 초고해상도3,4, 전반사 형광(TIRF)5,6,7 또는 간섭계 산란8과 같은 최첨단 현미경 기술을 효율적으로 사용할 수 있습니다. 세포 골격 네트워크의 공간 조직과 역학을 연구합니다. TIRF는 배경 신호에 기여하는 용액에서 결합되지 않은 표지 된 분자의 신호가 최소화되기 때문에 형광 표지 된 성분에 대해 가장 높은 대비를 제공합니다.
여기에서는 활성 준 2D 네트워크 9,10,11의 물리학과 막 조직3,5,12,13,14,15,16에 미치는 영향을 연구하기 위해 현장에서 널리 사용되는 지지된 지질 이중층에 연결된 액토미오신 네트워크의 형성을 위한 기본 프로토콜을 설명합니다(그림 1 ). 이 접근법은 액틴 기반 네트워크에 국한되지 않고 미세 소관, 중간 필라멘트 또는 혼합 된 특성의 복합 네트워크를 탐색하고 표면 민감성 현미경 방법을 사용하여 지질 막 단백질과 세포 골격 구성 요소 간의 다양한 상호 작용을 연구하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다.
이 프로토콜에 초점을 맞추기 위해 액틴 및 미오신 단백질의 정제 및 표지에 대한 자세한 설명이나 액토미오신 네트워크의 수축성 및 조직을 조정하고 제어하는 방법에 대한 세부 정보를 제외했습니다. JoVE Method Collection, 생체 재료, 생물 물리학 및 활성 물질 연구를위한 세포 골격 네트워크의 체외 재구성17에서 이와 함께 출판 된 다른 프로토콜을 참조해야합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg"> 그림 1: 시험관내 액틴-막 활성 복합 시스템의 개략도. 바이오렌더로 만들었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table><tbody><tr><td>1,2 디팔미토일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민-N-(리사민 로다민 B 설포닐)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-[(N-(5-아미노-1 카르복시펜틸)이미노디아세트산)숙시닐](니켈염)</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni2+</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti 극성 지질</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850355</td><td>DPPC</td></tr><tr><td>Amber glass vials</td><td>ThermoFisher</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>ATP disodium salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor cell chamber</td><td>ThermoFisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>GT Sonic</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>베타 카제인</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>클로로포름</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td>전자 현미경 과학, 50980296</td></tr><tr><td>커버 슬립, #1, 직경 25mm, Gold Seal</td><td>Harvard Apparatus</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>커버 슬립, #1, 40x22mm, 골드 씰</td><td>ThermoFisher</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>가스 밀폐 유리 주사기, removebla 바늘, 무딘, 볼륨 10 &마이크로; L, 100 &마이크로; L, 500 &마이크로; L</td><td>Hammilton</td><td>1700 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma Analytics</td><td>Z805939</td><td>세척 솔루션</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ThermoFisher</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>지질 압출기</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</</td><td>sub>ThermoFisher</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>Microtip 초음파 발생기</td><td>Sonics</td><td>VC750</td><td>3 mm 팁 직경</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</sub</td><td>>ThermoFisher</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti Eclipse TIRF 현미경</td><td>Nikon</td><td></td>, <td>편광 보존 광섬유를 통해 Agilent 모놀리식 레이저 결합기 MLC400에 연결된 TIRF 장치 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective, 512 x 512 픽셀 EMCCD 카메라 2개가 있는 다중 레이저 라인 포함 (Photometrics Evolve 512) 100X, 1.45 NA Nikon Oil Objective와 2개의 512 x 512 픽셀 EMCCD 카메라 (Photometrics Evolve 512)</td></tr><tr><td>NOA88</td><td>Norland Products</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>PTFE 코팅 핀셋 스타일 #2A</td><td>구조 프로브</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>냉장 마이크로 원심분리기</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>ThermoFisher</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>UV 조명기</td><td>Novascan</td><td>PSD PRO-UV</td><td>진공 및 O2 공급 필요</td></tr></tbody></table>

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

살아있는 세포의 표면은 원형질막과 기본 액틴 피질의 상호 작용에서 발생하는 수많은 세포 과정을위한 다목적 활성 플랫폼을 제공합니다. 지난 수십 년 동안 액틴 필라멘트 네트워크와 함께 지지된 지질 이중층을 기반으로 하는 재구성되고 최소한의 시스템은 막으로 묶인 액틴 네트워크의 기본 메커니즘과 결과를 밝히고 개별 막 관련 단백질의 기능을 연구하는 데 매우 중요한 것으로 입증되었습니다. 여기에서는 막 관련 액틴 결합 단백질을 통해 결합된 유체 지지 지질 이중층으로 구성된 체 외 활성 복합 시스템을 전체 내부 반사 형광 현미경을 통해 쉽게 관찰할 수 있는 동적 액틴 필라멘트 및 미오신 모터로 구성하는 방법을 설명합니다. 개방형 챔버 설계를 통해 시스템을 단계별로 조립하고 링커 단백질 농도, 액틴 농도, 액틴 필라멘트 길이, 액틴/미오신 비율 및 ATP 수준과 같은 많은 매개변수를 체계적으로 제어할 수 있습니다. 마지막으로 시스템의 품질을 제어하는 방법, 일반적으로 발생하는 문제를 감지하고 해결하는 방법, 살아있는 세포 표면과 비교하여 이 시스템의 몇 가지 제한 사항에 대해 설명합니다.

표현을 위해, 여기에 광퇴색 후 1번째 이미지( 도 3A에서 t=0초에서의 이미지)와 다음 기능(28 )에 대한 피팅( 그림 6A 참조)으로부터의 전형적인 표백제 프로파일이 도시된다:
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;">
이 곡선에 대한 피팅에 의해 계산된 re(23.94 μm)의 값은 2.8.4단계에서 계산된 re와 매우 유사하다. (23.24 μm). 여기서, K는 F0로부터 직접 추정될 수 있는 표백제 깊이 파라미터이다(단계 2.8.4.에서 설명됨). 유사하게, 도 6B는 다음의 기능(28)에 대한 회복 프로파일 및 그의 적합성을 도시한다: Figure 6b shows the recovery profile and its fit to the following function28:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;">
확산 계수의 적합치는 1.34μm2/s이며, 이는 2.8.4단계의 공식으로 계산된 1.39μm2/s 값과 거의 일치하는 값입니다. 여기서, MF는 다시 회복되는 표백된 개체군의 분율을 나타내는 지질 이중층의 이동 분율을 나타낸다. 지질 고정 분자의 이동성은 물론 지질 조성과 물리적 상태 (액체 또는 겔상)에 따라 달라집니다. DOPC 기반 지질 막을 사용한 실험의 경우 이동성은 &gt;1μm2/s여야 하며 이동 분율은 0.9 이상이어야 양호한 지질 이중층을 나타냅니다. 이중층의 품질과 이동성을 빠르게 테스트하기 위해 수동 피팅 프리 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 피팅 방법은 많은 FRAP 곡선에 대한 해석을 자동화하는 동안 유용할 수 있습니다. 또한 시스템의 확산을 체계적으로 특성화하기 위해 보다 정교한 FRAP 실험을 수행하려는 경우 독자는 Lorén et al.30의 이 리뷰를 참조하여 피팅 모델 및 실험 설계의 잠재적 함정에 대한 자세한 내용을 확인하는 것이 좋습니다.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg"> 그림 6: 지질 이중층의 확산 계수 정량화. (a) 광표백 후 첫 번째 영상의 라인 프로파일( 도 3A에서 t=0s)과 이의 수학식 4에 적합하여 유효 표백제 반경을 계산한다. (b) 표백 영역의 회복 프로파일 및 이의 적합성을 하기 수학식 5로 하여 확산계수 및 이동분율을 계산한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
TIRF 현미경에 의해 이미징된 지지된 지질 이중층 상에서 연결된 액토미오신 네트워크의 동적 조립 및 조직을 보여주는 전술한 실험의 전형적인 결과가 도 7 및 보충 비디오 S1에 묘사되어 있다.
도 7 은 링커 단백질, F-액틴, 및 미오신 II의 이미지 몽타주를 도시한다.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg"> 그림 7: 수축성 액토미오신 흐름은 막-액틴 링커 단백질 HYE의 국소 클러스터링을 유도합니다. HYE 및 F- 액틴을 포함하는 SLB에 미오신 II를 첨가했을 때 HYE (YFP 태그), 액틴 필라멘트 (Atto-635 말레이 미드로 표지) 및 미오신 II 필라멘트 (Atto-565 말레이 미드로 표지)의 TIRF 스냅 샷. 시간은 상단에 표시되어 있습니다 : 0 분은 TIRF 필드에 형광 근섬유가 나타나기 시작하기 직전입니다. HYE 및 F-액틴은 미오신 첨가 전에 지질 이중층에 걸쳐 균질하게 분포된다(0분). 미오신 활성은 수축성 액토미오신 흐름을 유도하여 정상 상태(15분)에서 과꽃과 같은 구조로 나타나 결합된 막 성분(HYE)의 국소 클러스터링을 유도합니다. 가장 낮은 행은 액틴(노란색)과 미오신 II(마젠타색) 이미지의 병합으로 서로 다른 시점에서 액틴과 미오신 조직을 보여줍니다. 이 몽타주를 만드는 데 사용 된 이미지는 배경 신호, 불균일 한 강도 패턴 및 병진 이동을 위해 피지에서 수정되었습니다. 스케일 바 = 10 μm. 자세한 내용은 보충 비디오 S1을 참조하십시오. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>버퍼 이름</td>
			<td colspan="2">구성</td>
		</tr><tr><td>지질 재수 화 완충액</td>
			<td colspan="2">50 mM 헤페스, 150 mM NaCl, 5% 자당, pH 7.5</td>
		</tr><tr><td>SLB 형성 버퍼</td>
			<td colspan="2">50 mM 헤페스, 150 mM NaCl, pH 5-6</td>
		</tr><tr><td>SLB 스토리지 버퍼</td>
			<td colspan="2">50 mM 헤페스, 150 mM NaCl, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>단백질 희석 완충액</td>
			<td colspan="2">20 mM hepes, 100 mM KCl, 1mM TCEP 또는 DTT, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>1X ME 또는 액틴 이온 교환 완충액</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl2, 0.2 mM EGTA, 10 mM hepes, pH 7.2 (4°C에서 보관)</td>
		</tr><tr><td>1X KMEH 또는 액틴 중합 완충액</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM hepes, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>100 mM ATP 스톡</td>
			<td colspan="2">100 mM ATP 이 나트륨 염, 50 mM 트리스, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7.5 (-20 ° C에서 보관)</td>
		</tr><tr><td>2x 타겟 버퍼</td>
			<td colspan="2">2x KMEH, 2 밀리그램 / 밀리람베르트 BSA, 2mM ATP, 5밀리미터 TCEP (4°C에서 보관)</td>
		</tr><tr><td>G 버퍼</td>
			<td colspan="2">2 mM 트리스, 0.1 mM CaCl2, 0.2 mM ATP, 0.5 mM TCEP, 0.04% NaN3, pH 8 (4°C에서 보관)</td>
		</tr><tr><td>미오신 II 완충액</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM 헤페스, pH 7.0</td>
		</tr><tr><td>겔 여과 크로마토그래피 버퍼</td>
			<td colspan="2">50 mM 트리스-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0.1% 트윈-20, pH 7.5</td>
		</tr><tr><td>캡핑 단백질 저장 버퍼</td>
			<td colspan="2">10 mM 트리스· Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7.5, 20% 글리세롤</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 이 프로토콜에 사용된 완충액 조성물 목록.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>일반적인 문제 및 문제 해결</td>
			<td>문제</td>
			<td colspan="4">원인</td>
			<td colspan="4">가능한 해결책</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>지질 이중층은 확산을 보이지 않습니다.</td>
			<td colspan="4">이 문제의 가장 가능성있는 원인은 세척액이 노화되거나 목욕 초음파 처리 중에 가열이 발생하지 않았을 때 발생할 수있는 더러운 커버 글라스입니다. 이 이중층은 파열 된 소포가 커버 글라스에 달라 붙지 만 서로 융합되지 않기 때문에 '소포'모양을 갖습니다. 6 주 이상 된 MLV 또는 6 일 이상 된 SUV를 사용하거나 소량의 SUV를 추가하는 것도 소포 이중층 형성으로 이어질 수 있습니다.</td>
			<td colspan="4">신선한 세척액을 사용하십시오. 히터가 켜져 있고 온도가 45-65°C 사이인지 확인하십시오. 신선한 지질 혼합물을 사용하십시오. (형광 지질 프로브와 형광 단백질 프로브를 사용하는 것은 때때로 다르게 나타날 수 있습니다. 예를 들어, 이중층에 하위 회절 결함이 있고 표면 패시베이션 단계를 건너 뛰는 경우 (또는 작동하지 않는 경우) 지질 프로브는 균일 한 강도 분포를 나타내지 만 형광 단백질 프로브는 밝은 형광 반점을 표시 할 수 있습니다.)</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>지질 이중층에는 밝은 패치가 있습니다.</td>
			<td colspan="4">이중층 형성을 위한 SUV의 긴 배양은 전체적으로 확산되지만 때때로 밝은 패치가 있는 지질 이중층을 생성할 수 있습니다. 이러한 패치는 다량의 형광 프로브를 유인할 수 있는 다층 이중층일 수 있습니다.</td>
			<td colspan="4">SUV로 15-20 분 배양하면 충분합니다. 프로브가 응집되지 않는지 확인하십시오: 링커 단백질(4°C에서 15분 동안 300 x g)의 빠른 하드 스핀으로 응집체를 제거할 수 있습니다.</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>지질 이중층에는 어두운 구멍이 있습니다.</td>
			<td colspan="4">이는 이중층이 오래된 SUV로 만들어지고 장시간 (형성 후 4 시간 &gt;) 동안 이미징되거나 장기간의 이미징으로 인해 용액의 pH가 급격히 변하는 경우 (예 : 높은 ATP 상태 및 특정 산소 제거제가있는 경우) 또는 표면이 베타 카제인으로 과도하게 부동태화 된 경우 (10-15 분 이상 베타 카제인을 너무 많이 첨가하거나 씻어 내지 않을 때).</td>
			<td colspan="4">신선한 지질을 사용하십시오. 이미징 프레임 속도 또는 유효 레이저 조명 시간을 줄입니다. 버퍼링 용량이 더 높은 버퍼를 사용합니다.</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>지질 이중층은 느린 확산을 보여줍니다</td>
			<td colspan="4">콜레스테롤 비율이 높은 지질 이중층, 긴 포화 지질 또는 하전 된 지질은 느리게 확산됩니다.</td>
			<td colspan="4">이러한 경우 고온에서 샘플을 준비하십시오. 또한 단순하고 시험된 지질 조성물을 복잡하고 시험되지 않은 지질 조성물과 함께 대조군으로 사용할 수 있다. 유리가 깨끗한 지 확인하십시오.</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>액틴은 중합하지 않습니다</td>
			<td colspan="4">표적 완충액은 오래되었고, G-액틴 스톡은 너무 오래되었고, 오래된 G-액틴과 새로운 G-액틴은 공동 중합되었다.</td>
			<td colspan="4">중합 전에 Ca2+가Mg2+로 대체되었는지 확인하십시오(ME 완충액 사용). 신선한 ATP-Mg2+ 스톡을 사용하십시오. 갓 재활용한 G-액틴을 사용하십시오. 이중층에 첨가 된 F- 액틴 (G- 액틴 기준)의 농도가 0.2 μM보다 높은지 확인하십시오. 농도가 낮 으면 팔로이딘 안정화 F- 액틴을 사용하십시오.</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>액틴은 이중층에 결합하지 않습니다.</td>
			<td colspan="4">막-액틴 링커는 첨가되거나 매우 낮은 농도로 첨가되지 않으며, 이는 링커 단백질의 형광을 형성한다고 추론할 수 있다. 형광이 적당하다면, 막 - 액틴 링커는 액틴 결합 능력을 상실한 것입니다. 또한 링커 단백질이 유리 표면에 비특이적으로 결합되어 있는 경우(이중층이 나쁜 경우) 액틴 필라멘트를 모집하지 않을 수 있습니다.</td>
			<td colspan="4">이중층이 확산되고 있는지 확인하십시오. 신선한 링커 단백질 사용</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>형광 F- 액틴 신호가 약합니다.</td>
			<td colspan="4">표지 된 액틴과 다크 액틴의 비율이 너무 낮습니다. 표지 된 액틴 또는 표지되지 않은 액틴은 너무 오래되어 서로 공중 합체되지 않습니다.</td>
			<td colspan="4">액틴을 다시 재활용하고 새로 재활용된 액틴으로 계략화를 다시 시도하십시오. 광 손상은 F- 액틴을 파괴하거나 해중합시킬 수 있습니다. 가능하면 액틴 (및 미오신)에 적색 또는 원적색 염료를 사용하십시오.</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>미오신은 수축성을 나타내지 않습니다.</td>
			<td colspan="4">미오신 주입 시스템에 ATP를 첨가 한 후에는 액토 - 미오신의 수축성이 없음을 관찰 할 수 있습니다.</td>
			<td colspan="4">미오신 농도 또는 순도 수준이 좋은지 확인하십시오. 새로 재활용 된 미오신 (재활용 후 6 주 이내에 사용)을 사용하십시오. 미오신 혼합물에 신선한 ATP를 추가하면 도움이 될 수 있습니다. 완충액 탈기 및 산소 제거제 사용 등 모터의 광 손상을 줄일 수 있습니다.  추가 정보는 동일한 방법 모음의 Plastino et al. 또는 Stam et al.의 프로토콜에서 찾을 수 있습니다.</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>커버 글라스는 친수성이 아닙니다.</td>
			<td colspan="4">커버 글라스가 제대로 청소되지 않았습니다.</td>
			<td colspan="4">깨끗한 친수성 커버 글라스는 지질 이중층 형성에 중요합니다. 세척 프로토콜 후 커버 글라스의 친수성에 대한 유용하고 시각적 인 판독은 물에 의한 유리의 습윤을 관찰하는 것입니다. 평평한 커버 슬립에 소량의 물을 추가하십시오. 커버 슬립을 제대로 청소하지 않으면 물이 둥근 물방울 모양으로 유지됩니다. 그러나 동일한 양의 물이 퍼져 처리 된 친수성 커버 글라스 위에 얇은 층을 형성합니다. 커버 유리 표면에 있는 물의 이러한 습윤 거동은 세척액/NaOH를 사용한 세척 단계가 효과가 있는지 확인하는 데 사용할 수 있습니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 2: 일반적인 문제와 해당 해결 방법을 요약한 문제 해결 가이드입니다. 
보충 비디오 S1: 수축성 액토미오신 흐름은 막-액틴 링커 단백질 HYE의 국소 클러스터링을 유도합니다. HYE 및 F-액틴을 포함하는 SLB에 미오신 II를 첨가할 때 HYE(YFP-태그), 액틴 필라멘트(Atto-635 말레이미드로 표지됨) 및 미오신 II 필라멘트(Atto-565 말레이미드로 표지됨)의 TIRF 타임랩스. 시간은 상단에 표시되어 있습니다 : 0 분은 TIRF 필드에 형광 근섬유가 나타나기 시작하기 직전입니다. 스케일 바 = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

이 프로토콜은 형광 현미경을 사용하여 재구성된 막 연결 세포골격 네트워크의 역학을 연구하기 위해 지지된 지질 이중층의 형성과 세포골격 필라멘트 및 운동 단백질의 추가를 설명합니다.

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

여기에서는 멤브레인 연결 액토미오신 네트워크를 조립하고 고급 광학 현미경 기술을 사용하여 역학을 연구하는 비교적 간단하고 간단한 절차를 보여줍니다. 주요 이점은 당사의 분석이 멤브레인 연결 네트워크를 방해하지 않고 단백질과 소분자를 순차적으로 첨가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 다른 세포 골격 단백질 또는 복합 네트워크를 연구하는 데 쉽게 적용 할 수 있습니다.프로토콜의 가장 중요한 부분은 지원되는 지질 이중층이 올바르게 형성되었는지 확인하는 것이므로 먼저 세포골격 단백질을 추가하기 전에 이 단계를 마스터해야 했습니다. 시작하려면 3-5 개의 직사각형 유리 커버 슬립을 가져 와서 코플린 병 안에 넣으십시오. 목욕 초음파 처리기를 켜고 온도를 섭씨 65도로 설정합니다.코플린 병에 2% 세척 용액을 채워 커버슬립을 완전히 담그고 전체 펄스 모드에서 30분 동안 초음파 처리기에 넣습니다. 무딘 PTFE 코팅 집게를 사용하여 커버 슬립을 하나씩 제거하십시오. 증류수로 철저히 헹구고 두 개의 일반 수산화 나트륨으로 채워진 다른 코플린 병에 넣으십시오.전체 펄스 모드에서 20분 동안 커버슬립을 초음파 처리합니다. 커버 슬립을 제거하고 증류수로 철저히 헹구고 증류수가 채워진 다른 코플린 병에 넣으십시오. 실험을 시작하기 전에 질소 가스 공급 장치가 장착 된 화학 후드에 항아리를 가져 가십시오.장갑과 집게를 사용하여 커버 슬립을 제거하여 질소 흐름 아래에서 건조시킵니다. 양면을 말리고 덮개가있는 깨끗한 플라스틱 격자 위에 놓습니다. 먼지 입자와의 접촉을 피하기 위해 커버슬립이 있는 상자를 데시케이터에 넣은 다음 오토클레이브 PCR 튜브를 가져와 날카로운 수술용 칼날로 뚜껑과 아래쪽 원추형 반쪽을 잘라냅니다.원통형 하프 컷 튜브를 잡고 각 절단 튜브의 매끄러운 림에 UV 경화 접착제를 바르고 림이 커버 슬립에 평평하게 놓이도록 새로 청소 한 커버 슬립에 거꾸로 놓습니다. 접착제가 챔버의 중앙 공간으로 흘러 들어가지 않도록 실린더가 커버슬립에 위치하면 실린더를 옆으로 움직이지 마십시오. 챔버 베어링 커버슬립을 산소 공급 및 진공 청소기가 있는 UV 오존 클리너 안에 넣습니다.UV 광선을 켜고 접착제가 중합되도록 3-5분 동안 조명합니다. 커버슬립을 꺼내 챔버의 누출 여부를 테스트하고 새는 챔버는 폐기합니다. SLB 형성 완충액으로 각 챔버를 세척하고 끝에 100 마이크로 리터의 완충액을 남깁니다.영구 마커로 완충액의 수준을 100 마이크로 리터로 표시 한 다음 챔버에 0.1 몰 염화칼슘 2 마이크로 리터를 추가 한 다음 각 챔버에 8 마이크로 리터의 SUV 용액을 넣고 섭씨 25도에서 15 분 동안 배양합니다. 50 마이크로 리터의 SLB 형성 버퍼를 제거하고 샘플 챔버에 50 마이크로 리터 만 남겨 둔 다음 100 마이크로 리터의 XKMEH를 챔버에 추가하고 부드럽게 혼합합니다. 바닥에 닿지 않고 100 마이크로 리터의 버퍼를 제거하십시오.100 마이크로 리터의 XKMEH를 추가하고 100 마이크로 리터를 제거하여 세척을 8-10 회 반복하십시오. 10 마이크로 리터의 밀리리터 베타 카제인 당 1 밀리그램을 이중층에 넣고 부드럽게 섞은 다음 실온에서 5-10 분 동안 배양합니다. 하나의 XKMEH로 베타 카제인을 세 번 씻어 내고 완충액 수준을 100 마이크로 리터 표시로 되돌립니다.베타 카제인 배양 중에 섭씨 영하 80도에서 37도에서 빠르게 해동 된 멤브레인 액틴 링커 단백질의 분취액을 꺼내 얼음 위에 보관하십시오. 분취량을 단백질 희석 완충액으로 1 마이크로몰 농도로 희석한다. 링커 단백질을 정의된 최종 농도로 용액에 첨가하고 부드럽게 혼합합니다.실온에서 30 내지 40분 동안 배양하고, 하나의 XKMEH 완충액으로 3 내지 5회 세척하여 결합되지 않은 HSE 단백질을 제거하였다. 각 챔버의 완충액 수준을 100 마이크로 리터 표시로 되돌립니다. 이제 샘플을 이미징할 준비가 되었습니다.현미경, 여기 레이저 및 감지 카메라를 켭니다. 레이저가 정렬되고 대물렌즈가 청소되었으며 소프트웨어가 이미지를 획득할 준비가 되었는지 확인합니다. 100배 대물렌즈에 오일을 바르고 샘플을 현미경 스테이지에 장착하고 대물렌즈를 이중층에 초점을 맞춥니다.레이저 위치가 샘플에 대한 전체 내부 반사를 받도록 하십시오. 488 나노 미터 여기를 사용하십시오. 이중층의 무결성을 결정하려면 이중층에서 관심 영역을 선택하고 5 대 1 이상의 신호 대 잡음비를 제공하는 이미징 조건을 사용하여 시야의 몇 가지 이미지를 기록하여 빠른 FRAP 분석을 수행합니다.기록을 일시 중지하고 TIRF 현미경의 필드 다이어프램을 닫아 이중층의 작은 원형 영역에 집중된 레이저 빔을 집중시켜 형광단을 국부적으로 표백합니다. 레이저를 최대 출력으로 켜서 작은 영역을 3-10 초 동안 포토 블리치 한 다음 레이저를 끕니다. 필드 다이어프램을 원래 반경으로 다시 열고 이미징 조건을 사전 표백제 설정으로 다시 조정한 다음 즉시 시야에서 형광 신호 복구 기록을 다시 시작합니다.이중층이 유동적인지 확인하고 이미지를 16비트 도트 TIF 파일로 저장합니다. 표지되지 않은 G- 액틴과 형광 표지 된 G- 액틴을 10 대 1 몰비로 혼합하고 G- 액틴의 농도가 20 마이크로 몰이되도록 G- 버퍼로 채 웁니다. 1회 용액에 대해 ME 완충액 10분의 1을 혼합물에 첨가하고, 실온에서 2분 동안 배양한다.다음으로, 캡핑 단백질 스톡의 바이알을 섭씨 37도에서 빠르게 해동한 다음 얼음 위에 보관합니다. 캡핑 단백질의 농도가 이제 원하는 최종 농도의 두 배가 되도록 G-완충액으로 희석한 다음 동일한 부피의 희석된 캡핑 단백질 용액을 액틴 혼합물에 추가합니다. 마지막으로, 동일한 부피의 신선한 2배 표적 완충액을 반응 혼합물에 첨가한다.용액의 최종 부피는 액틴 혼합물의 부피의 4 배가되어야합니다. 구성 요소의 최종 농도가 텍스트 원고에 설명된 대로인지 확인하십시오. 중합을 허용하기 위해 섭씨 25도의 어두운 곳에서 45 내지 60분 동안 샘플을 인큐베이션한다.끝이 뭉툭한 피펫 팁으로 5개의 마이크로몰 중합 액틴을 부드럽게 피펫팅하고 깨끗한 오토클레이브 PCR 튜브에 추가합니다. 튜브에 XKMEH 하나를 추가하여 최종 부피를 20 마이크로 리터 이상으로 만들고 F- 액틴을 전단하지 않도록 부드럽게 혼합하십시오. 장착된 샘플 챔버에서 동일한 부피의 버퍼를 제거합니다.중합 된 액틴 용액을 챔버에 넣고 바닥의 이중층을 건드리지 않고 부드럽게 위아래로 세 번 피펫팅합니다. 샘플을 TIRF 현미경에 장착하고 20-30분 동안 그대로 두십시오. F-actin 첨가가 정상 상태에 도달한 후 다른 시야에서 몇 개의 이미지를 기록합니다.액틴 배양 30분 후 샘플을 현미경에 다시 장착합니다. 링커 단백질과 F- 액틴 채널의 신호를 확인하십시오. 필요한 경우 이미징 조건을 조정합니다.긴 타임랩스 녹화에 적합한 영역을 선택합니다. 미오신 첨가 전에 0.1 - 0.2 헤르츠에서 10 내지 15 프레임을 기록하고 녹화를 일시 정지한다. 뭉툭한 피펫 팁으로 스톡 바이알에서 필요한 양의 재생 근육 미오신 2개를 피펫팅하고 깨끗한 오토클레이브 PCR 튜브에 추가합니다.즉시 하나의 XKMEH를 튜브에 추가하여 부피를 20 마이크로 리터 이상으로 만들고 부드럽게 혼합하십시오. 장착 된 샘플 챔버에서 동일한 부피의 KMEH 버퍼를 방해하지 않고 조심스럽게 제거하고 미오신 용액을 샘플 챔버에 부드럽게 추가합니다. 피펫팅은 표면 결합 필라멘트를 방해하므로 위아래로 피펫팅하지 마십시오.즉시 타임랩스 녹화를 다시 시작하고 모든 이미지를 저장한 다음 버퍼 전용 샘플을 사용하여 모든 채널의 배경 이미지를 촬영합니다. 모든 이미지를 TIF 파일로 저장합니다. 확산 계수의 적합치는 초당 1.34 평방 마이크로 미터였으며, 이는 초당 1.39 평방 마이크로 미터의 공식 기반 계산 값과 거의 일치했습니다.광퇴색 후의 선 프로파일과 표백 영역의 회복 프로파일은 각각 방정식 4 및 5에 적합하다. 표백된 개체군이 다시 회복되는 분율을 나타내는 지질 이중층의 이동 분율은 0.9보다 컸으며, 이는 양호한 지질 이중층을 나타냅니다. 미오신 활동은 정상 상태에서 아스트로와 유사한 구조로 출현하는 수축성 액토미오신 흐름을 유도하여 결합된 막 구성 요소의 국소 클러스터링을 유도했습니다.간섭계 산란 현미경과 같은 다양한 현미경 기술을 사용하여 광 손상을 유발하지 않고 라벨링되지 않은 액토미오신 네트워크의 역학을 연구하거나 초고해상도 형광 현미경을 사용할 수 있습니다. 이 기술은 막 단백질 복합체가 동적 액토미오신 네트워크와 상호 작용하여 구조와 구성을 조절하는 방법을 이해하는 데 관심이 있는 연구자들에게 길을 열어줍니다.

reconstitution-membrane-tethered-minimal-actin-cortices-on-supported

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

원자력 현미경 및 힘 분광법을 사용하여 지원되는 지질 이중층의 준비 및 특성화를 위한 프로토콜을 설명합니다.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

여기, 우리는 단일 분자 감도와 ~ 15 밀리 초 시간 해상도와 편광 TIRFM를 사용하여 리포좀과 미세 유체 채널에 지원 이중층 사이에 하나의 SNARE 매개 융합 이벤트를 감지하는 프로토콜을 제시한다. 지질 용해성화물 분리를 동시에 검출 할 수있다. 리포좀의 크기, 지질 확산과 융합 기공 특성을 측정한다.

편광 TIRF 현미경에 의해 감시 미세 유동 흐름 전지에 닿는 지원 이중층 단일 테오의 SNARE 매개 퓨전

이 논문은 지질-근위 환경에서 다양한 파트너 인자와 함께 in vitro에서 일체형 막 단백질의 상호 작용 및 어셈블리를 평가하는 방법을 설명합니다.

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우리 제공 프로토콜 시험관에 마음과 나의 자기 조직 분석 오픈 챔버에 지원된 지질 bilayer에. 또한, 우리는 vivo에서 조건 반응 감 금에 의해 모방 PDMS microcompartments 지질 입은에 분석 결과 포함 하는 방법을 설명 합니다.

생체 외에서 자가 지원된 지질 Bilayers에 단백질 패턴 구성의 재구성

미토콘드리아 융합은 미토콘드리아 역학의 근본적인 중요한 정동성 반응입니다. 여기에 설명된 시험관 내 재통합 시스템은 막 테더링, 도킹, 혈전 및 모공 개방을 해결할 수 있는 미토콘드리아 내막 융합을 연구한다. 세포막 시스템을 탐구하는 이 접근의 다양성은 토론됩니다.

미토콘드리아 멤브레인 역학 을 재구성하기위한 모델 멤브레인 플랫폼

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분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

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거대한 Unilamellar 소포 안에 재구성 된 세포 골격의 신속한 캡슐화

이 원고에서는 F-actin 세포 골격을 거대한 unilamellar 지질 소포 (리포솜이라고도 함)로 캡슐화하는 실험 기술과 리포솜 막의 내부 전단지에 피질 생모방 F- 액틴 층을 형성하는 방법을 보여줍니다.

체외 거대한 Unilamellar 소포 내부의 Actin Cytoskeleton 재구성

이 프로토콜은 시험관내 총 내부 형광 (TIRF) 현미경 분석을 사용하여 동적 액틴 및 미세 소관을 시각화하기위한 가이드입니다.

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무세포 재구성은 세포 골격 어셈블리를 이해하는 핵심 도구였으며, 지난 십 년 동안의 연구는 최소한의 시스템에서 셉틴 역학을 연구하는 접근법을 확립했습니다. 여기에 제시된 것은 서로 다른 막 맥락에서 셉틴 어셈블리를 관찰하는 세 가지 보완적인 방법입니다 : 평면 이중층, 구형 지지대 및 막대 지지대.

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여기에서는 정제된 단백질로부터 준2차원(2D) 얽힘, 가교 및 액정 액틴 어셈블리를 준비하는 방법을 제시합니다.

Tuning the Contractility and Deformation Modes of Active Actin-Based Assemblies In Vitro: From Two-Dimensional Active Networks to Liquid Crystal Drops (시험관 내 활성 활성 어셈블리의 수축성 및 변형 모드 조정: 2차원 활성 네트워크에서 액정 방울까지)

배우세요 지지된 지질 이중층에 막으로 묶인 액틴-미오신 네트워크를 조립하여 고급 형광 현미경으로 역학을 연구하는 방법을. 이 프로토콜은 세포골격 단백질을 순차적으로 첨가할 수 있어 다양한 세포생물학 연구에 활용 가능합니다.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

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