Name: 치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 유동 세포 측정 기반 다중 형광 노화 마커 이미징 방법을 활용하여 치료 유도 노인성 암 세포에서 단일 세포 수준의 공간 분포와 형광 신호 정량 분석을 수행하는 기술입니다.

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이 작품은 Johannes Kepler University Linz (BERM16108001)의 Yong Yu에 대한 보조금으로 지원되었습니다.

1. 세포 노화를 유도하기 위해 마포스파미드 또는 다우노루비신 처리를 이용한 DLBCL 세포주
참고: 이 프로토콜은 부착성 암세포에도 적용됩니다. 세포 크기에 따라, 시드 1-2 × 10개의 5개 세포를 6-웰 플레이트의 하나의 웰에 넣고 플레이트를5 %CO2, 37°C 인큐베이터에서 밤새 처리 전에 인큐베이션한다. 프로토콜 단계는 서스펜션 셀과 동일하지만 두 가지 예외가 있습니다. 먼저, 세포는 단계 3.4 후에 플레이트 밖으로 트립신화될 필요가 있다. 둘째, 세척 단계는 트립신화 전에 원심분리 없이 수행된다.
<ol><li>DLBCL 세포를 계수하고 1 × 10 6 세포/mL를 웰당 배지 4 mL에 넣고6 -웰 배양 플레이트에 넣는다. DLBCL 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)과 100 U/mL 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지에서 배양하십시오.</li>
	<li>MAF (5 μg / mL) 또는 DN (20 ng / mL)을 세포 배양물에 넣고 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하십시오. 참고: MAF 및 DN은 안정적이지 않습니다. DMSO에 용해시킨 후, 원액을 분취하여 -20°C에서 보관해야 한다. 동결 / 해동 사이클은 피해야합니다.</li>
	<li>플레이트를 3일 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>3일간 배양한 후, DLBCL 세포를 15 mL 멸균 원심분리 튜브에 수집하고, 100 × g, 4°C에서 5분 동안 스핀시켰다.</li>
	<li>상청액을 버리고, 세포 펠릿을 4 mL의 신선한 배지로 재현탁시키고, 현탁액을 다시 6-웰 플레이트에 첨가한다.</li>
	<li>세포 플레이트를 분석을 위해 수확하기 전에 또 다른 2일 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 배양한다.</li>
</ol>2. 염색용 용액 준비(표 1)
3. 다른 노화 마커를 갖는 염색 DLBCL 세포
참고: 개별 마커(즉, 퍼시픽 블루-EdU,C12FDG 또는 알렉사 플루오르 647-γH2AX)로 염색된 세포 샘플은 측정 동안 형광 유출을 보정하기 위해 보상 매트릭스를 생성하도록 준비된다. 고도로 제안되었지만, 이 단계는 상이한 형광단들 사이에서 방출 스펙트럼들의 생략가능한 중첩(보상 계수 값 ≤ 0.1)이 있을 때 현탁될 수 있다. 그러나 사용자는 다른 기기와 형광 패널을 사용할 때 표준화 된 보상 단계를 결정해야합니다.
<ol><li>1:1,000의 비율로 10 mM EdU 용액을 단계 1.6에서 생성된 DLBCL 세포 배양물에 첨가한다(최종 EdU 농도는 10 μM이다). 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하고 3시간 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 100 mM 클로로퀸 용액을 최종 농도 75 μM로 첨가한다 (논의 참조). 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하고 30분 동안 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 20 mMC12FDG 용액을 1:1,000에서 20 μM의 최종 C12FDG 농도에 첨가한다. 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합하고 5%CO2, 37°C 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다.</li>
	<li>플레이트를 인큐베이터에서 꺼내어 1:50에 100 mM 2-페닐에틸-β-D-티오갈락토시드(PETG) 용액을 첨가하여 fSA-β-gal 염색을 중단시켰다(최종 PETG 농도 2 mM). 플레이트를 부드럽게 돌려 혼합합니다.</li>
	<li>세포를 15 mL 멸균 원심분리 튜브로 옮기고 100 × g, 4°C에서 5분 동안 스핀한다. 상청액을 버리고 세포를 4 mL의 인산완충식염수(PBS)로 세척한다.</li>
	<li>PBS 세척 단계를 반복한다. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 500 μL의 4% 파라포름알데히드 고정 용액에 재현탁시킨다.</li>
	<li>실온에서 10분 인큐베이션한 후, 250 × g, 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 상청액을 버리고 세포를 PBS 4 mL로 세척한다.</li>
	<li>PBS 세척 단계를 반복한다. 상청액을 버리고, 세포 펠릿을 200 μL의 사포닌 투과화 완충액에 재현탁시키고, 현탁액을 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다. 실온에서 10분 인큐베이션한 후, 250 × g, 실온에서 5분 동안 원심분리한다.</li>
	<li>상청액을 버리고 세포 펠렛을 200 μL의 일차 항체 용액 (항체 인큐베이션 용액 중 1:500 γH2AX 항체)에 재현탁시킨다. 어둠 속에서 하룻밤 동안 4°C에서 인큐베이션한다.</li>
	<li>튜브를 250 × g, 4°C에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 100 μL의 사포닌 세척 용액으로 세척한다.</li>
	<li>세척 단계를 추가로 두 번 반복하십시오. 상청액을 버리고 세포 펠릿을 500 μL의 EdU 검출 칵테일에 재현탁시킨다.</li>
	<li>어둠 속에서 30분 동안 실온에서 인큐베이션한다. 250 × g, 실온에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 버리고 사포닌 세척액 1mL로 세척한다.</li>
	<li>세척 단계를 두 번 반복하십시오. 상청액을 버리고 세포 펠렛을 PBS의 20-50 μL에 재현탁시킨다. 샘플 측정을 위해 섹션 4로 진행하십시오.</li>
</ol>4. 이미징 유세포 분석기 시스템을 사용하여 노화 마커 이미징
<ol><li>폐액 병을 비우십시오. 장비를 켜기 전에 충분한 유체를 확보하기 위해 속도 비드, 멸균기, 클리너, 디버블러, 시스 및 헹굼 시약 (탈 이온수)의 수준을 확인하십시오 ( 재료 표 참조).</li>
	<li>계측기 및 이미징 소프트웨어를 켭니다( 그림 1A의 소프트웨어 인터페이스 참조).</li>
	<li>시작 버튼을 클릭하여 유체 공학 및 시스템 교정을 초기화합니다. 참고: 이 절차는 약 45분 정도 걸립니다.</li>
	<li>배율을 40x로 설정하고 유체 속도를 낮게 설정한 다음 실험에 필요한 레이저를 켭니다. 405nm, 488nm 및 642nm 레이저를 켜서 EdU-pacific blue,C12FDG 및 Alexa Fluor 647-γH2AX(또는 Alexa Fluor 647-Ki67)를 각각 측정합니다. 분산형 채널에는 Ch6을, 브라이트필드에는 Ch1과 Ch9를 설정합니다.</li>
	<li>레이저의 강도를 설정하기 위해 가장 높은 형광을 가질 것으로 예상되는 샘플부터 시작하십시오. 샘플 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다. 튜브 뚜껑을 열고 샘플 튜브를 도크에 삽입합니다. 로드 를 클릭하여 시작하십시오.</li>
	<li>산점도를 열고 X축과 Y축에 대해 각각 Area_M01 피쳐와 종횡비 Ratio_M01을 선택합니다. 게이트를 종횡비 0.5 이상으로 설정하여 아래와 오른쪽의 더블릿 및 셀 응집체를 제외하고, 왼쪽에는 스피드 비드 모집단을 제외합니다(그림 1B).</li>
	<li>히스토그램 플롯을 열고 X축에 대한 그라디언트 RMS_M01_Ch01 피쳐를 선택합니다. 일중항 모집단을 선택하고 집중된 셀을 선택할 게이트를 설정합니다(그림 1C). 주: 이미징 시스템은 자동으로 스피드 비드를 사용하여 이미징을 위한 초점을 조정합니다. 그러나 가장 집중된 모집단에 대해 히스토그램 피크의 오른쪽 절반을 선택하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>히스토그램 플롯을 열고 각 색상 채널(Ch2, 7 및 11)에 대해 X축에 대해 원시 최대 픽셀 강도를 선택합니다. 레이저 파워(즉, Ch2, 7 및 11의 경우 각각 488nm, 405nm 및 642nm 레이저)를 조정하여 과포화를 피하기 위해 각 형광색이 100에서 4,000 사이의 원시 최대 픽셀 값을 갖도록 합니다. 참고: 이 실험에서 레이저 전력 설정은 레이저 488nm, 405nm 및 642nm의 경우 각각 50mW, 200mW 및 50mW입니다.</li>
	<li>기록할 집중 모집단을 선택하고 획득 을 클릭하여 일관된 설정으로 DLBCL 샘플을 측정합니다. 측정을 위해 샘플을 변경할 때 반환 을 클릭하여 샘플 튜브를 복구하십시오. 로드 를 눌러 샘플을 삭제 합니다.</li>
	<li>모든 샘플이 측정 된 후 밝은 필드와 산란 레이저를 끕니다. 단색 제어 샘플을 측정하여 보정 매트릭스를 생성합니다.</li>
	<li>종료를 클릭하여 이미징 시스템을 닫습니다.</li>
	<li>이미지 분석 소프트웨어의 데이터를 분석합니다.<ol><li>이미지 분석 소프트웨어의 스팟 마법사 도구를 사용하여 라이브 셀 이미지에서 핵 γH2AX 초점을 자동으로 계산하고 정량화할 수 있습니다. 두 개의 세포 집단(하나는 높은 세포와 낮은 반점 카운트)을 선택하여 추가 자동 스팟 카운트 분석을 위해 스팟 마법사를 훈련시킵니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Rossi, M., Abdelmohsen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+senescent+surface+biomarkers+as+senotherapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The emergence of senescent surface biomarkers as senotherapeutic targets.</a> Cells. 10 (7), 1740(2021).</li>
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</ol>

저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.

이 방법은 화학 요법 치료시 네 개의 다른 DLBCL 세포주의 노화 진입 능력을 밝은 필드 이미징 및 유세포 측정 기반 정량화로 조사했습니다. 단일 세포 수준에서, 우리는 처리 된 KARPAS422 및 WSU-DLCL2 세포에서 주요C12 FDG + EdU-Ki67 + 노인성 집단을 성공적으로 검출했으며, OCI-LY1 세포에서는 SU-DHL6 세포주가 치료에 내성을 갖는 반면, OCI-LY1 세포에서는 더 적은 정도까지 성공적으로 검출했습니다. 세포주 사이의 노화 진입 능력의 차이는 그들의 뚜렷한 게놈 결함16,17에 의해 설명될 수 있다. 그러나, 부적절한 세포 배양 밀도 또는 약물 농도는 또한 노화 유도성에 영향을 미칠 수 있다. 세포 밀도 및 약물 농도의 연속 희석은보다 포괄적 인 검사를 위해 신중하게 선택해야합니다. 주목할 만하게, 이 방...

다양한 자극은 세포 노화를 유발하여 세포가 안정된 세포 주기 정지 상태로 진입하게 할 수 있습니다. 이러한 자극에는 내재적 신호 변화 또는 외적 스트레스가 포함됩니다. 내재적 신호에는 진행성 텔로미어 단축, 텔로미어 구조의 변화, 후성유전학적 변형, 프로테오스타시스 장애, 미토콘드리아 기능장애, 종양유전자의 활성화가 포함된다. 외인성 스트레스에는 염증 및/또는 조직 손상 신호, 방사선 또는 화학적 치료, 영양 결핍 1,2,3,4가 포함됩니다. 뚜렷한 유형의 노화 중에서 가장 일반적으로 볼 수 있고 잘 연구 된 것은 복제 노화, 종양 유전자 유도 노화 (OIS), 방사선 유도 노화 및 치료 유도 노화 (TIS)입니다. OIS는 비정상적인 종양유전자 활성화에 의해 생성된 복제 스트레스에 의해 야기되는 유전독성 손상에 대한 급성 세포 반응이며, 신생물성 병변으로부터 본격적인 종양으로의 병리학적 진행을 어느 정도 예방할 수 있다. TIS는 종양 세포가 화학 요법 약물 또는 이온화 방사선 5,6에 의해 스트레스를 받을 때 발생합니다.
노화는 매우 역동적 인 특성으로 인해 병리학에서 양날의 검으로 간주됩니다. 처음에는 분열 세포의 순환 풀에서 손상된 세포를 제거하고 장기의 정상적인 기능을 보호하고 종양 성장 7,8,9을 억제하는 유익한 종양 억제 메커니즘으로 설명되었습니다. 그러나 새로운 증거는 노화의 어두운면을 시사했다. 노화 세포는 노화 관련 분비 표현형(SASP)으로 알려진 전염증성 사이토카인을 분비하여, 섬유증 및 기능성 기관을 유도하고 종양 개시 및 진행을 촉진한다(10). 더욱이, 노년기 암세포는 후성유전학적 및 유전자-발현 리프로그래밍을 통해 크로마틴 리모델링 및 지속적인 DNA-손상 반응(DDR)11,12의 활성화와 병행하여, 새로운 암-줄기-세포 특성을 새롭게 획득한다3. 노화가 가능한 종양은 노화가 불가능한 종양(13)에 비해 치료 개입에 더 잘 반응하지만, 노화 세포의 지속성은 혈청용해제에 의해 효과적으로 확인되고 제거되지 않으면 장기간 예후가 좋지 않을 수 있다5. 어느 쪽이든, 노화를 평가하는 신뢰할 수있는 방법은 치료 치료의 예후뿐만 아니라 노인 세포를 목표로하는 새로운 전략 개발에도 중요한 임상 적 관심사입니다.
다른 트리거에 관계없이, 노화 세포는 큰 액포를 갖는 확대, 평탄화, 다핵 형태학, 상당히 확장된 핵, 핵에서 H3K9me3 풍부 노화 관련 헤테로크로마틴(SAHF)의 형성, DNA 손상 마커 γH2AX 초점의 지속적인 축적, 활성화된 p53-p21CIP1 및 Rb-p16INK4a 등 몇 가지 공통된 특징을 나타낸다. 세포 주기 조절 메카니즘, 안정한 G1 세포 주기 정지, SASP의 대규모 유도, 및 상승된 노화-관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal) 활성14. 노화를 정의하기에 충분한 단일 마커가 없기 때문에, 노화 검출의 황금 표준으로 간주되는 SA-β-gal 활성에 대한 효소 염색은 일반적으로 TIS15를 검출하기 위해 H3K9me3 및 Ki67에 대한 면역 조직화학 염색과 결합됩니다. 그러나, 화학적 염색체-기반 SA-β-gal은 정량화하기가 어렵다. 여기에서는 5-도데카노일아미노플루오레세인 디-β-D-갈락토피라노사이드(C12 FDG) 형광 기반 SA-β-gal(fSA-β-gal) 검출을 γH2AX 및 EdU 혼입 DNA에 대한 면역형광 염색과 결합하여 속도, 감도 및 상세한 단일 세포 이미지를 유세포 분석기 및 현미경으로 제공할 수 없는 공간 정보와 결합한 고급 이미징 유세포 분석기 시스템을 사용하여C12FDG+EdU-γH2AX+ 노인 세포를 확인했습니다. 이 방법을 사용하면 고해상도 이미지를 신속하게 생성할 수 있으므로 세포 내에서 형광 신호를 배치하고 정량화할 수 있으며, 표준 파이프라인을 구축하여 여러 샘플을 신속하게 분석할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) 항체</td><td>Biolegend</td><td>613407</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal 항체 (Alexa Fluor 647)</td><td>Biolegend</td><td>350509</td><td></td></tr><tr><td>C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-&beta;-D-Galactopyranoside)</td><td>Fisher Scientific</td><td>11590276</td><td></td></tr><tr><td>Chloroquin -diphosphat</td><td>Sigma aldrich</td><td>C6628</td><td></td></tr><tr><td>클렌저 (Coulter Clenz)</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit</td><td>Thermo Scientific</td><td>C10418</td><td></td></tr><tr><td>Daunorubicin</td><td>Medchemexpress</td><td>HY-13062A</td><td></td></tr><tr><td>Debubbler (70% Isopropanol)</td><td>Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어 (Amnis&nbsp; 아이디어&nbsp; 6.3)</td><td>Luminex</td><td>CN-SW69-12</td><td></td></tr><tr><td>기기 및 이미징 소프트웨어 (Amnis&nbsp; 이미지스트림X&nbsp; Mk II 이미징 유세포 분석기 시스템 및 INSPIRE 소프트웨어)</td> <td>Luminex</td><td>100220</td><td></td></tr><tr><td>KARPAS</td><td>DSMZ</td><td>ACC 31</td><td></td></tr><tr><td>mafosfamide cyclohexylamine</td><td>Niomech</td><td>D-17272</td><td></td></tr><tr><td>OCI-LY1</td><td>DSMZ</td><td>ACC 722</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Fisher Scientific</td><td>11473704</td><td></td></tr><tr><td>PETG (2-Phenylethyl-&beta; -D-thiogalactosid)&nbsp;</td><td>시그마 알드리치</td><td>P4902</td><td></td></tr><tr><td>사포닌</td><td>시그마 알드리치</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>칼집</td><td>밀리포어</td><td>BSS-1006-B</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream</td><td>용 SpeedBead 키트 Luminex</td><td>400041</td><td></td></tr><tr><td>살균기 (0.4-0.7% 차아염소산염)</td><td></td><td>VWR JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>SU-DHL6</td><td>DSMZ</td><td>ACC 572</td><td></td></tr><tr><td>WSU-DLCL2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 575</td><td></td></tr></tbody></table>

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

Simultaneous Imaging and Flow-Cytometry-based Detection of Multiple Fluorescent Senescence Markers in Therapy-Induced Senescent Cancer Cells

화학 요법 약물은 암세포에서 돌이킬 수없는 DNA 손상을 유도하여 아폽토시스 또는 조기 노화를 유발할 수 있습니다. 세포사멸 세포 사멸과는 달리, 노화는 암세포의 번식을 억제하는 근본적으로 다른 기계이다. 수십 년간의 과학적 연구는 암세포와 기질 세포를 조절하는 종양 및 미세 환경에서 노인성 암 세포의 복잡한 병리학 적 효과를 밝혀 냈습니다. 새로운 증거는 노화가 암 치료 중 강력한 예후 인자이므로 암 샘플에서 노화 세포의 신속하고 정확한 검출이 필수적임을 시사합니다. 이 논문은 암세포에서 치료 유도 노화 (TIS)를 시각화하고 검출하는 방법을 제시합니다. 미만성 거대 B 세포 림프종 (DLBCL) 세포주를 마포스파미드 (MAF) 또는 다우노루비신 (DN)으로 처리하고, 노화 마커, 노화-관련 β-갈락토시다제 (SA-β-gal), DNA 합성 마커 5-에티닐-2'-데옥시우리딘 (EdU), 및 DNA 손상 마커 감마-H2AX (γH2AX)에 대해 조사하였다. 유세포 분석기 이미징은 단기간에 고해상도 단일 세포 이미지를 생성하여 암세포의 세 가지 마커를 동시에 시각화하고 정량화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

보상 매트릭스는 단색 제어 샘플의 기록된 데이터를 로딩하여 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 생성되었다. 보충 그림 S1에 나타난 바와 같이, EdU에서 C12 FDG로의 무시할 수 없는(계수 값 ≥0.1) 광 유출은 누화 계수 값 0.248로 검출된 반면, 다른 채널들 사이의 누화는 유의하지 않았다. 네 개의 상이한 DLBCL 세포주를 5 μg/mL MAF 또는 20 ng/mL DN로 처리하여 세포 노화를 유도하고 기존의 SA-β-gal 염색 또는 이미징 유세포 분석기 방법을 사용하여 분석하였다.
KARPAS422, WSU-DLCL2 및 OCI-LY1 세포의 70% 이상이 SA-β-gal 양성으로 나타나는 노화 상태에 들어간 반면, SU-DHL6은 MAF 및 DN에 의한 노화 유도에 완전히 내성을 보였다(보충 그림 S2A). 주목할 만하게, MAF 및 DN은 또한 극적으로 비록 아니지만 모든 DLB...

여기서 우리는 단일 세포에서 다중 노화 관련 마커의 시각화 및 정량화를 위한 유세포 측정 기반 방법을 제시한다.

Chemotherapeutic drugs can induce irreparable DNA damage in cancer cells, leading to apoptosis or premature senescence. Unlike apoptotic cell death, ...

이 방법은 고해상도 이미지를 신속하게 생성하여 세포 내 형광 신호의 공간 분포 및 정량화를 분석하는 동시에 여러 샘플을 신속하게 분석할 수 있습니다. 세포는 고급 이미징 유세포 분석 시스템을 사용하여 측정되며, 속도, 감도 및 상세한 단일 세포 이미지를 공간 정보와 결합하여 흐름 검안 또는 현미경으로는 제공할 수 없는 고유한 데이터를 생성합니다. 한 가지 중요한 조언은 기기 설정을 설정하기에 충분한 셀을 제공하고 측정을 위해 셀을 고밀도로 현탁하는 것입니다.이 외에도 데이터 수집은 간단하고 기존의 유세포 분석과 유사합니다. 먼저 원고에 기재된 대로 DLBCL 세포주를 생성한다. 그런 다음 DLBCL 세포 배양액에 1에서 1000의 비율로 10 밀리몰 EdU 용액을 추가하고 플레이트를 부드럽게 흔들어 혼합 한 후 섭씨 37 도의 5 % 이산화탄소 인큐베이터에서 3 시간 동안 플레이트를 배양합니다.배양 후 플레이트를 꺼내고 최종 농도 75 마이크로 몰이 되도록 클로로퀸 용액 100밀리몰을 추가합니다. 부드럽게 흔들어 혼합하고 30 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 20 밀리몰 C12 FDG 용액을 최종 농도 20 마이크로 몰에 첨가하십시오.부드럽게 혼합한 후, 이전에 설명된 대로 플레이트를 1시간 동안 배양합니다. 다음으로, 100 밀리몰 2-페닐에틸-베타-d-티오갈락토시드 용액을 1 내지 50에 첨가하여 FSA 베타-갈 염색을 중지시킨다. 그리고 플레이트를 부드럽게 돌려 혼합합니다.세포를 15 밀리리터 멸균 원심 분리기 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 5 분 동안 100 회 G로 회전시킵니다. 상청액이 버려지면 세포를 4 밀리리터의 PBS로 세척하고 섭씨 4도에서 5 분 동안 100 배 G로 원심 분리합니다. 그런 다음 4% 파라포름알데히드 고정 용액에서 500마이크로리터에 세포 펠릿을 다시 현탁합니다.실온에서 10분간 배양한 후, 실온에서 5분 동안 250회 G로 원심분리하였다. 상층액을 버리고 세포를 PBS 4 밀리리터로 2회 세척하고 실온에서 5분 동안 G 100배로 원심분리한다. 세척 후, 상청액을 버리고 세포 펠렛을 200 마이크로리터의 사포닌 투과화 완충액에 재현탁시킨다.이제 현탁액을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 실온에서 10 분 동안 배양하십시오. 세포를 실온에서 5분 동안 250배 G로 펠렛화한다. 그런 다음 세포를 200 마이크로리터의 1차 항체 용액에 재현탁시키고 암실에서 밤새 섭씨 4도에서 배양합니다.튜브를 섭씨 4도에서 5분 동안 250배 G로 원심분리합니다. 상청액을 버리고 100 마이크로리터의 사포닌 세척액으로 세척한다. 세포를 2회 세척한 후, 상청액을 버리고 세포 펠릿을 500 마이크로리터의 EdU 검출 칵테일에 재현탁시킨다.어두운 곳에서 30분 동안 실온에서 배양하고 실온에서 5분 동안 250배 G에서 원심분리합니다. 상청액을 버리고 1 밀리리터의 사포닌 세척 용액으로 세척하십시오. 세척을 2회 반복하고, 상청액을 버리고 세포 펠렛을 20 내지 50 마이크로리터의 PBS에 재현탁시킨다.기기를 켜기 전에 폐액 병을 비우고 SpeedBeads, 살균기, 클리너, 디버블러 및 피복 충분한 유체의 수준을 확인하십시오. 기기 및 이미징 소프트웨어를 켠 후 시작 버튼을 클릭하여 유체 공학 및 시스템 교정을 초기화합니다. 배율을 40배로 설정하고 유체 속도를 낮음으로 설정합니다.레이저를 켠 후 405나노미터 레이저를 켜서 EdU Pacific Blue를 측정하고 488나노미터를 켜서 C12-FDG를 측정하고 642나노미터를 켜서 Alexa-Fluor-647-gamma-H2AX를 측정합니다. 산란 채널에 채널 6, 명시야에 채널 1, 채널 9를 설정합니다. 그런 다음 형광이 가장 높을 것으로 예상되는 샘플로 시작하여 레이저의 강도를 설정하고 샘플 튜브를 부드럽게 뒤집어 혼합합니다.튜브 뚜껑을 연 후 샘플 튜브를 도크에 삽입합니다. 로드를 클릭하여 산점도를 시작하고 엽니다. 그런 다음 기능 영역을 선택하고 X 및 Y 축에 대해 MO1 및 종횡비 밑줄 MO1을 각각 선택합니다.게이트의 가로 세로 비율을 0.5로 설정하여 아래와 오른쪽의 더블릿과 셀 응집체와 왼쪽의 SpeedBead 모집단을 제외합니다. 이제 히스토그램 플롯을 열고 마스크 1의 특징 기울기 평균 제곱근을 선택하고 X축에 대해 채널 1을 선택합니다. 단일항 모집단을 선택하고 집중된 셀을 선택할 게이트를 설정합니다.히스토그램 플롯을 열고 X축 채널 2, 7, 11에 대한 원시 최대 픽셀 강도를 선택합니다. 그런 다음 채널 2, 7 및 11에 대해 각각 488 나노 미터, 405 나노 미터 및 642 나노 미터 레이저의 레이저 출력을 조정하여 각 형광 색소가 과포화를 피하기 위해 100에서 4, 000 사이의 원시 최대 픽셀 값을 갖도록합니다. 기록할 포커스 모집단을 선택하고 획득을 클릭하여 일관된 설정으로 DLBCL 샘플을 측정합니다.측정을 위해 샘플을 변경할 때 리턴을 클릭하여 샘플 튜브를 복구합니다. 로드를 눌러 샘플을 삭제합니다. 모든 샘플을 측정 한 후 명시야를 끄고 레이저를 산란시킵니다.단색 대조 샘플을 측정하여 보정 매트릭스를 생성합니다. 종료를 클릭하여 이미징 시스템을 닫습니다. 이미지 분석 소프트웨어에서 데이터를 분석합니다.이미지 분석 소프트웨어의 스팟 마법사 도구를 사용하여 핵 감마 H2AX 초점 및 라이브 셀 이미지를 자동으로 계수하고 정량화할 수 있습니다. 두 개의 셀 모집단(하나는 높은 셀 개체군과 다른 하나는 낮은 스팟 카운트)을 선택하여 추가 자동 스팟 카운트 분석을 위해 스팟 마법사를 훈련시킵니다. 단일 세포 이미지에서 유세포 분석 방법은 C12-FDG 양성, EdU 음성, 감마 H2AX 양성, 노화 된 인구 및 KARPAS422가 증가한 것으로 나타났습니다.WSU-DLCL2 및 OCI-LY1 세포에서는 SU-DHL6 세포가 아닙니다. 이미징 기반 분석은 상당히 많은 수의 감마 H2AX 초점 및 KARPAS422, WSU-DLCL2 및 OCI-LY1을 나타냈지만 SU-DHL6 세포에서는 그렇지 않았습니다. 유사한 결과가 빈도 및 정량화 데이터로 표시되었습니다.세포 현탁액에 사포닌을 추가하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 항체가 세포 내부 항원에 도달할 수 없으며 강한 세제로 인해 C12-FTG 신호가 손실됩니다. 이미징 세포분석은 특정 자극에 대한 반응으로 전사 인자를 핵으로 전좌하는 것과 같은 마커 국소화의 변화를 분석하는 데 최적입니다. 이러한 분석은 당사 프로토콜로도 달성할 수 있습니다. 이 방법을 사용하면 단일 세포 수준에서 여러 형광 마커를 시각화하여 개별 신호의 존재, 강도 및 위치를 감지할 수 있습니다.

simultaneous-imaging-flow-cytometry-based-detection-multiple

Research

연구

JoVE Journal

Cancer Research

암 연구

이 비디오는 이중 노화 마커로 치료 유도 노화 암세포를 정량화하기 위한 유세포 분석 기반 분석을 보여줍니다. 노화 세포의 검출 및 정량화에는 β-갈락토시다아제 기질을 사용하는 것이 포함됩니다. 기질은 노화 세포 내에서 활성 리소좀 β-갈락토시다아제에 의해 절단되어 자가형광 리포푸신 과립과 함께 노화 암세포를 표시하는 형광 생성물을 생성합니다.

therapy-induced senescent cancer cells의 유세포 분석 기반 정량화

이 동영상은 종양 조직에 침투하는 T 세포의 다양한 하위 집단을 분석하기 위한 현장 형광 다중 스펙트럼 이미징 기술을 보여줍니다. 신세포암 조직 동결절제술은 특이적 억제 수용체를 발현하고 면역요법 내성 표현형을 나타내는 CD8+ T 세포를 표지하는 항체로 처리됩니다. 표지된 섹션은 뚜렷한 CD8+ T 세포 하위 집단을 식별하기 위해 다중 스펙트럼 현미경을 사용하여 시각화됩니다.

면역요법 내성 T 세포 하위 집단을 분석하기 위한 다중방향 면역형광 이미징

노화가 방지하거나 종양 논란이 계속 추진할지 여부를 지정합니다. chemotherapeutical 마약 senesce하는 암 세포를 유도 할 수 있기 때문에, 노화를 연구하는 새로운 치료법을 제안 필수적이다. 그러나, 표준 및 널리 사용되는 β-갈 락토시다 분석은 주요 단점을 제공합니다. 우리는 여기에서 노화를 정량화 할 수있는 신속하고 민감한 유동 세포 계측법 기반 분석을 제안한다.

노화 암 세포를 정량화하는 민감한 방법

두 가지 색상의 형광 현미경을위한 듀얼 카메라 방출 분할 시스템은 뛰어난 광학 및 시간 해상도, 병렬 플레이트 흐름 챔버 접착 분석을 포함하여 특정 살아있는 세포 분석의 요구 사항과 실시간 이미지 시퀀스를 생성합니다. 소프트웨어가 동시에 취득한 발광 채널의 이미지를 병합하기 위해 사용될 때, 모조 착색 이미지 시퀀스가​​ 생성된다.

동시에 듀얼 카메라 방출 분할 시스템을 사용하여 두 개의 배출 채널의 실시간 이미지를 캡처 : 응용 프로그램은 접착 셀에

세포 노화는 만성 연령 과 관련된 병리 발달의 핵심 요소입니다. 노화 세포를 표적으로 하는 치료제의 식별은 건강한 노화를 연장하기 위한 약속을 보여줍니다. 여기서, 우리는 단일 세포에서 의 노화 관련 β-갈락토시다아제 활성의 측정에 기초하여 senotherapeutics의 식별을 위해 스크리블하는 새로운 분석방법을 제시한다.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

우리는 마우스 두뇌 또는 척수에서 검색된 동시에 다른 세포 모형을 확인하기 위하여 교류 세포측정 방법을 제시합니다. 이 방법은 신경 퇴행성 질환에서 순수 한 세포 집단을 분리하거나 특성화하거나 바이러스 벡터 또는 나노 입자의 생체 내 투여 시 세포 표적화의 정도를 정량화하기 위해 악용 될 수 있습니다.

다른 균질화 방법을 통해 마우스 뇌 / 척수에서 검색 된 여러 세포 유형의 동시 유량 세포 측정 특성 분석

우리는 냉동 된 조직에 다중 스펙트럼 이미징을 수행하는 빠른 염색 방법을 설명합니다.

냉동 조직 섹션의 다스펙트럼 형광 이미징을위한 신속한 방법

세포 배양 또는 쥐 종양 모델에서 화학 요법 약물에 의해 유도 된 노화 암 세포의 형광, 유세포 측정 정량화를위한 프로토콜이 제시된다. 선택적 절차에는 공동 면역염색, 대규모 배치 또는 시점 분석을 용이하게 하기 위한 샘플 고정, 유세포 분석 분류에 의한 생존 가능한 노화 세포의 농축이 포함됩니다.

유세포분석을 통한 노화 종양 세포의 식별 및 농축을 위한 원적색 형광 노화 관련 β-갈락토시다아제 프로브

다중화 면역형광은 단일 조직 절편 내에서 여러 항체 표지자를 순차적으로 표지하여 조직 구조와 세포 집단의 공간 분석을 지원합니다. 여기서는 노화 관련 마커, 구조적, 면역 마커의 다중성 검출 워크플로우를 제시하는데, 여기에는 수동 및 자동 슬라이드 준비, 반복 영상, 디지털 병리 소프트웨어를 이용한 단일 세포 분석이 포함됩니다.

생체 내 노화 마커의 공간 평가를 위한 다중화 면역형광 분석법

효율적인 심사 프로토콜 astroglial 분화 세포종 줄기 세포 (GSCs)에 홍보 하는 작은 분자의 식별을 위해 제공 됩니다. 분석 결과 줄기 세포 감 별 법 기자에 의하여 향상 된 GFP (eGFP)의 식을 인간의 GFAP 발기인에 의해 구동 됩니다 기반으로 합니다.

교류 Cytometry 기반 약물 세포종 줄기 세포의 세포 분화를 촉진 하는 작은 분자의 식별에 대 한 시스템 검사

배우세요 유동 세포 측정 기반 다중 형광 노화 마커 이미징 방법을 활용하여 치료 유도 노인성 암 세포에서 단일 세포 수준의 공간 분포와 형광 신호 정량 분석을 수행하는 기술입니다.

치료 유도 노인성 암 세포에서 다중 형광 노화 마커의 동시 이미징 및 유동 세포 측정 기반 검출

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