Name: 1차 배양에서 분화된 마우스 지방세포: 인슐린 저항성 모델 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: 배우세요 마우스 1차 지방세포 분화 및 인슐린 저항성 유도 방법을. 서커타니어스 지방조직에서 전지방세포를 분리하고 TNF-α로 인슐린 저항성을 유도하여 웨스턴 블롯으로 신호전달 경로를 분석하는 실험 기법을 익힙니다.

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기술 지원을 아끼지 않은 다니엘 몬드라곤, 안토니오 프라도, 페르난도 로페스-바레라, 마르틴 가르시아-세르빈, 알레한드라 카스티야, 마리아 안토니에타 카르바호, 그리고 원고를 비판적으로 편집해 준 제시카 곤잘레스 노리스에게 감사드립니다. 이 프로토콜은 Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (YM에게)에 의해 지원되었습니다.

모든 설치류 실험은 UNAM 신경 생물학 연구소의 생명 윤리위원회 (프로토콜 번호 075)에 의해 승인되었습니다.
1. 마우스 지방세포 전구세포 분리
<ol><li>8-10주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 안락사시킵니다(예: CO2 흡입 및 후속 자궁경부 탈구에 의해)(분리당 4마리). 마우스를 70% 에탄올로 문질러 소독하고 희생 직후 지방 조직을 얻습니다. 참고: 설치류를 안락사시킨 후 즉시 지방 조직을 분리하고 멸균 층류 후드 내부의 모든 단계를 수행합니다. 생쥐는 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간의 명암주기 아래로 유지됩니다.</li>
	<li>각 마우스에서 사타구니 피하 지방 조직을 해부합니다. 근육, 피부 또는 기타 조직의 제거를 피하고 지방 조직만 제거하고 얼음 위에 15mL의 유형 1 콜라게나제 용액(1.5mg/mL)이 들어 있는 50mL 원뿔형 튜브에 수집합니다. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) 고포도당-1% 소 혈청 알부민(BSA)에 유형 1 콜라게나제를 용해하고 0.2μm 주사기 필터를 통해 여과합니다.</li>
	<li>멸균 수술용 가위로 지방 조직을 작은 조각으로 절단하고 37°C에서 30분 동안 안와 진탕기(150rpm)에서 1형 콜라게나제 용액과 함께 배양하여 샘플을 분해합니다(더 큰 진탕 표면을 위해 지방 및 콜라게나제가 포함된 튜브를 수평 위치에 놓으십시오). 10분마다 소화를 점검하여 작동하는지 확인하고(조직 분해가 보임) 과소화를 방지합니다( 보충 그림 S1 참조).</li>
	<li>200μm 메쉬 주사기(이전에는 오토클레이브)를 사용하여 여과하여 콜라게나제로 분해되지 않은 조직을 제거합니다. 필터를 튜브 가장자리에 통과시켜 가능한 한 많은 셀을 용액으로 배출합니다. 차가운 DMEM-1% BSA 15mL를 넣어 소화를 중지하고 4°C에서 10분 동안 400× g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>성숙한 지방세포 및 대부분의 액체층을 함유하는 최상층을 흡인하고; 펠릿을 만지거나 방해하지 마십시오. 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)-2% 소 태아 혈청(FBS) 20mL를 넣고 펠릿을 재현탁합니다. 400 × g 에서 4 °C에서 5 분간 원심분리한다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 먼저 상층을 흡인하여 나머지 지방 세포와 지방을 제거합니다. 펠릿을 1mL의 염화암모늄 칼륨(ACK) 용해 완충액(적혈구 용해용)에 재현탁하고 얼음에서 5분 동안 배양합니다. PBS-2% FBS 10mL를 넣고 4°C에서 5분 동안 400× g 에서 혼합하고 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 펠릿을 200μL의 항-Fc 용액(PBS-2% FBS로 희석한 정제된 쥐 항-마우스 CD16/CD32[1:150])에 재현탁하여 관심 항체에 의한 Fc 수용체 매개 결합을 감소시킵니다. 얼음에서 5분 동안 배양합니다. 세포 현탁액을 자기 세포 분리기의 예냉 랙에 맞는 5mL 튜브로 옮기고 4°C에서 5분 동안 400× g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 CD31(PECAM-1) 단일클론항체(390)-비오틴(1:100)과 CD45 단일클론항체(30-F11)-비오틴(1:100)의 혼합물 200μL를 넣고 잘 섞은 후 얼음에서 15분 동안 배양합니다(항-Fc 용액에 항체 희석액 준비, 표 1 참조). 400μL의 PBS-2% FBS를 추가하고 4°C에서 5분 동안 400× g 에서 원심분리합니다. 참고: CD31 및 CD45는 각각 내피 세포 및 조혈 세포의 마커입니다.</li>
	<li>상층액을 흡인하고 얼음에서 15분 동안 100μL의 항-비오틴 마이크로비드(1:5)에서 배양합니다(항-Fc 용액에서 항체 희석액을 준비, 표 1 참조). 400μL의 PBS-2% FBS를 추가하고 4°C에서 5분 동안 400× g 에서 원심분리합니다.</li>
	<li>상청액을 버리고 펠릿을 350 μL의 PBS-2% FBS에 재현탁시킨다. 사전 분리 필터(70 μm)를 사용하여 단일 세포 현탁액에서 세포 응집체 또는 큰 입자를 제거합니다. 먼저 PBS-2% FBS 100μL로 필터를 활성화하고 세포 현탁액을 필터에 통과시키고(깨끗한 튜브에 수집) 마지막으로 PBS-2% FBS 100μL로 필터를 세척합니다.</li>
	<li>자기 셀 분리기와 함께 네거티브 분리 전략을 사용하여 셀의 자기 분리를 수행합니다.<ol><li>냉각 랙의 위치 A에 샘플을 배치하고(랙이 사전 냉각되었는지 확인) 위치 B와 C에 두 개의 빈 튜브를 배치하여 레이블이 지정되지 않은 셀과 레이블이 지정된 셀을 각각 복구합니다.</li>
		<li>장비를 켜기 전에 세척 버퍼와 실행 버퍼를 해당 병에 넣으십시오. DEPLETE 프로토콜을 사용하여 셀의 자기 분리를 수행하도록 장비를 프로그래밍합니다. 참고: 이 프로토콜은 복구가 가장 높은 우선 순위인 경우 정상 항원 발현을 가진 세포(이 경우 항-CD31 및 항-CD45로 표지된 세포)를 제거하기 위한 표준 모드 의 고갈을 위한 것입니다.</li>
		<li>분리 섹션에서 분리 할 샘플 수를 선택하고 DEPLETE 프로토콜을 선택합니다. Run(실행 )을 누르고 분리를 시작합니다. 프로그램의 종료시에, 표지되지 않은 세포를 회수하고, 4°C에서 5분 동안 400 × g 에서 원심분리한다.</li>
	</ol></li>
	<li>상층액을 제거하고 펠릿을 500 μL의 성장 배지에 재현탁시킨다(표 1).</li>
	<li>이전에 2.5% 기저막 매트릭스로 코팅된 12웰 플레이트의 한 웰에 APC를 시딩합니다(약 50,000-75,000개의 세포가 얻어짐). 400 μL의 2.5% 기저막 매트릭스를 추가하여 각 웰의 전체 표면을 덮습니다. 과량의 용액을 제거하고 작은 층만 남긴 직후, 층류 후드 내부에서 플레이트를 최소 1시간 동안 건조시키십시오(뚜껑 없이). 5%CO2 분위기에서 37°C에서 인큐베이션한다. 세포가 80% 합류에 도달할 때까지 48시간마다 배지를 교체합니다.</li>
	<li>80% 합류점에서 배지를 완전히 제거하고 350μL의 PBS-2% FBS로 세척합니다. 세포를 37°C에서 2분 동안 350 μL의 0.05% 트립신-EDTA로 수확한다. 성장 배지 2mL를 추가하고 새로운 50mL 원뿔형 튜브에 세포를 모은 다음 400× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>APC를 2.5% 기저막 매트릭스로 미리 코팅된 12-웰 플레이트(웰당 10,000-20,000 세포)로 계대시킵니다. 5%CO2와 함께 37°C에서 배양한다. 세포가 80% 합류에 도달할 때까지 48시간마다 배지를 교체합니다. 알림: APC는 한 번 통과할 수 있습니다. 결과적으로 그들은 증식하고 분화하는 능력을 상실합니다. 보충 그림 S2에서 APC 격리 프로세스에 대한 워크플로를 참조하세요.</li>
</ol>2. 지방세포 분화 및 인슐린 저항성 유도
참고: 세포를 5%CO2에서 37°C로 유지하고 배지 교체 및 멸균 후드 내부의 TNF-α 및 인슐린 처리와 관련된 단계를 수행합니다.
<ol><li>80% 합류에서 분화 과정을 시작합니다. 모든 성장 배지를 흡인하고 각 웰에 3.3nM 뼈 형태 형성 단백질(BMP4)을 포함하는 분화 배지(표 1) 500μL로 교체합니다.</li>
	<li>48시간 후, 배지를 분화 배지(웰당 500μL) 및 분화 칵테일(표 1)로 교체합니다.</li>
	<li>72시간 후에 배지를 제거하고 500μL의 신선한 분화 배지에 100nM의 인슐린을 추가합니다. 참고: 세포는 내부에 작은 지질 방울이 있는 둥근 모양을 보이기 시작합니다.</li>
	<li>분화 배지를 흡인하고 48시간 후에 500μL의 단순 배지-2% FBS(표 1)로 교체합니다. 4ng/mL의 TNF-α로 인슐린 저항성을 유도합니다. TNF-α 처리가 없는 대조군 웰을 포함합니다.</li>
	<li>24시간 배양 후 단순 배지-0% FBS에 4ng/mL TNF-α를 추가합니다(표 1). TNF α 처리 없이 제어 웰을 유지합니다.</li>
	<li>24시간 후에 100 nM 인슐린을 첨가하여 인슐린 신호전달 경로를 활성화시키고, 5%CO2 분위기에서 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다. 배지를 제거하고 500 μL의 PBS로 세척합니다. 인슐린 치료없이 대조군 웰을 포함하십시오.</li>
</ol>3. 웨스턴 블롯에 의한 인슐린 신호전달 경로의 평가
<ol><li>단백질 추출 및 정량<ol><li>500 μL의 PBS로 세포의 각 웰을 세척하고, 샘플 분리 직전에 첨가된 1% 프로테아제 억제제 칵테일을 함유하는 50 μL의 RIPA 완충액(표 1)에서 세포를 용해시키기 위해 얼음 위에 보관한다. 팁으로 웰의 전체 표면을 긁어내고 용해물을 0.6mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다(얼음 위에 보관).</li>
		<li>회전식 쉐이커에서 4°C에서 1시간 동안 배양하고, 볼텍싱으로 혼합하고, 4°C에서 15분 동안 8,000× g 에서 원심분리하고 상층액을 회수합니다(얼음에 보관).</li>
		<li>Bradford 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정합니다(정량화를 위해 샘플을 희석하지 마십시오).</li>
		<li>40-60 μg에 해당하는 필요한 부피를 취하고, 550 rpm에서 진탕하면서 15분 동안 97°C에서 인큐베이션하여 6x Laemmli 완충액(표 1)으로 변성시킨다. 사용할 때까지 얼립니다.</li>
	</ol></li>
	<li>SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동<ol><li>1.5mm 두께의 7.5% 폴리아크릴아미드 겔로 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 수행합니다. 젤을 탱크에 삽입하고 실행 버퍼로 채웁니다(표 1).</li>
		<li>3 μL의 사전 염색된 단백질 표준물질을 겔의 첫 번째 웰에 첨가하고 각 샘플을 후속 웰에 로딩합니다.</li>
		<li>겔을 80V에서 약 15분 동안 실행하여 샘플이 폴리아크릴아미드 농축기 겔 매트릭스에 들어가도록 합니다. 그 후, 2.5 h 동안 또는 37 kDa 분자량 마커가 겔의 하단 가장자리에서 보일 때까지 전압을 90V로 증가시킵니다.</li>
		<li>단백질을 겔에서 니트로셀룰로스 막으로 25V에서 35분 동안 반건조 챔버로 옮기고, 젤, 멤브레인 및 필터를 전달 완충액(표 1)에 몇 분 동안 담근다.</li>
	</ol></li>
	<li>웨스턴 블롯<ol><li>이송 후, 멤브레인을 0.1% 트윈 20(TBS-T 0.1%)을 함유하는 트리스-완충 식염수(TBS)(표 1)로 30 rpm에서 진탕하면서 3분 동안 세척하였다.</li>
		<li>차단액(표 1)으로 멤브레인을 4°C에서 1시간 동안 일정한 회전으로 차단합니다.</li>
		<li>분자량 마커에 따라 멤브레인을 세 부분으로 절단하여 4°C에서 일정한 회전으로 상이한 1차 항체(블로킹 용액에 희석됨)와 함께 밤새 인큐베이션한다: Phospho-IRS1 (Tyr608) 항체 (1:1,000), 180 kDa에서 예상 밴드; Phospho-Insulin receptor β (Tyr1150/1151) 항체 (1:1,000), 예상 밴드 95 kDa; Phospho-Akt (Ser473) 항체 (1:1,000), 예상 밴드 60 kDa.</li>
		<li>멤브레인을 TBS-T 0.1%로 각각 5분 동안 5회 세척합니다.</li>
		<li>상응하는 퍼옥시다아제 결합 2차 항체(블로킹 용액에 희석됨)와 함께 실온에서 일정한 회전으로 2시간 동안 멤브레인을 배양합니다: 퍼옥시다아제 아피니퓨어 당나귀 항토끼 IgG(H+L)(1:5,000).</li>
		<li>멤브레인을 TBS-T 0.1%로 각각 5분 동안 5회 세척합니다.</li>
		<li>화학발광 검출 시스템을 사용하여 단백질을 검출합니다. 제조업체의 지침에 따라 기판을 준비하십시오.</li>
		<li>블롯을 비닐 봉지에 넣고 200μL의 화학발광 기질을 추가하여 멤브레인을 완전히 덮습니다. 여분의 기판을 배출하고 기포를 제거하십시오.</li>
		<li>각 블롯을 화학발광과 호환되는 고성능 이미징 시스템에서 30-60초 동안 노출시킵니다.</li>
		<li>멤브레인(웨스턴 블롯 섹션의 10-13단계)을 벗겨 항체-항원 상호작용을 차단하여 니트로셀룰로오스 멤브레인을 다시 블롯팅할 수 있도록 합니다. 멤브레인을 회수하고 50rpm에서 TBS-T 1%로 각각 5분 동안 3회 세척합니다.</li>
		<li>50rpm에서 0.2M NaOH 10mL로 7분 동안 배양합니다.</li>
		<li>3rpm의 수돗물로 각각 5분 동안 50번 세척합니다.</li>
		<li>50rpm에서 TBS-T 1%로 10분 동안 세척합니다.</li>
		<li>웨스턴 블롯 섹션의 2-9단계를 반복하여 1:1,000 희석을 사용하여 로딩 대조군으로 항베타 튜불린(55kDa)과 함께 멤브레인을 배양합니다.</li>
		<li>ImageJ 소프트웨어(https://imagej.nih.gov/)를 사용하여 각 단백질에 대해 밀도 분석25를 수행합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.

본 논문은 TNF-α로 처리된 배양물에서 일차 지방세포를 이용하는 인슐린 저항성을 연구하는 방법을 제공한다. 이 모델은 세포 환경 인자의 엄격한 제어와 함께 일차 지방 세포가 장기간 동안 정의된 조건 하에서 배양될 수 있다는 장점이 있다26. 분석 기간은 15-20 일이지만 분화 된 지방 세포의 비율에 변화가 실험 사이에 발생할 수 있습니다. 일차 지방세포는 배양에서 지속적으로 확장되지 않았고 세포주가 유래된 조직의 다양성을 더 밀접하게 포착하기 때문에 세포주에 비해 이점이 있다27. 또한, 1차 지방세포는 마른 대 비만, 남성 대 여성, 젊은 대 노인, 다른 지방 저장소의 세포와 같은 다양한 생리병리학적 맥락에서 기증자를 연구할 수 있습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 APC 분리 후 CRE 및 녹아웃 마우스의 세포주를 생성할 수 있다는 것입니다.
APC 분리 및 분화 중 발생할 수 있는 한 ...

인슐린은 췌장 섬 β 세포에서 생성되는 단백 동화 호르몬이며 포도당과 지질 대사의 핵심 조절자입니다. 인슐린은 많은 기능 중에서 포도당 흡수, 글리코겐 합성, 포도당 생성, 단백질 합성, 지방 생성 및 지방 분해를 조절합니다1. 인슐린과 인슐린의 수용체(IR) 상호작용 후의 초기 분자 신호는IR2의 내인성 티로신 단백질 키나아제 활성의 활성화이며, 그 결과 자가인산화3 및 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrates, IRS)로 알려진 단백질 계열의 활성화가 일어나며, 이는 어댑터 단백질에 결합하여 단백질 키나아제4의 캐스케이드를 활성화시킨다 . 인슐린은 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K)-단백질 키나아제 B(AKT)와 라스-미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK)의 두 가지 주요 신호 전달 경로를 활성화합니다. 전자는 연료 항상성의 조절을 포함하여 다양한 생리적 기능에 관여하는 수많은 다운스트림 이펙터의 활성화를 위한 주요 분기점 또는 노드(4,5)를 구성하는 반면, 후자는 세포 성장 및 분화를 조절합니다(4,6). 인슐린 작용은 궁극적으로 세포 유형과 생리학적 맥락에 따라 달라진다7.
주요 인슐린 반응성 대사 조직 중 하나는 지방 조직입니다. 백색 지방 조직은 인간과 설치류에서 가장 풍부한 지방 유형으로, 피하 지방 (피부와 근육 사이)과 내장 지방 (복강 내 장기 주변)에 분포합니다. 부피가 크면 지방 세포 또는 지방 세포는 지방 조직에서 가장 풍부한 세포 유형입니다. 이 지방 세포는 갈색/베이지색(열성), 분홍색(유선) 및 흰색 8,9일 수 있습니다. 백색 지방 세포는 인슐린 의존 과정 인 트리글리세리드의 형태로 신체의 주요 에너지 매장량을 유지합니다. 인슐린은 포도당 수송과 지방 생성을 촉진하는 반면, 지방 분해 또는 지질 분해를 억제한다 7,10. 또한 지방전구세포가 지방세포(성숙한 지방을 저장하는 세포)로 분화하는 것을 촉진한다11.
인슐린 저항성은 정상적인 인슐린 수치가 약독화된 생물학적 반응을 일으켜 보상성 고인슐린혈증을 유발할 때 발생한다12. 인슐린 저항성은 과체중 및 비만과 관련된 질환으로5, 인슐린 저항성이 복합적으로 발생하면 제2형 당뇨병(T2D) 및 기타 대사 질환을 유발한다13. 고인슐린혈증은 말초 조직의 인슐린 저항성을 보상하여 정상적인 혈당 수치를 유지한다14. 그러나 인슐린 저항성 악화와 함께 궁극적인 β세포 손실 또는 고갈은 T2D와 일치하는 혈당 수치 상승으로 이어집니다5. 따라서 인슐린 저항성과 고인슐린혈증은 비만 유래 대사 질환의 발병에 기여할 수 있다15. 또한, 비만은 지방 조직에서 인슐린 저항성을 촉진하는 만성 저등급 국소 염증을 유발할 수 있다15,16,17. 또한, 섬유증, 염증, 혈관신생 및 지방생성 감소와 같은 지방 조직의 비만 유래 변화는 아디포넥틴 혈청 수치(인슐린 감작제)를 낮추고 플라스미노겐 활성제 억제제 1(PAI-1), 유리 지방산 및 엑소좀과 같은 인자의 혈류로의 분비를 증가시켜 인슐린 저항성을 악화시킵니다17.
인슐린 저항성의 기저에 있는 많은 측면은 아직 알려지지 않았습니다. 시험관 내 및 생체 내 모델은 지방 조직을 포함한 주요 표적 조직에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘을 연구하기 위해 개발되었습니다. 시험관 내 모델의 장점은 연구자가 환경 조건을 더 잘 제어할 수 있고 특정 세포 유형에서 인슐린 저항성을 평가할 수 있다는 것입니다. 특히, 지방세포 전구체 세포(APC)는 기증자 조직의 개별 표현형을 가지고 있으며, 이는 지방세포 세포주보다 생리학을 더 잘 반영할 수 있습니다. 시험관 내에서 인슐린 저항성을 유도하는 주요 인자는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)입니다. TNF-α는 지방 조직18에서 지방세포와 대식세포에 의해 분비되는 전염증성 사이토카인이다. 적절한 지방조직 리모델링 및 확장에 필요하지만19, TNF-α에 장기간 노출되면 생체 내 지방 조직과 시험관 내 지방 세포에서 인슐린 저항성이 유발된다 20. 여러 세포 유형의 만성 TNF-α 처리는 IR 및 IRS-1 모두의 세린 인산화를 증가시켜 티로신 인산화 감소를 촉진한다21. 세린 잔기 상의 IRS-1의 증가된 인산화는 IR 티로신 키나아제 활성을 억제하며, 만성 TNF-α 치료가 인슐린 작용을 손상시키는 주요 기전 중 하나일 수 있다22,23. TNF-α는 핵 인자 ĸB 키나제 β(IKKβ) 및 c-Jun N 말단 키나아제(JNK)의 세린/트레오닌 키나제 억제제와 관련된 경로를 활성화합니다.24. JNK는 복잡한 전염증성 전사 프로그램을 유도할 뿐만 아니라 IRS-1을 직접 인산화하기도합니다 6.
인슐린 저항성의 병인을 이해하는 것은 T2D에 대한 미래 치료법의 개발을 안내하는 데 점점 더 중요해지고 있습니다. APC는 인슐린에 대한 민감성과 저항성을 포함한 지방 세포 생물학 연구와 전신 환경과 무관한 지방 세포의 고유 특성을 식별하는 데 탁월한 모델임이 입증되었습니다. APC는 다른 지방 저장소에서 쉽게 얻을 수 있으며 적절한 조건에서 성숙한 지방 세포로 분화됩니다. 이 방법을 사용하면 지방 세포에서 인슐린 저항성/민감도에 대한 직접적인 영향을 평가할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td><강한>1. 분리 마우스 지방 세포 전구체 세포</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액&nbsp;</td><td>LONZA</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>안티-비오틴 마이크로비즈&nbsp;</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>AutoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>기저막 매트릭스(마트리겔)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>성장 인자</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Equitech-Bio, Inc.</td><td>BAC63-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD45 단클론 항체 (30-F11) - 비오틴&nbsp;</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐 분해 효소, 유형 1</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 저당</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>성장 인자</td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ITS 믹스</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>L-아스코르브산 2-인산</td>염 <td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>성장 인자</td></tr><tr><td>Linoleic acid-albumin</td><td>Sigma</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 201 medium</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-2</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-18</td><td>성장 인자</td></tr><tr><td>Peniciline-Streptomycine</td><td>BioWest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>사전 분리 필터 (70 &micro; m)</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>정제된 쥐 안티-마우스 CD16 / CD32&nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>트립신-EDTA&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td><강한>2. 지방세포 분화 및 인슐린 저항성 유도</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>분화 칵테일</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td>분화 칵테일</td></tr><tr><td>덱사메타손</td><td>시그마</td><td>D1756</td><td>분화 칵테일</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>시그마</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>로시글리타존</td><td>케이맨</td><td>71742</td><td>분화 칵테일</td></tr><tr><td>TNF&알파;</td><td>R& D 시스템</td><td>210-TA-005&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><강한>3. 웨스턴 블롯</스트롱></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>안티 베타 튜불린 항체</td>에 의한 인슐린 신호 전달 경로 평가 <td>Abcam</td><td>ab6046</td><td></td></tr><tr><td>브로모페놀 블루</td><td>BioRad</td><td>161-0404</td><td>Laemmli 완충액</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>RIPA 완충액</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>RIPA 완충액</td></tr><tr><td>FluorChem E 시스템</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Laemmli 완충액</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td>Running and Transfer buffer</td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>RIPA buffer</td></tr><tr><td>2-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Laemmli buffer</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>JT Baker</td><td>907007</td><td>Transfer buffer</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td>TBS-T</td></tr><tr><td>NaF</td><td>시그마</td><td>77F-0379</td><td>RIPA 버퍼</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>3722-19</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7</td><td>Sigma</td><td>114F-0762</td><td>RIPA 버퍼</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>RIPA 버퍼</td></tr><tr><td>니트로셀룰로오스 막&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>무지방 분유</td><td>BioRad</td><td>1706404</td><td>차단 용액</td></tr><tr><td>사전 염색 단백질 표준&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610395</td><td></td></tr><tr><td>프로테아제 억제제 칵테일&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P8340-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniPure 당나귀 안티-래빗 IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-132</td><td></td></tr><tr><td>포스포- 인슐린 수용체 및 베타; &nbsp;</td><td>세포 신호</td><td>3024</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Akt (Ser473) 항체</td><td>세포 신호</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-IRS1 (Tyr608) 항체</td><td>Millipore</td><td>9432</td><td></td></tr><tr><td>당류&nbsp;</td><td>JT Baker</td><td>407205</td><td>RIPA 완충액</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610302</td><td>Running 및 laemmli 완충기</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Chemiluminescent Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>Running, Transfer and laemmli buffer</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>JT Baker</td><td>4103-02</td><td>RIPA buffer - TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>시그마</td><td>P1379</td><td>TBS-T</td></tr></tbody></table>

1차 배양에서 분화된 마우스 지방세포: 인슐린 저항성 모델

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

인슐린 저항성은 표적 세포에 대한 인슐린의 감소된 효과로, 일반적으로 인슐린 수용체 신호 전달 감소에서 파생됩니다. 인슐린 저항성은 전 세계적으로 유병률이 높은 제2형 당뇨병(T2D) 및 기타 비만 유래 질병의 발병에 기여합니다. 따라서 인슐린 저항성의 기본 메커니즘을 이해하는 것은 매우 중요합니다. 생체 내 및 시험관 내에서 인슐린 저항성을 연구하기 위해 여러 모델이 사용되었습니다. 일차 지방 세포는 인슐린 저항성의 메커니즘을 연구하고 이 상태에 대항하는 분자와 인슐린 감작 약물의 분자 표적을 식별하는 매력적인 옵션을 나타냅니다. 여기에서 우리는 종양 괴사 인자-α(TNF-α)로 처리된 배양에서 일차 지방 세포를 사용하여 인슐린 저항성 모델을 확립했습니다.
자성 세포 분리 기술에 의해 콜라게나제로 분해된 마우스 피하 지방 조직에서 분리된 지방 세포 전구 세포(APC)는 1차 지방 세포로 분화됩니다. 인슐린 저항성은 인슐린 신호 전달 캐스케이드 구성원의 티로신 인산화/활성화를 감소시키는 전염증성 사이토카인인 TNF-α로 처리하여 유도됩니다. 인슐린 수용체 (IR), 인슐린 수용체 기질 (IRS-1) 및 단백질 키나아제 B (AKT)의 감소된 인산화는 웨스턴 블롯에 의해 정량화된다. 이 방법은 지방 조직에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘을 연구하는 훌륭한 도구를 제공합니다.

지난 몇 년 동안 비만과 T2D의 유병률이 증가함에 따라 지방 조직에서 인슐린 저항성을 매개하는 메커니즘에 대한 집중적인 연구가 촉발되었습니다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여 APC를 성숙한 지방 세포로 분화하여 인슐린 저항성과 민감도를 평가할 수 있습니다. APC가 합류점에 도달하면 성숙한 지방세포로의 분화와 TNF α 매개 인슐린 저항성 유도를 완료하는 데 10일이 걸립니다(그림 1).
APC는 평평하고 길쭉한 모양과 파종 후 48시간 후에 완료된 플레이트에 대한 접착을 특징으로 하는 섬유아세포와 유사한 형태를 보여줍니다(그림 2A). APC는 80% 합류에 도달하는 데 2-5일이 걸리며(시드된 세포 수에 따라 다름), 분화 칵테일에 노출되어 분화 과정이 시작됩니다(그림 2A). 성숙한 지방 세포는 다음 6-8 일...

이 프로토콜은 피하 지방에서 마우스 지방전구세포의 분리, 성숙한 지방세포로의 분화 및 인슐린 저항성 유도를 설명합니다. 인슐린 작용은 웨스턴 블롯을 통한 인슐린 신호 전달 경로 구성원의 인산화/활성화에 의해 평가됩니다. 이 방법을 사용하면 원발성 지방세포에서 인슐린 저항성/민감도를 직접 측정할 수 있습니다.

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

인슐린 저항성은 원발성 지방 세포에서 평가할 수 있으며, 이를 통해 제지방 대 비만과 같은 다양한 생리병리학적 맥락에서 기증자 또는 다른 지방 침착의 세포를 연구할 수 있습니다. 일차 지방세포는 많은 고유 특성을 유지하며 세포 환경 요인을 엄격하게 제어하면서 정의된 조건에서 장기간 배양할 수 있습니다. 분화 과정을 시작하려면 세포가 80%합류해야 합니다.분화가 더 낮거나 더 높은 합류점에서 시작되면 세포는 덜 분화하거나 분화 능력을 잃게 됩니다. 동물을 희생 한 후 70 % 에탄올로 문질러 생쥐를 소독하십시오. 각 마우스에서 사타구니 피하 지방 조직을 해부하고 얼음 위에 15 밀리리터의 1 형 콜라게나제 용액이 들어있는 15 밀리리터의 원추형 튜브에 수집합니다.멸균 수술용 가위로 지방 조직을 작은 조각으로 절단하고 섭씨 37도의 오비탈 셰이커에서 150RPM의 1형 콜라게나제 용액으로 30분 동안 배양하여 샘플을 분해합니다. 10분마다 소화가 작동하는지 확인하고 소화가 과도하지 않도록 확인하십시오. 200마이크로미터 메쉬 주사기를 사용하여 여과하여 콜라게나제로 분해되지 않은 조직을 제거하고 필터를 튜브 가장자리에 통과시켜 가능한 한 많은 세포를 용액으로 배출합니다.소화를 멈추기 위해 차가운 DMEM 1% BSA 15밀리리터를 추가하고 섭씨 4도에서 10분 동안 400G에서 원심분리합니다. 성숙한 지방 세포와 대부분의 액체 층을 포함하는 최상층을 흡인합니다. 차가운 PBS 20%FBS 2밀리리터를 추가하고 펠릿을 다시 현탁합니다.다시 5분 동안 원심분리한 후, 상층을 흡인하여 상층액을 제거하여 잔류 지방세포와 지방을 제거한다. 펠릿을 1밀리리터의 ACK 용해 완충액에 재현탁합니다. 얼음 위에서 5 분 동안 배양하십시오.PBS 2%FBS 10밀리리터를 넣고 섞는다. 5분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인한 후, 펠릿을 200 마이크로리터의 항-FC 용액에 재현탁시킨다. 5분 동안 얼음 위에서 배양하고 세포 현탁액을 자기 세포 분리기의 사전 냉각 랙에 맞는 5밀리리터 튜브로 옮깁니다.5 분 동안 원심 분리하고 상청액을 제거한 후, CD 31 단일 클론 항체 비오틴과 CD 45 단일 클론 항체 비오틴의 혼합물 200 마이크로 리터를 첨가한다. 잘 섞고 얼음에서 15 분 동안 배양하십시오. 그런 다음 400 마이크로 리터의 PBS 2 % FBS를 넣고 섭씨 4도에서 5 분 동안 400G에서 다시 원심 분리합니다.상층액을 흡인하고 얼음 위에서 15분 동안 100마이크로리터의 항비오틴 마이크로비드에서 배양합니다. 400마이크로리터의 PBS 2%FBS를 추가하고 이전에 표시된 대로 섭씨 4도에서 5분 동안 400G에서 다시 원심분리합니다. 상청액을 버린 후, 펠릿을 350 마이크로리터의 PBS 2%FBS에 재현탁시킨다.70마이크로미터 사전 분리 필터로 단일 세포 현탁액에서 세포 응집체 또는 큰 입자를 제거하려면 100마이크로리터의 PBS 2%FBS로 필터를 활성화합니다. 필터를 통해 세포 현탁액을 통과시키고 깨끗한 튜브에 모으십시오. 그런 다음 100마이크로리터의 PBS 2%FBS로 필터를 세척합니다.네거티브 분리 전략을 사용하여 셀의 자기 분리를 수행하려면 샘플을 냉각 랙의 위치 A에 배치하고 위치 B와 C에 두 개의 빈 튜브를 배치하여 라벨링되지 않은 및 라벨링된 셀을 회수합니다. 그런 다음 세척 버퍼와 실행 버퍼를 해당 병에 넣습니다. 분리 섹션에서 분리할 샘플 수를 선택하고 고갈 프로토콜을 선택합니다.실행을 누르고 분리를 시작합니다. 프로그램이 끝나면 레이블이 지정되지 않은 셀을 복구합니다. 다음으로, 각 웰의 전체 표면을 덮기 위해 400 마이크로리터의 2.5% 기저막 매트릭스를 첨가하여 12-웰 플레이트를 기저막 매트릭스로 코팅한다.과잉 용액을 제거하고 플레이트를 층류 후드 내부에서 최소 1시간 동안 건조시킵니다. 5분 동안 원심분리하고 상청액을 버린 후, 펠릿을 500 마이크로리터의 성장 배지에 재현탁시킨다. 이전에 2.5% 기저막 매트릭스로 코팅된 12웰 플레이트의 한 웰에 지방 세포 전구체 세포(APC)를 시드합니다.섭씨 37도에서 5 % 이산화탄소 대기에서 배양하고 세포가 80 % 합류에 도달 할 때까지 48 시간마다 배지를 교체합니다. 배지를 완전히 제거한 후, 세포를 350 마이크로리터의 PBS 2%FBS로 세척한다. 섭씨 37도에서 2 분 동안 350 마이크로 리터의 0.05 % 트립 신 EDTA로 세포를 수확하고 2 밀리리터의 성장 배지를 첨가한다.새로운 50밀리리터 원뿔형 튜브에 세포를 수집하고 400G에서 5분 동안 원심분리합니다. APC를 이전에 2.5% 기저막 매트릭스로 코팅된 12웰 플레이트에 통과시키고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양합니다. 세포가 80% 합류에 도달할 때까지 48시간마다 배지를 교체하십시오.80% 합류에서 성장 배지를 흡인하고 각 웰에 3.3나노몰 뼈 형태 형성 단백질을 포함하는 500마이크로리터의 분화 배지로 교체합니다. 48시간 후, 배지를 분화 배지 및 분화 칵테일 웰 당 500 마이크로리터로 교체한다. 72시간 후에 배지를 제거하고, 500 마이크로리터의 신선한 분화 배지에 100 나노몰의 인슐린을 첨가한다.48시간 후, 종양 괴사 인자 알파 또는 TNF 알파 밀리리터당 4나노그램으로 인슐린 저항성을 유도합니다. 분화 배지를 흡인하고 TNF 알파가 있는 500마이크로리터의 단순 배지 2%FBS로 교체합니다. 24시간 동안 배양한 후 단순 배지 0%FBS에 TNF 알파 밀리리터당 4나노그램을 추가합니다.24시간 후 100나노몰 인슐린을 첨가하여 인슐린 신호전달 경로를 활성화하고 앞서 설명한 바와 같이 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 분위기에서 15분 동안 배양합니다. 인큐베이션 후, 배지를 제거하고, 500 마이크로리터의 PBS로 세척하고, 인슐린 처리 없이 대조군 웰을 포함시켰다. 단백질을 추출하고 인슐린 신호전달 마커의 인산화를 웨스턴 블랏으로 측정하였다.12-웰 배양 플레이트에서 분화를 유도하기 전 80% 합류 지점의 피하 지방세포 전구세포와 분화 유도 7일 후의 일차 지방세포를 본 그림에 나타내었다. 피하 원발성 지방세포에서 TNF 알파에 의해 유도된 인슐린 저항성은 인슐린 수용체, 인슐린 수용체 기질 1 및 단백질 키나아제 B 또는 AKT의 인슐린 유도 인산화 감소에 의해 입증되었다. 멤브레인은 항-인산화 인슐린 수용체, 항-인산화 인슐린 수용체 기질, 항-인산화 AKT, 및 항-베타 튜불린을 로딩 대조군으로 사용하여 프로브하였다.신호는 화학발광 검출로 시각화되었습니다. 대표적인 블롯 및 3개의 독립적인 실험으로부터의 정량화가 여기에 도시되어 있다. 이 절차를 시도할 때 주의해야 할 한 가지는 TNF 알파를 사용한 인슐린 저항성 유도가 24시간 동안 2% FBS로, 마지막 24시간 동안 0% FBS로 유도된다는 것입니다.

differentiated-mouse-adipocytes-primary-culture-model-insulin

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 비디오는 골수 기질 세포(BMSC)가 지방 세포로 분화되는 과정을 보여줍니다. 2단계 과정에서, 특정 성장 인자와 호르몬이 존재할 때, 미분화된 BMSC는 먼저 지방세포로 분화합니다. 포도당과 인슐린 치료와 관련된 두 번째 단계는 여러 지질 방울을 가진 성숙한 지방 세포의 형성으로 이어집니다.

In vitro Mouse Bone Marrow Stromal Cell Differentiation into Adipocytes(체외 마우스 골수 기질 세포에서 Adipocytes로의 분화)

마우스의 흰색 지방 조직으로부터 격리 기본 흰색 preadipocytes는 베이지 색 / brite 세포로 구분 할 수 있습니다. 여기에 제시된 것은 백색 지방의 "브라우닝"의 분자 규정을 연구 할 수있는 신뢰할 수있는 셀룰러 모델 시스템입니다.

베이지 / Brite 셀에 Stromal 혈관 세포의 분리와 차별화

막 성숙한 지방세포 골재 배양(MAAC)은 성숙한 인간 지방세포배양하는 새로운 방법이다. 여기서 우리는 인간의 지방에서 지방세포를 분리하는 방법과 MAAC를 설정하는 방법을 자세히 설명합니다.

인간 성숙한 지방세포의 고립과 문화는 막 성숙한 지방 세포 골재 배양 (MAAC)를 사용하여

여기에 제시된 것은 단백질과 마이크로 RNA 발현을 조절하기 위해 성숙한 아디포사이클로 작은 간섭 RNA(siRNA), 마이크로 RNA 모방(miRs), 또는 항마이크로RNA(anti-miR)와 같은 올리고뉴클레오티드를 전달하는 프로토콜이다.

아디포세포 기능에 대한 단백질 및 마이크로 RNA 변조의 영향을 연구하는 세포 배양 모델

이 보고서는 신생아 마우스에서 1 차적인 갈색 및 백색 프레드포스세포의 동시 적인 격리를 위한 프로토콜을 기술합니다. 분리된 세포는 배양에서 재배되고 완전히 성숙한 백색과 갈색 지방세포로 분화하도록 유도될 수 있다. 이 방법은 배양시 1차 지방세포의 유전적, 분자 및 기능적 특성화를 가능하게 한다.

신생아 마우스에서 기본 백색및 갈색 프레드포스세포의 격리 및 분화

지방세포는 갓 태어난 마우스의 견갑골 간 갈색 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 분리하여 지질 방울을 축적하고 분자 마커를 발현하며 성숙한 갈색 지방세포의 미토콘드리아 형태를 보여주는 세포로 분화합니다. 이러한 세포는 면역 형광 및 투과 전자 현미경으로 추가로 분석됩니다.

Differentiation and Imaging of brown adipocytes from the Stromal Vascular Fraction of Interscapular Adipose Tissue from Newborn Mice(신생아 마우스의 견갑간 지방 조직의 기질 혈관 분획에서 갈색 지방세포의 분화 및 이미징)

이 프로토콜은 지방전구세포를 얻고 시험관 내에서 지방세포 분화를 달성하기 위해 쥐 지방 조직에서 기질 혈관 분획(SVF)의 반자동 분리를 설명합니다. 콜라게나제 분해를 위해 조직 해리제를 사용하면 실험 변동이 줄어들고 재현성이 높아집니다.

조직 해리기를 사용하여 쥐 백색 지방 조직에서 기질 혈관 분획의 반자동 분리

성숙한 지방세포의 크기와 취약성으로 인해 연구 및 분리에 사용할 수 있는 기술과 도구가 제한되어 있습니다. 여기에서는 성숙한 쥐 지방세포의 분리를 위한 프로토콜이 설명되어 있으며, 이는 다양한 지방세포 및 마우스 사료에 쉽게 적용할 수 있습니다.

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

이 절차 또는 나선 limbus 및 나선 신경절의 뉴런없이 Corti의 murine 기관의 격리와 문화에 대한 방법을 설명합니다. 우리는 또한 electroporation에 의해 Corti explant의 기관에서 외인성 리포터 유전자의 표현 방법을 보여줍니다.

차 문화와 Corti의 Murine 오르간의 플라스미드 Electroporation.

난소암의 Orthotopic 동물 모델은 더 나은 인간의 질병을 복제하기 때문에 암 진행 및 치료 종양 반응의 우리의 이해를 향상시킬 수 있습니다. 마우스 모델 루시페라제 - 표현 난소 종양 세포의 intrabursal 주사를 받게됩니다. 치료는 경구 gavage를 통해 관리합니다. 종양 성장에 의해...

생체내 이미징 및 난소암의 Orthotopic 마우스 모델에서 치료 트리 트먼트

배우세요 마우스 1차 지방세포 분화 및 인슐린 저항성 유도 방법을. 서커타니어스 지방조직에서 전지방세포를 분리하고 TNF-α로 인슐린 저항성을 유도하여 웨스턴 블롯으로 신호전달 경로를 분석하는 실험 기법을 익힙니다.

1차 배양에서 분화된 마우스 지방세포: 인슐린 저항성 모델

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